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基础研究艾芬地尔鞘内注射对骨癌痛模型小鼠痛行为的改善作用王俊华张娟周晓芳马正良夏小萍高勤梅凤梅张睿DOI10.3760/CMA.J.ISSN.1674-6554.2009.02.018基金项目江苏省“兴卫工程”医学重点人才课题资助项目(RC2007012);卫生部资助项目(WKJ200628)作者单位210008南京,南京大学医学院附属鼓楼医院麻醉科通信作者马正良,EMAILMAZHENGLIANG1964@YAHOO.COM.CN【摘要】目的在小鼠骨癌痛模型上观察鞘内注射N甲基D天冬氨酸受体2B亚基(NR2B)拮抗剂艾芬地尔的镇痛效果。方法将含2105个纤维肉瘤细胞NCTC2472的最小必需培养基(ΑMEM)注射到C3H/HEJ小鼠右侧股骨远端骨髓腔,制作骨癌痛模型(T组)。同时设假手术组(S组,N=10),注入不含肿瘤细胞的ΑMEM。所有小鼠均于接种前1D,接种后第3,5,7,10,14天检测痛行为学指标,包括自发性抬足次数、机械痛缩足阈值(PWMT)和热痛缩足潜伏期(PWTL)。骨癌痛模型制作成功的T组小鼠在接种后第14天,进一步分为艾芬地尔2.5ΜG、5.0ΜG、10.0ΜG组(I1、I2、I3组,N=10)和对照组(C组,N=10),I1~I3组鞘内注射相应剂量的艾芬地尔,C组及S组给予溶媒,注药体积均为5.0ΜL,鞘内注射后2H、12H、24H再进行行为学检测。结果与S组[(2.440.79)次]和术前基础值[(2.200.85)次]相比,肿瘤细胞接种后第14天T组小鼠自发性抬足[(13.161.78)次]显著增多(P<0.05),PWMT[(0.470.19)G]较S组[(1.700.31)G]和基础值[(1.830.23)G]降低(P<0.05),PWTL[(10.011.42)S]较S组[(17.621.07)S]和基础值[(18.321.57)S]缩短(P<0.05);给药后2H、12H,与C组及14D给药前比较,I2和I3组自发性抬足次数减少(P<0.05),PWMT增高(P<0.05),PWTL延长(P<0.05),且I3组比I2组对痛行为学的改善更显著(P<0.05);I1组给药后痛行为学无明显变化(P>0.05)。结论鞘内注射艾芬地尔有效改善骨癌痛小鼠的痛行为学反应。【关键词】艾芬地尔;N甲基D天冬氨酸受体2B亚基;骨癌痛;脊髓INTRATHECALINJECTIONOFNR2BANTAGONISTIFENPRODILALLEVIATETHEBONECANCERPAININMOUSEWANGJUNHUA,ZHANGJUAN,ZHOUXIAOFANG,ETAL.DEPARTMENTOFANESTHESIOLOGY,DRUMTOWERHOSPITALAFFILIATEDTONANJINGUNIVERSITYMEDICALSCHOOL,NANJING210008,CHINA【ABSTRACT】OBJECTIVETOINVESTIGATETHEANALGESICEFFECTOFINTRATHECALINJECTIONOFNR2BANTAGONISTIFENPRODILINMOUSEOFBONECANERPAIN.METHODSTHEMOUSEMODELOFBONECANCERPAINWASDEVELOPEDBYINTRAFEMURINOCULATIONSOFΑMINIMALESSENCEMEDIA(ΑMEM)WITHOSTEOLYTICNCTC2472CELLSINC3H/HEJMICE(GROUPT).THESHAMGROUP(GROUPS,N=10)WEREINOCULATEDBYΑMEMWITHOUTANYCELLS.PAINETHOLOGYINDEXESSUCHASTHESPONTANEOUSLIFTINGBEHAVIORS,THEPAWWITHDRAWALMECHANICALTHRESHOLD(PWMT)ANDTHEPAWWITHDRAWALTHERMALLATENCY(PWTL)WEREOBSERVEDON1DBEFOREINOCULATIONANDON3D,5D,7D,10D,14DAFTERINOCULATIONTOEVALUATETHEMOUSEMODELOFBONECANCER.ONTHE14THDAFTERINOCULATION,THESUCCEEDMOUSEMODELOFBONECANCERPAINWASDIVIDEDRANDOMLYINTO2.5ΜG,5ΜG,10ΜGIFENPRODILGROUP(GROUPI1,I2,I3,N=10)ANDSOLVENTIAGROUP(20%DMSOGROUP,GROUPC,N=10).GROUPI1~I3WERETREATEDBYINTRATHECALINJECTIONOFCORRESPONDINGDOSEOFIFENPRODIL.GROUPCANDGROUPSWERETREATEDBYINTRATHECALINJECTIONOFSOLVENTIA.ALLTHEVOLUMEOFPHYSICLIQUOROFINTRATHECALINJECTIONWAS5ΜL.PAINETHOLOGYINDEXESMENTIONEDABOVEWASOBSERVEDAT2H,12H,24HAFTERADMINISTRATION.RESULTS(1)THESIGNIFICANTINCREASINGOFSPONTANEOUSLIFTINGBEHAVIORS(13.161.78),THEOBVIOUSDECREASINGOFPWMT(0.470.19)GANDPWTL(10.011.42)SWEREOBSERVEDON14THDAFTERINOCULATIONINGROUPTCOMPAREDWITHGROUPSANDPREOPERATIVEBASELEVEL(P<0.05).(2)THESPONTANEOUSLIFTINGBEHAVIORS[I2(9.001.80),(10.901.17);I3(6.802.51),(8.801.64)]WASDECREASED,THEPWMT[I2(1.120.27)G,(0.820.30)G;I3(1.440.34)G,(1.160.37)G]ANDPWTL[I2(13.861.51)S,(12.121.27)S;I3(15.951.70)S,(13.741.98)S]WASINCREASEDINGROUPI2ANDI3COMPAREDWITHTHEBASALLEVELON14THDBEFOREADMINISTRATIONANDGROUPCAT2HAND12HAFTERADMINISTRATION(P<0.05)THEANALGESICEFFECTOFGROUPI3WASMORECONSPICUOUSCOMPAREDWITHGROUPI2(P<0.05).NOOBVIOUSCHANGEOFPAINETHOLOGYINDEXESWASOBSERVEDINGROUPI1(P>0.05).CONCLUSIONINTRATHECALINJECTIONOFIFENPRODILCANEFFICIENTLYRELIEVEMECHANICALHYPERALGIAANDTHERMALHYPERALGIAINTHEMOUSEMODELOFBONECANCERPAIN.【KEYWORDS】IFENPRODIL;NR2B;BONECANCERPAIN;SPINALCORD癌性疼痛是最常见的顽固性慢性疼痛,严重影响癌症患者的生活质量。尽管按照世界卫生组织提出的“三阶梯止痛疗法”来治疗,仍有高达30%的癌症患者的疼痛无法得到缓解[1]。NR2B是N甲基D天冬631中华行为医学与脑科学杂志2009年2月第18卷第2期CHINJBEHAVMED&BRAINSCI,FEBRUARY2009,VOL.18,NO.2氨酸(NMDA)受体的一种亚基,在慢性疼痛起重要作用,前期研究也证实其在神经病理性疼痛中扮演重要角色[2]。艾芬地尔是一种选择性NR2B拮抗剂,可明显减轻慢性疼痛如神经病理性疼痛和炎性疼痛[34],但在癌痛中的鞘内应用研究未见报道。本实验拟观察鞘内注射艾芬地尔对骨癌痛小鼠的治疗作用,探讨癌痛发生的可能机制,可以为临床治疗骨癌痛提供实验依据。材料与方法一、材料1.试验动物SPF级雄性C3H/HEJ小鼠50只,4~6周龄,体质量20~25G,购自南京大学模式动物研究所(批号S1XK苏20050002)。2.肿瘤细胞株小鼠纤维肉瘤细胞株NCTC2472购自美国ATCC(AMERICANTYPECULTURECOLLECTION),批号2087787。按ATCC推荐,NCTC2472细胞在含10%马血清NCTC135培养基中培育,培养于37℃、5%CO2的细胞培养箱中,每周传代1~2次。3.主要试剂与仪器艾芬地尔粉剂(25MG/瓶,货号I2892)购自SIGMA公司,溶于20%DMSO。VONFREY纤毛(STOELTING公司,美国),ME410C型(中国医学科学院生物医学工程研究所)全自动热辐射刺激仪。二、方法1.动物分组及给药50只C3H/HEJ小鼠用分段随机分组法分为肿瘤组(T组,N=40)和假手术组(S组,N=10)。接种后第14天T组再随机分为4组(各组N=10)艾芬地尔2.5ΜG组(I1组);艾芬地尔5ΜG组(I2组);艾芬地尔10ΜG(I3组);对照组(C组)。各组小鼠鞘内注射相应剂量的IFENPRODI或溶媒,给药容积均为5ΜL。2.骨癌痛小鼠模型的建立按SCHWEI等[5]报道的方法建立小鼠骨癌痛模型戊巴比妥钠(50MG/KG,I.P.)麻醉小鼠后行右膝关节切开术,在股骨内外髁之间穿刺,将含2105个NCTC2472细胞的20ΜLΑMEM注入股骨远端骨髓腔中,牙科汞合金封闭穿刺孔,生理盐水冲洗后,涂抹青霉素粉剂,缝合皮肤。S组也行右膝关节切开术,但不接种肿瘤细胞,只注入不含有肿瘤细胞的20ΜLΑMEM。术毕小鼠置于22℃恒温,12H明暗交替的动物房中饲养,自由取食和饮水。3.行为学检测于小鼠接种前1D,接种后第3,5,7,10,14天(第14天检测在鞘内注射前);以及第14D艾芬地尔或溶媒鞘内注射后2H、12H、24H进行。观察小鼠右后肢的自发性抬足反应、机械性痛敏和热刺激痛敏。(1)自发性抬足反应小鼠置于60CM30CM15CM的透明有机玻璃箱内,观察2MIN内小鼠出现的自发抬足反应的次数。自发性抬足反应是指小鼠站立不行走,且未受外界因素刺激的条件下出现畏缩反应。(2)机械刺激痛敏反应根据CHAPLAN[6]报道的方法稍加改进检测机械痛缩足阈值(PWMT)小鼠置于10CM10CM15CM的透明有机玻璃箱内,放置于30CM高的铁丝网(网格0.5CM0.5CM)架子上,小鼠于其中自由活动。约30MIN小鼠安静后以不同折力的VONFREY纤毛刺激小鼠足底,持续6~8S。小鼠后肢迅速畏缩、撤回,认为是阳性反应。从0.16G开始,每个强度反复刺激5次,将出现3次以上阳性反应的最小VONFREY纤维强度定为小鼠的机械刺激回缩阈值。2次刺激之间至少间隔约15S。(3)热刺激痛敏反应参考HARGREAVES等[7]的方法检测PWTL将小鼠置于底部为3MM厚玻璃板的10CM10CM15CM的透明有机玻璃箱内,用全自动热辐射刺激仪检测。初次使用前,调节热辐射刺激仪焦距,使光于玻璃板处汇聚成点,调节光强度使术前小鼠基础缩腿阈值在18S左右,之后不再调节。光透过玻璃板照射于小鼠右后足,当出现右下肢的特征性甩动、提足或舔舐时,切断光源,记录时间。每只小鼠测试3次,取平均值为评估热痛敏的缩腿阈值。两次刺激间至少间隔5MIN。预先设定辐射光源自动切断时间为20S,避免长时间照射造成小鼠灼伤。4.统计学方法应用SPSS13.0软件进行统计分析。实验数据以XS表示。组内比较采用T检验,组间比较采用单因素方差分析。结果一、肿瘤模型的建立1.自发性抬足次数术前1D基础值T组(2.200.85)次,S组(2.330.10)次,差异无显著性(P>0.05)。术后第3天2组小鼠抬足次数增多,但与基础值比较,差异无显著性(P>0.05),第5天2组小鼠均恢复到基础水平(P>0.05)。而第7天,T组自发性抬足次数开始逐渐增多(3.962.08)次,在第14天(13.161.78)次与基础值(2.200.85)次和S组(2.440.79)次相比,差异具有显著性(P<0.05)。见图1。与S组比较P<0.05;与术前基础值比较#P<0.05图1接种后14D内小鼠自发行抬足次数变化(XS)2.机械刺激痛敏反应术前1D基础值T组和S组小鼠PWMT[(1.830.23)G,(1.810.27)G]差异无显著性(P>0.05)。术后第3天T组及S组PWTL731中华行为医学与脑科学杂志2009年2月第18卷第2期CHINJBEHAVMED&BRAINSCI,FEBRUARY2009,VOL.18,NO.2降低,第5天均恢复到基础水平(P>0.05)。第7天开始,T组小鼠右后足PWMT[(1.090.39)G]显著降低,低于基础值[(1.830.23)G]及S组[(1.700.31)G]水平(P<0.05)。术后第7~14天,T组PWMT呈现持续下降趋势;14D时T组[(0.470.19)G]PWMT显著下降(P<0.05)。见图2。与S组比较P<0.05;与术前基础值比较#P<0.05图2接种后14D内机械痛缩足阈值(XS)3.热刺激痛敏反应术前1D基础值T组[(18.321.57)S]和S组[(18.021.53)S]间差异无显著性(P>0.05)。T组第7天PWTL出现开始下降,但与S组间差异无显著性(P>0.05);第10~14天,T组PWTL水平进一步下降,至第14天时[(10.011.42)S],与基础值[(18.321.57)S]与S组[(17.621.07)S]相比,差异有显著性(P<0.05)。见图3。与S组比较P<0.05;与术前基础值比较#P<0.05图3接种后14D内热痛缩足潜伏期(XS)二、艾芬地尔改善痛行为作用1.自发性抬足反应次数术后第14天鞘内给药2H、12H时,I2组[(9.001.80)次、(10.901.17)次]和I3组[(6.802.51)次、(8.801.64)次]与C组[(13.902.37)次,(13.801.40)次]及相应组14D给药前水平[(13.402.60)次、(13.701.90)次]比较,自发性抬足明显减少(P<0.05),且I3组少于同时间点I2组水平,差异有显著性(P<0.05)。12及13组2H分别少于12H水平,差异有显著性(P<0.05)。至24H,12组[(13.602.37)次及I3(13.301.16)次]与C组及给药前水平已差异无显著性(P>0.05)。I1~I3组未恢复到S组水平(P<0.05)。见图4。与S组比较P<0.05;与C组比较#P<0.05;与给药前基础值比较△P<0.05图4术后第14天鞘内给药后,自发性抬足次数变化(XS)2.机械刺激痛敏反应鞘内给药后2H~24H,I1~I3都未能恢复到S组水平(P<0.05);2H时,I2、I3组[(1.120.27)G、(1.440.34)G]均高于C组[(0.420.17)G]及相应组给药前[(0.440.19)G、(0.430.18)G]水平,差异有显著性(P<0.05);12H,I2、I3组[(0.820.30)G、(1.160.37)G]高于C组(0.460.22)G(P<0.05)及给药前(P<0.05),但低于同剂量组2H时水平。2H~12H,I3组PWMT值高于I2组(P<0.05)。至24H,I2(0.440.25)及I3(0.450.19)组与C组给药前水平已差异无显著性(P>0.05)。2H~24H内,I1组与C组及给药前比较,差异无显著性(P>0.05)。见图5。与S组比较P<0.05;与C组比较#P<0.05;与给药前基础值比较△P<0.05图5术后第14天鞘内给药后,机械痛缩足阈值(PWMT)变化(XS)3.热刺激痛敏反应鞘内给药后2H~24H,I1~I3组未恢复到S组水平(P<0.05);2H,I2、I3组[(13.861.51)S、(15.951.70)S]均高于C组(10.071.17)S及相应组给药前水平[(10.121.63)S、(10.031.43)S],差异有显著性(P<0.05);I2、I3组在12H[(12.121.27)S、(13.741.98)S]均高于C组[(10.321.77)S]及给药前水平(P<0.05),但低于相应组的2H水平(P<0.05)。24HI2、I3组及2~24HI1组与C组及给药前比较,差异无显著性(P<0.05)。见图6。831中华行为医学与脑科学杂志2009年2月第18卷第2期CHINJBEHAVMED&BRAINSCI,FEBRUARY2009,VOL.18,NO.2与S组比较P<0.05;与C组比较#P<0.05;与给药前基础值比较△P<0.05图6术后第14天鞘内给药后,热痛缩足潜伏期变化(XS)讨论癌痛严重影响患者的生活质量,但目前癌痛机制仍不明确,使之难以治疗,为了寻找新的更有效的治疗方法,探讨癌痛的发生机制十分必要。肿瘤细胞接种股骨骨髓腔后,早期肿瘤生长刺激破骨细胞,促进骨质破坏,还可引起大量炎性因子的释放,导致疼痛[8];后期肿瘤快速生长,牵拉骨膜,引起周围神经的压迫、缺血[9];癌细胞分泌蛋白溶解酶,对感觉纤维和交感纤维产生溶解作用[10]。以上研究提示骨癌痛具有炎性痛和神经病理性疼痛的特征,但目前对癌痛机制的研究仍未取得突破性进展。目前炎性疼痛和神经病理性疼痛等慢性疼痛的机制研究已取得长足进步,认为NMDA受体在其中起重要作用[11]。研究认为外周神经损伤后,引起脊髓背角大量兴奋性氨基酸的释放(如谷氨酸GLU),GLU激活突触后膜的NMDAR,产生兴奋性突触后电位;最终导致细胞内CA2+大量内流,引起一系列生化级联反应,从而进一步促进突触前膜兴奋性氨基酸大量释放,激活突触后NMDAR,使其门控通道开放增加,更多的CA2+流入细胞内[3,12],这一正反馈途径在中枢敏化的慢性疼痛中具有重要作用。NMDAR由NR1、NR2(A、B、C、D)和NR3(A、B)亚单位组成。有功能的NMDAR至少包含NR1及NR2亚单位中一种。其中含有NR2B亚单位的NMDAR主要分布于海马、大脑皮质及脊髓背角I、II层,与疼痛等伤害性信号的传导密切相关。作为一种NR2B选择性拮抗剂,艾芬地尔在炎性疼痛和神经病理性等慢性疼痛中有较好的镇痛作用,同时避免了完全阻断NMDAR所引起的记忆障碍、共济失调等精神性副作用[1314]。但艾芬地尔鞘内运用对癌痛的影响未见研究,NR2B是否参与癌痛的发生和发展尚也未见文献报道。本研究中,我们通过对骨癌痛小鼠鞘内注射艾芬地尔后观察骨癌痛小鼠的痛行为学变化,为临床治疗骨癌痛寻找新的方法,并间接揭示NR2B参与骨癌痛。本实验发现术后第7天,T组小鼠出现自发性抬足次数增多、机械痛敏;第10天时出现热痛敏,随时间推移逐渐加重;第14天时各痛行为学反应明显。同课题组前期研究发现,小鼠接种后第14天,肿瘤细胞接种端股骨骨质破坏已经出现,癌痛模型的机械性痛敏、热痛敏已经明显[15]。因此选择接种后第14天艾芬地尔鞘内给药,来研究其对骨癌痛的镇痛作用。给药后观察结果示给药后2H及12H,I2、I3组小鼠的各痛行为学显著改善,高剂量I3组的作用更显著;至24H缓解疼痛效果消减。低剂量的I1组改善疼痛作用不明显。综上所述,鞘内注射艾芬地尔可以有效缓解骨癌痛,在5~10ΜG范围有剂量依赖效应,提示NR2B在骨癌痛的发生发展中起重要作用。艾芬地尔对骨癌痛的治疗作用可能是通过抑制脊髓水平的NR2B的活性和过度表达来缓解疼痛的,但是其具体作用机制如何,特别是NR2B表达水平与痛行为学之间是否相关我们正在研究。参考文献[1]FERREIRAKA,KIMURAM,TEIXEIRAMJ,ETAL.IMPACTOFCANCERRELATEDSYMPTOMSYNERGISMSONHEALTHRELATEDQUALITYOFLIFEANDPERFORMANCESTATUS.PAINSYMPTOMMANAGE,200822.[2]ZHENGLIANGMA,WEIZHANG,XIAOPINGGU,ETAL.EFFECTSOFINTRATHECALINJECTIONOFPREDNISOLONEACETATEONEXPRESSIONOFNR2BSUBUNITANDNNOSINSPINALCORDOFRATSAFTERCHRONICCOMPRESSIONOFDORSALROOTGANGLIA.ANNCLINLABSCI,2007,37349355.[3]IWATAH,TAKASUSUKIT,YAMAGUCHIS,ETAL.NMDARECEPTOR2BSUBUNITMEDIATEDSYNAPTICTRANSMISSIONINTHESUPERFICIALDORSALHORNOFPERIPHERALNERVEINJUREDNEUROPATHICMICE.BRAINRES,2007,113592101.[4]TANNOK,ESASHIA,NAKAGAWASAIO,ETAL.INTRATHECALLYADMINISTEREDBIGDYNORPHIN,APRODYNORPHINDERIVEDPEPTIDE,PRODUCESNOCICEPTIVEBEHAVIORTHROUGHANNMETHYLDASPARTATERECEPTORMECHANISM.BRAINRES,2002,952714.[5]SCHWEIMJ,HONOREP,ROGERSSD,ETAL.ANEUROCHEMICALANDCELLULARREORGANIZATIONOFTHESPINALCORDINAMURINEMODELOFBONECANCERPAIN.JNEUROSCI,1999,191088610897.[6]CHAPLANSR,BACHFW,POGRELJW,ETAL.QUANTITATIVEASSESSMENTOFTACTILEALLODYNIAINTHERATPAW.NEUROSCIMETH,1994,535563.[7]HARGREAVESK,DUBNERR,BROWNF,ETAL.ANEWANDSENSITIVEMETHODFORMEASURINGTHERMALNOCICEPTIONINCUTANEOUSHYPERALGESIA.PAIN,1988,327788.[8]PETERSCM,GHILARDIJR,KEYSERCP,ETAL.TUMORINDUCEDINJURYOFPRIMARYAFFERENTSENSORYNERVEFIBERSINBONECANCERPAIN.EXPNEUROL,2005,19385100.[9]GOBLIRSCHMJ,ZWOLAKPP,CLOHISYDR.BIOLOGYOFBONECANCERPAIN.CLINCANCERRES,2006,1262316235.[10]MANTYHPW,CLOHISYDR,KOLTZENBURGM,ETAL.MOLECULARMECHANISMSOFCANCERPAIN.NATREVCANCER,2002,2201209.[11]周跃,刘正津,梅芳瑞,等.NMDA受体和非NMDA受体在脊神经节损伤介导痛觉过敏中的作用.中国行为医学科学,2005,14603605.[12]INTURRISICE.THEROLEOFNMETHYLDASPARTATE(NMDA)RECEPTORSINPAINANDMORPHINETOLERANC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