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SYBRGREENⅠ实时荧光PCR在染色体常见非整倍体诊断中的应用刘丽娟1,熊丽2,刘洁2,邓康2,刘思平2,吴瑞枫2,贾蓓2,宋兰林2,钟梅2,曾嵘1(南方医科大学1基础医学实验教学中心,2南方医院妇产科,广东广州510515)摘要目的探讨SYBRGREENⅠ实时荧光PCR技术用于非整倍体诊断的可行性。方法选择13号染色体上的ABCC4基因、18号染色体上的TYMS基因、21号染色体上的DSCR3基因、X染色体上的HPRT2基因和Y染色体上的SRY基因为目的基因,以12号染色体上的管家基因GAPDH为参照基因,选取SYBRGREENⅠ作为荧光染料,采用双标准曲线相对定量PCR法进行检测,并与核型分析结果进行比对。结果检测13号染色体时,计算目的基因与参照基因比值,正常标本组(090031)与三体标本组(139012)的差别有显著意义(P0003);检测18号染色体时,正常标本组(107044)与三体标本组(166012)的差别有显著意义(P0000);检测21号染色体时,正常标本组(084027)与三体标本组(173054)的差别有显著意义(P0000);检测X染色体时,45,X组(062012)与46,XY组(063025)比值无差别(P0965),46,XX组(132037)与47,XXY组(120035)比值无差别(P0326),单个拷贝X(包括45,X、46,XY)063023与两个拷贝X(46,XX、47,XXY)126036比值差别有统计学意义(P0000);检测Y染色体时,正常女性(46,XX)无目的基因扩增,正常男性组(46,XY)(157054)与三体标本组(47,XYY)(308015)比值差别有统计学意义(P0003)。结论SYBRGREENⅠ实时荧光定量技术可用于快速诊断染色体非整倍体。关键词非整倍体;实时荧光PCR;SYBRGREENⅠ中图分类号R71421文献标识码A文章编号16734254(2010)01001105CLINICALAPPLICATIONOFSYBRGREENIREALTIMEFLUORESCENCEQUANTITATIVEPCRFORDIAGNOSISOFCOMMONCHROMOSOMEANEUPLOIDYLIULIJUAN1,XIONGLI2,LIUJIE2,DENGKANG2,LIUSIPING2,WURUIFENG2,JIABEI2,SONGLANLIN2,ZHONGMEI2,ZENGRONG1BASICMEDICALEXPERIMENTTEACHINGCENTER,SCHOOLOFBASICMEDICALSCIENCES1,DEPARTMENTOFGYNECOLOGYANDOBSTETRICS,NANFANGHOSPITAL2,SOUTHERNMEDICALUNIVERSITY,GUANGZHOU510515,CHINAABSTRACTOBJECTIVETOINVESTIGATETHEVALUEOFREALTIMEFLUORESCENCEQUANTITATIVEPCRINTHEDIAGNOSISOFCHROMOSOMEANEPUPLOIDYMETHODSABCC4GENEONCHROMOSOME13,TYMSGENEONCHROMOSOME18,DSCR3GENEONCHROMOSOME21,HPRT2GENEONCHROMOSOMEX,ANDSRYGENEONYCHROMOSOMEWEREUSEDASTHETARGETGENES,WITHGAPDHGENEONCHROMOSOME12ASTHECONTROLGENEUSINGDOUBLESTANDARDCURVEFLUORESCENTRELATIVEQUANTITATIVEPCRMETHODWITHSYBRGREENASTHEFLUORESCENTDYE,THEGENEEXPRESSIONLEVELSWEREDETECTEDANDTHERESULTSWERECOMPAREDWITHTHOSEOFKARYOTYPEANALYSISRESULTSTHERATIOOFTHETARGETGENEONCHROMOSOME13TOTHECONTROLGENESHOWEDASIGNIFICANTDIFFERENCEBETWEENTHENORMALKARYOTYPEGROUP090031ANDTRISOMEGROUP139012,P0003,ANDTHEGENESONCHROMOSOME18107044VS166012,P0000ANDCHROMOSOME21084027VS173054,P0000SHOWEDSIMILARRESULTSTHEEXPRESSIONOFTHEGENESONTHEXCHROMOSOMESHOWEDNOSIGNIFICANTDIFFERENCEBETWEEN45,XGROUPAND46,XYGROUP062012VS063025,P0965,NORBETWEEN46,XXGROUPAND47,XXYGROUP132037VS120035,P0326,WHILEASIGNIFICANTDIFFERENCEWASNOTEDBETWEENTHESINGLECOPYXINCLUDING45,XAND46,XYANDTWOCOPIESX46,XXAND47,XXY063023VS126036,P0000THEEXPRESSIONOFTHETARGETGENEONTHEYCHROMOSOMEWASNOTDETECTEDINNORMALFEMALES46,XX,ANDASIGNIFICANTDIFFERENCEINTHEEXPRESSIONWASFOUNDBETWEENNORMALMALEGROUP46,XYAND47,XYYGROUP157054VS308015,P0003CONCLUSIONSYBRGREENIREALTIMEFLUORESCENCEQUANTITATIVEPCRCANBEUSEDFORTHEPURPOSEOFRAPIDDIAGNOSISOFCHROMOSOMEANEUPLOIDYKEYWORDSCHROMOSOMEANEUPLOIDY;POLYMERASECHAINREACTION,REALTIMEFLUORESCENCE;SYBRGREENI染色体非整倍体指细胞中染色体的数目不是该物种正常精子或卵子中染色体数目的整数倍,是不孕不育、自然流产及先天出生缺陷的常见原因[1]。目前诊断染色体数目异常的常规方法为细胞培养后进行染色体核型分析,但此法所需时间较长,操作烦琐。因此,很有必要建立快速,简便的非整倍体诊断方法应用于临床。本文针对常见的非整倍体异常,即13,18,21,X,收稿日期20091017基金项目广东省科技攻关项目(2009B030801228);南方医科大学南方医院新业务新技术课题(2007030)作者简介刘丽娟(1983),女,在读硕士研究生,研究方向自然流产的遗传因素研究,电话02061641549,EMAILLIULIJUAN1983163COM通讯作者曾嵘1969,女,博士,副教授,硕士研究生导师,研究方向遗传病的基础与临床研究,电话02062789104,EMAILZENGRONGZRTOMCOM2010;301南方医科大学学报JSOUTHMEDUNIV11CHROMOSOMEGENENAMEPRIMERSEQUENCE(53)131821XYCONTROLGENE表1扩增目的基因及内参基因所用引物TAB1PRIMERSFORAMPLIFYINGTHETARGETGENESANDCONTROLGENEABCC4TYMSDSCR3HPRT2SRYGAPDHFPGCAAAACCCATGGAGGTAGGAGTCTARPGCTTCCTTAATGCCCACTTTACTGFPGCGGGAGTCTAGGCTTTCTGGARPACACCTGGCTGCTTTGAGTTTTGAAFPTAGCAAGTCAGAGGTTTCCTTRPAACATTGACTGTGGCTCTTGCFPGAGGGCCAGATGATATAGATTCCARPTACCTTGCGACCTTGACCATCTTFPCATCGTGTGGTCTCGCGATCARPGTGGCCTAGCTGGTGCTCCATTCFPCTGTCCAGTTAATTTCTGACCRPCTTTGTACATGGTATTCACCACY染色体数目异常建立SYBRGREENⅠ实时荧光PCR方法,以探讨用此种方法检测染色体数目异常的可行性。1材料和方法11研究对象2007年12月至2009年6月在南方医院产前诊断与遗传病诊断技术中心收集到的染色体核型分析结果为非整倍体的标本54例,其中13三体标本4例(1例为脐血标本、2例为自然流产绒毛标本、1例为羊水标本),18三体标本4例(1例为患者外周血标本,1例为脐血标本,1例为羊水标本,1例为自然流产绒毛标本),21三体标本22例(15例为外周血标本,7例为脐血标本),45,X标本3例(1例为患者外周血标本,2例为自然流产绒毛标本),47,XXY标本19例患者外周血,47,XYY标本2例患者外周血;并同时收集34例外周血标本作为正常对照,其中46,XX18例,46,XY16例。12方法121DNA提取外周血、脐血及羊水、绒毛组织应用通用基因组DNA提取试剂盒(达晖生物),按照说明书提取基因组DNA。122引物的制备分别选择位于13号染色体上的ABCC4基因,18染色体上的TYMS基因,21号染色体上的DSCR3基因,X染色体上的HPRT2基因,Y染色体上的SRY基因为目的基因,选取12号染色体上的管家基因GAPDH为参照基因设计引物,由上海英骏生物技术公司进行引物合成,引物序列见表1。123标准曲线构建取核型分析结果为46,XX的正常女性外周血,提取基因组DNA,五倍稀释四个梯度作为标准品构建13,18,21及X染色体目的基因及相应GAPDH内参基因的标准曲线;取核型分析结果为46,XY的正常男性外周血,提取基因组DNA,五倍稀释四个梯度作为标准品构建Y染色体目的基因及相应GAPDH内参基因的标准曲线。124荧光定量PCR扩增荧光定量PCR采用MX3000P型PCR仪STRATEGENE公司。反应在96孔板上进行。反应体系为25ΜL,含模板DNA2ΜL(约20NG),上下游引物(10PMOL/ΜL)各08ΜL,DNTP10MMOL/L10ΜL,10缓冲液25ΜL,TAQ酶(2U/ΜL)05ΜL,SYBRGREENⅠ(20)05ΜL,加灭菌水至25ΜL。循环参数为95℃预变性30S,然后95℃变性5S,60℃退火30S,72℃延伸5S,共40个循环,95℃1MIN,55℃30S,95℃30S。MXPROMX3005P软件自动计算出CT值。每个基因做2管重复,每块板均带标准曲线并设定空白对照。设定熔解曲线。125结果分析通过分别对目的基因、内参基因做标准曲线的方法求定量结果。通过标准曲线可以得到与此标本CT值对应的模板中目的基因或参照基因的拷贝数,以目的基因的定量结果除以内参基因的定量结果进行校正,得到最终的定量结果。统计学分析采用SPSS130软件包进行数据处理,数据描述采用均数标准差(XS)及95可信区间(95CI),各组数据两两比较采用两样本T检验方法进行统计学分析。P001为有统计学意义。2结果21标准曲线及熔解曲线分析标准品及样本2个复孔CT值接近,说明重复性良好。MXPROMX3005P软件自动生成扩增曲线、标准曲线及熔解曲线,各目的基因及内参基因标准曲线相关系数均在0985以上,扩增效率在90110之间,目的基因与内参基因扩增效率基本一致。分析熔解曲线,ABCC4基因、TYMS基因、DSCR3基因、HPRT2基因、SRY基因及GAPDH基因产物熔解温度均一,峰的形状也较锐利,产物特异性高,无非特异性扩增或引物二聚体。图1为目的基因ABCC4与内参基因GAPDH的扩增曲线、标准曲线及熔解曲线。SRY基因在扩增46,XY与47,XYY标本时,熔解温度均一(8735℃左右),峰形锐利;但在扩增46,XX标本与空白对照时,熔解温度较低(8278℃左右),且峰形宽矮,为引物二聚体,非目的基因扩增产物。如图2。22荧光定量PCR结果分析22113、18、21号染色体荧光定量PCR检测结果南方医科大学学报JSOUTHMEDUNIV第30卷12KARYOTYPEMEANSD95CICHROMOSOMEX45,X46,XY46,XX47,XXYSINGLECOPYXTWOCOPYX表2X染色体荧光定量PCR检测结果TAB2RESULTSOFQUANTITATIVEPCRFORDETECTINGCHROMOSOMEXAP096545,XGROUPVS46,XYGROUP;BP032646,XXGROUPVS47,XXYGROUP;CP0000SINGLECOPYXGROUPVSTWOCOPYXGROUP032092049076113151103137051074114138062012063025A132037120035B063023126036CKARYOTYPEMEANSD95CICHROMOSOMEY46,XX46,XY15705412219147,XYY308015AAP0003VS46,XYGROUP表3Y染色体荧光定量PCR检测结果TAB3RESULTSOFQUANTITATIVEPCRFORDETECTINGCHROMOSOMEYAP0003VSNORMALGROUP;BP0003VSNORMALGROUP;CP0000VSNORMALGROUPNORMALGROUPTRISOMYGROUPMEANSD95CIMEANSD95CI13090031079101139012A10816918107044092123166012B13619621084027073094173054C149197表113、18、21号染色体荧光定量PCR检测结果TAB1RESULTSOFQUANTITATIVEPCRFORDETECTINGCHROMOSOMES13,18,AND21图2目的基因与引物二聚体的熔解曲线FIG2MELTINGCURVEOFTARGETGENEANDPRIMERDIMER图1ABCC4基因和GAPDH基因扩增曲线、标准曲线及熔解曲线FIG1AMPLIFICATIONCURVE,STANDARDCURVEANDMELTINGCURVEOFABCC4GENEANDGAPDHGENEAAMPLIFICATIONCURVE,STANDARDCURVEANDMELTINGCURVEOFABCC4GENE;BAMPLIFICATIONCURVE,STANDARDCURVEANDMELTINGCURVEOFGAPDHGENEAB分别检测13、18、21号染色体时,正常核型组目的基因/内参基因比值与三体组比值的差别具有统计学意义(P00000003,P001)。13、18、21号染色体正常组比值均接近1,三体组比值均接近15。见表1。222X染色体荧光定量PCR检测结果检测X染色体时,45,X染色体组与46,XY染色体组目的基因/内参基因比值无统计学差异(P0965),两种核型的目的基因/内参基因比值均接近05;46,XX染色体组与47,XXY染色体组目的基因/内参基因比值无统计学差异(P0326),两种核型的目的基因/内参基因比值均接近1。单拷贝X染色体(包括45,X和46,XY)比值与两个拷贝的X染色体(包括46,XX和47,XXY)比值差异有统计学意义(P0000),两者之间呈现12的比例关系。见表2。223Y染色体荧光定量PCR检测结果检测Y染色体时,46,XX组目的基因无扩增曲线,或经熔解曲线分析产物为非目的产物,所以无目的基因/内参基因比值。46,XY组与47,XYY组目的基因/内参基因比值差别有统计学意义(P0003,P001)。由于47,XYY组标本数量较小(N2),所以95可信区间范围较大,无参考意义,未予列出。具体结果见表3。3讨论染色体非整倍体指细胞的染色体数目多或少了一条或多条,由于涉及许多基因,因此受累个体将可能出现先天性多发畸形,智力、身体发育迟缓,以及流产或死胎等。临床上常见的非整倍体包括21三体综合征(DOWN综合征)、18三体综合征(EDWARDS综合征)、13三体综合征(PATAU综合征),以及一些性染色体数目异常,例如X单体(TUNNER综合征),或性染CHROMOSOME刘丽娟,等SYBRGREENⅠ实时荧光PCR在染色体常见非整倍体诊断中的应用第1期13色体三体,如47,XXX(X三体综合征),47,XXY(KLINEFELELTER综合征),47,XYY(XYY综合征)等。研究表明,13、18、21、X、Y非整倍体占新生儿染色体数目异常的8095[2]。这些非正常妊娠不仅给家庭和社会带来巨大的精神负担和沉重的经济负担,而且也严重影响到人口素质问题。然而目前对于绝大多数出生缺陷缺乏有效的治疗方法,因此及时准确的产前诊断是唯一有效的防止畸形儿出生的技术手段。目前,细胞遗传学核型分析仍是染色体非整倍体异常主要的、可靠的实验技术,是金标准,但存在操作繁琐,耗时长(要2周以上或3周才能得到结果),对技术人员要求高等缺点。随着分子生物学技术的迅猛发展,短串联重复序列聚合酶链反应技术、荧光原位杂交技术等快速染色体异常检测技术可以在12D内诊断这些常见的染色体数目异常[36]。实时荧光定量PCR技术是近年发展起来的能准确量化PCR产物的技术,它通过对PCR的每个循环的扩增产物进行实时检测,利用指数增长初期的CT值计算模板的原始拷贝数,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析,克服了终点法定量的不准确性,也减少了终点检测带来交叉污染的机会。根据荧光信号的不同主要有以下5种方法TAQMAN探针、分子信标、蝎状引物、双探针及DNA双链结合染料(SYBRGREENⅠ)。根据定量方法不同,分为绝对定量和相对定量[7]。实时荧光定量PCR技术己较为广泛地应用于一系列疾病及其病原体的快速检测上,但其对于染色体病的检测则仍局限于尝试阶段,迄今为止仅见于少数文献报道,如用TAQMAN探针法通过相对定量诊断唐氏综合征[810],或用SYBRGREENⅠ法快速诊断X染色体数目异常[11]。探针法虽有定量特异性高的优点,但探针设计难度大,合成成本也较高。比较而言,SYBRGREENⅠ法不需要探针,只要有适合的引物就可对任何目的基因进行定量,成本低廉,并具有比其他方法更高的灵敏度。虽然SYBRGREENⅠ对DNA双链的结合没有序列特异性,定量会受到非特性扩增产物的影响,特别是引物二聚体的影响,但通过优化反应条件,提高仪器检测荧光信号的温度,分析熔解曲线,可以有效消除引物二聚体的影响,获得良好的定量结果[12]。迄今为止,国内外尚未见应用SYBRGREENⅠ进行染色体数目异常检测的报道。本研究采用基于SYBRGREENⅠ染料的双标准曲线相对定量方法。该方法是结合绝对定量与相对定量发展而来的一种新的定量方法,将已知标本作为标准品,倍比稀释后制作目的基因与内参基因的标准曲线,将未知标本的CT值代入标准曲线方程,分别计算目的基因与内参基因的相对拷贝数,由于内参基因相对恒定,目的基因与内参基因相对拷贝数的比值即为目的基因的相对基因量。由于患者的异常染色体数目与正常人不同,其目的基因量增加,经过内参基因的校正,即可区分出未知标本目的基因拷贝数正常与否。从实验结果可以看出,(1)13、18、21号染色体三体标本组与正常标本组间差异显著,说明此种方法可用于检测三体标本;(2)检测性染色体时,X染色体组中45,X标本与46,XY标本间比值接近,46,XX标本与47,XXY标本间比值接近,但单拷贝的X染色体与两个拷贝的X染色体检测结果有明显差别,Y染色体组中46,XY与47,XYY的比值有显著差异,所以在做性染色体检测时,需同时检测X染色体和Y染色体,以保证结果的准确性;(3)13、18、21号染色体中正常标本之间目的基因/参照基因比值均接近1,各组三体标本比值均接近15;X染色体组中,45,X、46,XY标本比值均接近05,46,XX、47,XXY标本比值均接近1;Y染色体组46,XY标本比值接近15,47,XYY标本比值接近3。以上数据均与细胞中目的基因所在染色体与内参基因所在染色体真实拷贝数的比值接近。本研究采用的是双标准曲线相对定量的方法,由于标准曲线的斜率与标准品的具体拷贝数并无直接关系,因此利用任何一个正常标本,经梯度稀释后作为标准品,均可获得准确的相对定量结果。此法既避免了由于扩增效率差异造成的△CT法结果的不准确性,又大大减少了绝对定量标准品构建的复杂性;4检测Y染色体,扩增目的基因(SRY)时,46,XX组有些标本会出现扩增曲线,但其熔解曲线与目的基因熔解曲线的峰形及熔解温度均不相同,而与有时出现的空白对照的熔解曲线相似,所以分析为引物二聚体的扩增曲线。分析其原因可能为46,XX标本中没有SRY基因,所以与空白对照相似,缺少了模板DNA的竞争作用,引物之间较易形成引物二聚体。由此可以看出,在分析结果时,首先分析熔解曲线,即可判断产物是否为目的产物,同时也可判断产物是否特异,从而确保诊断结果的准确性。本研究结果显示,将SYBRGREENⅠ相对定量法用于诊断染色体数目异常不仅可行,而且还具有快速、经济与简便的特点。当然,类似于其他的分子遗传学方法,该方法也无法对染色体结构异常作出诊断,同时也无法对整倍体异常的标本,如三倍体或四倍体作出诊断,这是由于内参基因所在染色体也发生数目异常,因此所得结果不能与正常标本加以区分。参考文献[1]史许波,许波,杨庆岭,等非整倍体和人类生殖健康[J]中国科学技术大学学报,2008,3888839[2]付娟娟,丛林,袁静,等原位杂交技术用于快速诊断胎儿常见南方医科大学学报JSOUTHMEDUNIV第30卷14
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