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论著吡喹酮透皮给药治疗日本血吸虫病江艳1,2龚仁敏2林矫矫1杨艺1石耀军1陆珂1李浩1朱传刚1徐玉梅1邱叶艳2【摘要】目的探究吡喹酮(PRAZIQUANTEL,PZQ)透皮剂的治疗效果,以及吡喹酮与宿主免疫系统是否具有协同作用,为治疗血吸虫病提供更便利的治疗途径。方法新西兰大白兔感染日本血吸虫尾蚴1502条或3002条,透皮剂浓度为24%,以100MG/KG剂量对感染日本血吸虫28D的新西兰大白兔分别进行腹部透皮治疗1次和2次,并在1次感染和2次感染后1D和14D透皮治疗2次。统计治疗组的减虫率、肝减卵率、减毛蚴孵化率,评价透皮剂的治疗效果。结果感染日本血吸虫28D后吡喹酮透皮剂透皮治疗2次效果优于1次,减虫率分别为96.23%和80.19%,肝减卵率和减毛蚴孵化率均达到或接近100%。对感染后1D和14D的透皮治疗,感染2次并治疗的减虫率分别为86.62%和91.84%。结论24%的PZQ透皮制剂具有较好的杀灭日本血吸虫成虫作用,透皮次数越多,治疗效果越好;透皮剂对杀灭日本血吸虫童虫也有一定的作用,对感染2次并治疗的减虫效果更好,可能与感染宿主的免疫协同作用有关。【关键词】日本血吸虫;吡喹酮;透皮治疗DOI10.3760/CMA.J.ISSN.16734122.2011.05.003基金项目国家公益性行业(农业)科研专项基金(200903036)作者单位1200241上海,中国农业科学院上海兽医研究所,动物寄生虫病重点实验室;2241000芜湖,安徽师范大学生命科学学院通信作者朱传刚,EMAILZCG@SHVRI.AC.CNTRANSDERMALDELIVERYOFPRAZIQUANTELFORTHETREATMENTOFSCHISTOSOMIASISJAPONICUMJIANGYAN1,2,GONGRENMIN2,LINJIAOJIAO1,YANGYI1,SHIYAOJUN1,LUKE1,LIHAO1,ZHUCHUANGANG1,XUYUMEI1,QIUYEYAN2.1KEYLABORATORYFORANIMALPARASITOLOGY,SHANGHAIVETERINARYRESEARCHINSTITUTE,THECHINESEACADEMYOFAGRICULTURALSCIENCES,SHANGHAI200241,CHINA2LIFESCIENCECOLLEGE,ANHUINORMALUNIVERSITY,WUHU241000,CHINACORRESPONDINGAUTHORZHUCHUANGANG,EMAILZCG@SHVRI.AC.CNSUPPORTEDBYNATIONALPUBLICWELFARESECTORS(AGRICULTURE)RESEARCHSPECIALFUND(200903036)【ABSTRACT】OBJECTIVETOEXPLORETHETREATMENTEFFECTOFPRAZIQUANTEL(PZQ)TRANSDERMALAGENT,ANDWHETHERPRAZIQUANTELANDHOSTIMMUNESYSTEMHAVINGSYNERGISTICEFFECTINTREATMENTOFSCHISTOSOMIASIS.METHODSTHENEWZEALANDWHITERABBITSWEREINFECTEDWITHSCHISTOSOMAJAPONICUM1502OR3002CERCARIAE.THECONCENTRATIONOFTRANSDERMALAGENTWAS24%.THERABBITSWERETREATEDTHROUGHABDOMINALTRANSDERMALONCEANDTWICEATTHEDOSEOF100MG/KGONDAY28POSTINFECTION,ORTHEYWERETREATEDTWICEONDAY1ORDAY14POSTINFECTIONINSECONDARYINFECTION.WORMREDUCTIONRATE,EGGREDUCTIONRATEANDMIRACIDIAHATCHINGREDUCTIONRATEOFTREATMENTGROUPSWERECALCULATEDTOEVALUATETHETHERAPEUTICEFFECTOFTRANSDERMALAGENT.RESULTSTHEEFFECTOFPRAZIQUANTELTRANSDERMALTHERAPYTWICEWASBETTERTHANONCEONDAY28POSTINFECTION.WORMREDUCTIONRATESWERE96.23%AND80.19%RESPECTIVELY.EGGREDUCTIONRATEANDMIRACIDIAREDUCTIONRATEWEREATORCLOSETO100%.THEWORMREDUCTIONRATESOFTREATMENTONDAY1ORDAY14AFTERSECONDARYINFECTIONWERE86.62%AND91.84%RESPECTIVELY.CONCLUSION24%OFPRAZIQUANTELTRANSDERMALAGENTHADGOODEFFECTONADULTSCHISTOSOMAJAPONICUM.THEMORETRANSDERMALTHERAPYTIMES,THEBETTERTREATMENTEFFECT.TRANSDERMALAGENTALSOHADEFFECTONSCHISTOSOMULUM,ANDHADTHEBETTERWORMREDUCTIONRATEONSECONDARYINFECTIONAFTERTREATMENTTHANFIRSTINFECTION,INDICATINGTHATPRAZIQUANTELMAYHAVEIMMUNESYNERGYEFFECT.【KEYWORDS】SCHISTOSOMAJAPONICUM;PRAZIQUANTEL;TRANSDERMALTREATMENT血吸虫病流行于热带和亚热带等76个国家和地区,是一种危害严重的人兽共患寄生虫病,呈世界性分布[1],全球受威胁人口高达6亿人,感染人数达2亿人,全球每年至少有2万余人死于血吸虫病[2]。在大规模的彻底灭螺和血吸虫疫苗的临床应用实现之前,抗血吸虫病药物仍是防治血吸虫病的主要手段。目前用于治疗血吸虫病的药物主要有吡喹酮、青蒿素及其衍生物如蒿甲醚等[3]。在这些药物中,吡喹酮以其疗效高、疗程短、不良反应少,可单剂量治疗、使用方便等优点,被WHO推荐为治疗血吸虫病的首选药物[46]。现阶段,兽用吡562国际医学寄生虫病杂志2011年9月第38卷第5期INTJMEDPARASITDIS,SEPTEMBER2011,VOL.38,NO.5喹酮制剂依然是片剂和粉剂,存在着吸收差,首过效应严重,导致药物利用率低以及副作用大等缺点,且由于多数家畜为反刍动物,药物容易破坏胃部菌落的平衡。吡喹酮具有脂溶性,为研究其透皮制剂提供了很好的条件。给药方式的不同不仅会影响治疗效果,而且在给药的便利度上也有差别。有文献报道,吡喹酮透皮制剂对预防日本血吸虫感染有很好的作用[7]。吡喹酮透皮制剂给药方便,避免了药物在肝脏的首过效应,生物利用度提高。同时,某些试验表明经吡喹酮溶液涂擦后,小鼠精神状态正常,食欲良好,无明显的兴奋或抑制现象,行走正常,涂擦部位外表亦无红肿热痛等炎症变化[811]。因此,吡喹酮的透皮制剂越来越受到广泛的关注。目前,所研究的透皮制剂主要有膏药、搽剂、涂膜剂、巴布剂、骨架型贴片、膜控型贴片、微乳、脂质体、包合物、前体药物与低共融物等。本研究采用的是透皮剂搽剂,对感染日本血吸虫28D的新西兰大白兔腹部透皮治疗2次和1次,并比较其治疗感染日本血吸虫1次和2次的效果,探讨宿主的特异性免疫对吡喹酮的杀虫效果是否具有协同作用。1材料与方法1.1材料新西兰大白兔购自上海斯莱克实验动物有限责任公司,体重3KG左右。阳性钉螺购于江西省寄生虫病防治研究所。吡喹酮透皮制剂由中国农科院上海兽医研究所血吸虫病实验室研制,浓度为24%。1.2方法1.2.1分组方案第一次实验分组为考察不同透皮次数治疗血吸虫病的效果,在感染28D后分别设透皮1次和2次2个实验组A、B,并设感染对照组1(表1)。第二次实验分组在第一次实验的基础上,为验证透皮治疗早期血吸虫病的效果以及对再感染的早期透皮治疗效果,依次设治疗组C、D、E、F和感染对照组2、3(表1)。C、D两组分别在首次感染后1D和14D透皮治疗;E和F组是首次感染后28D进行透皮治疗,治疗后2周进行第2次感染,在第2次感染后1D或14D分别进行透皮治疗;对照组2为首次感染对照;对照3是第2次感染对照。每次实验每组3~4只实验兔。透皮治疗时间、透皮次数以及感染次数见表1。透皮2次方案为每天1次,连续透皮2次,所采用的透皮制剂浓度均为24%。表1实验分组TABLE1GROUPSOFEXPERIMENT组别GROUPS感染次数TIMESOFINFECTION透皮治疗时间TIMEOFTRANSDERMALTHERAPYAFTERINFECTION透皮次数TIMESOFTHERAPYA128D1B128D2对照1CONTROL1CD对照2CONTROL2EF对照3CONTROL31111222-1D14D-1D14D-02202201.2.2人工感染血吸虫将实验兔固定在木板上,拔去腹部兔毛,解剖镜下计数尾蚴,第一次实验,A、B组和对照组1每只兔定量感染1502条尾蚴;第二次实验,C、D、E、F组和对照组2、3每只兔每次定量感染3002条尾蚴,每次均玻片贴腹20MIN。1.2.3透皮治疗按100MG/KG剂量进行透皮治疗,实验兔固定在木板上,除腹部兔毛,涂抹透皮剂,每次透皮面积为4~5CM2,透皮时间为30MIN;感染对照组只涂抹不含吡喹酮的透皮溶媒。透皮结束后,擦拭腹部,直接将兔子放回笼中,正常饲养,每隔24H观察透皮处皮肤和实验兔进食等状况。1.2.4透皮剂的杀虫效果成虫检获分别于感染后第45~46天解剖,用心脏灌注法冲出门静脉肠系膜静脉和肝内虫体并计数,按下式计算减虫率减虫率=A-BA100%式中A为对照组检获的平均成虫数,B为治疗组检获的平均成虫数。1.2.5透皮剂的肝减卵率肝脏虫卵计数取每只实验兔相同部位肝脏约2~4G,称重后定容至20ML,均质仪匀浆,取2ML肝脏匀浆液加2MLNAOH(10MOL/L)45℃消化30~662国际医学寄生虫病杂志2011年9月第38卷第5期INTJMEDPARASITDIS,SEPTEMBER2011,VOL.38,NO.560MIN,然后取100ΜL在显微镜下计数,每样计数3次,并换算出肝脏克虫卵数(EGGPERGRAMOFLIVER,EPG)。按下式计算肝减卵率肝减卵率=M-NM100%式中M为对照组平均每克肝脏的虫卵数,N为治疗组平均每克肝脏的虫卵数。1.2.6抑制虫卵毛蚴孵化率A、B组和对照组1解剖后,取实验兔肠内粪便5~10G,称重后定容至20ML,均质仪匀浆,匀浆的粪便都加到500ML长颈平底烧瓶内,瓶颈处加脱脂棉,棉层上方加8ML去氯水,25℃恒温孵化。孵化后1H和3H观察脱脂棉上层是否有毛蚴,观察时有毛蚴记录“+”,无毛蚴记录“”。C、D、E、F组和对照组2、3解剖后,取实验兔相同部位肝脏2~4G,称重后定容至20ML匀浆,500ML长颈平底烧瓶内加入4ML肝脏匀浆液,瓶颈处加脱脂棉,棉层上方加8ML去氯水,25℃恒温孵化。孵化后1H取棉层上含有毛蚴去氯水8ML,再加入等体积去氯水继续孵化,孵化后3H再取样8ML。取样液中加入5%甲醛固定毛蚴,6000G离心10MIN,沉淀加碘酊1~2滴着色,解剖镜下计数毛蚴,并换算出克肝脏孵化毛蚴数,按下式计算减毛蚴孵化率减毛蚴孵化率=X-YX100%式中X为对照组平均每克肝脏包含的毛蚴数,Y为治疗组平均每克肝脏包含的毛蚴数。1.2.7统计分析统计各试验组减虫率、肝减卵率、减毛蚴孵化率。数据采用SPSS软件进行统计学分析,计算各组虫数、肝脏克虫卵数、孵化毛蚴数的算术平均数和标准差(XS)。同时,通过方差分析比较治疗组和对照组之间的差异是否具有统计学意义。2结果2.1透皮剂的刺激性观察各组实验兔经吡喹酮透皮剂治疗后,均无明显的精神状态不正常现象,连续观察2D,各只食欲正常,透皮部位皮肤未出现红肿、发炎等症状,说明透皮剂的用药是安全的。2.2不同透皮次数对血吸虫成虫的治疗效果感染后28D透皮治疗,各组减虫率均在80%以上,肝减卵率接近或达到100%,粪便虫卵孵化均转阴,说明透皮剂对28D的成虫有较好的杀灭作用,如表2所示。与对照组1相比,治疗组A和B减虫率分别为80.19%和96.23%,肝减卵率分别为99.64%和100%,差异均有统计学意义(P<0.05)。此外,透皮治疗2次的B组疗效优于透皮治疗1次的A组。表2一次感染后28D吡喹酮不同透皮次数的治疗效果TABLE2THETHERAPEUTICEFFECTOFDIFFERENTPZQTRANSDERMALTIMESON28DAYSAFTERTHEFIRSTINFECTION组别GROUPS平均虫荷数AVERAGENO.OFWORMS减虫率(%)WORMREDUCTIONRATE(%)肝脏克虫卵数EPGINLIVER肝减卵率(%)EGGREDUCTIONRATE(%)粪便虫卵孵化毛蚴数MIRACIDIAHATCHFROMEGGINSTOOL粪便虫卵转阴率(%)NEGATIVERATEOFFECALEGG(%)A10.59.19A80.1928.3120.02B99.64G22100B2.001.41A96.230B100G22100对照1CONTROL153.0013.00-7809.24526.80-G23-A治疗组与对照组1相比,平均虫荷数的差异均有统计学意义,PG240.05;B治疗组与对照组1相比,平均卵荷数的差异均有统计学意义,PG240.01;“-”粪便虫卵未孵化出毛蚴,“+”粪便虫卵孵化出毛蚴ATHETREATMENTGROUPSCOMPAREDWITHTHECONTROL1,THEDIFFERENCESOFAVERAGEWORMBURDENWERESTATISTICALLYSIGNIFICANCE,P<0.05,BTHETREATMENTGROUPCOMPAREDWITHTHECONTROL1,THEDIFFERENCEOFAVERAGEEGGLOADWERESTATISTICALLYSIGNIFICANCE,P<0.01,“-”EGGSDIDNOTHATCHMIRACIDIAFROMFECAL,“+”EGGSHATCHEDMIRACIDIAFROMFECAL762国际医学寄生虫病杂志2011年9月第38卷第5期INTJMEDPARASITDIS,SEPTEMBER2011,VOL.38,NO.5表3一次感染和二次感染早期(1D和14D)吡喹酮透皮剂的治疗效果TABLE3THETHERAPEUTICEFFECTOFPZQTRANSDERMALAGENTATEARLYPERIOD(1DAND14D)OFONCEANDTWICEINFECTION组别GROUPS平均虫荷数AVERAGENO.OFWORMS减虫率(%)WORMREDUCTIONRATE(%)肝脏克虫卵数EPGINLIVER肝减卵率(%)EGGREDUCTIONRATE(%)克肝脏孵化毛蚴数MIRACIDIAHATCHFROMLIVER(%)减毛蚴孵化率(%)MIRACIDIAREDUCTIONRATE(%)C57.6744.0661.301165.971272.01C92.2711.5515.0384.26D82.506.3644.634480.414208.0170.309.329.9887.30对照2CONTROL2149.0043.84-15087.685361.82-73.3962.04-E19.6734.06D86.623357.934746.4978.6148.3783.7839.91F12.0015.87D91.844198.114323.7573.260100对照3CONTROL3147.0030.94-15698.252804.73-80.541.29-C治疗组C与对照组2相比,平均虫荷数的差异均有统计学意义,PG240.05;D治疗组E、F与对照组3相比,克肝脏平均卵荷数的差异均有统计学意义,PG240.05CTHETREATMENTGROUPCCOMPAREDWITHTHECONTROL2,THEDIFFERENCESOFAVERAGEWORMBURDENWERESTATISTICALLYSIGNIFICANCE,P<0.05,DTHETREATMENTGROUPSEANDFCOMPAREDWITHTHECONTROL3,THEDIFFERENCEOFAVERAGEEGGLOADWERESTATISTICALLYSIGNIFICANCE,P<0.052.3透皮剂对感染不同时期血吸虫的疗效观察一次感染后1D透皮治疗的C组减虫率和肝减卵率分别为61.30%和92.27%,明显高于感染后14D治疗的D组,但两组的减毛蚴孵化率无太大差异,分别为84.26%和87.30%(表3)。结合实验一的B组可以看出,采用相同的透皮剂浓度和透皮次数,在感染血吸虫后1、14和28D进行透皮治疗,其中感染后28D透皮治疗的减虫率和肝减卵率最高,感染后14D透皮治疗的最低。2.4透皮剂对二次感染血吸虫的早期疗效观察吡喹酮透皮剂对一次感染和二次感染的童虫有不同的杀灭作用。感染后1、14D透皮治疗实验表明,二次感染的E和F组的减虫率分别为86.62%和91.84%,与对照组3比较,虫荷数差异均有统计学意义(PG240.05)。E组和F组减肝卵率为78.61%和73.26%,且F组的减毛蚴孵化率高达100%(表3)。3讨论吡喹酮以其治疗的高效性被广泛应用。吡喹酮虽然有很好的杀灭血吸虫成虫的效果,但是对不同发育阶段的血吸虫有不同的杀灭效果[12]。一般认为吡喹酮只对血吸虫成虫和当日感染的血吸虫皮肤期童虫有杀灭效果,而对其他发育期的童虫杀灭效果很差或不明显。吡喹酮的浓度及利用度对杀灭血吸虫也有很大的影响,其中给药途径也是一个重要的影响因素。本研究采用了吡喹酮透皮制剂经皮肤渗透给药的方式,对新西兰大白兔感染日本血吸虫后的不同时期,以及不同的感染次数,进行腹部透皮治疗,考察各实验组的减虫率、肝减卵率、减毛蚴孵化率。3.1透皮次数对治疗效果的影响一次感染后28D进行透皮治疗发现,透皮治疗2次的减虫率高于透皮治疗1次,说明透皮治疗2次的效果优于1次。因为透皮治疗2次增加了药物在体内的滞留时间,从而增加了疗效。治疗组粪便虫卵孵化3H后均未观察到毛蚴,可能是因为吡喹酮透皮剂影响了成虫的发育,在剖杀冲虫也发现,冲出的虫体比正常虫体短,同时观察到单个的雄性虫体比例较高,表明吡喹酮透皮治疗对成虫有很好的杀灭作用。3.2吡喹酮透皮剂对一次感染的治疗效果一次感染日本血吸虫后1D使用吡喹酮透皮剂进行连续2天的透皮治疗,有较高的减虫率和肝减卵率。黄一心[12]提到吡喹酮对血吸虫发育的不同阶段有不同的杀灭效果。本研究结果也表明感染后1D透皮治疗效果高于14D,与口服吡喹酮治疗862国际医学寄生虫病杂志2011年9月第38卷第5期INTJMEDPARASITDIS,SEPTEMBER2011,VOL.38,NO.5效果的趋势一致[13]。这可能是由于透皮治疗中药物在皮肤中有积蓄作用,使得吡喹酮药物在血浆中能够保持较长的时间。有研究证明,以4%浓度吡喹酮透皮剂,按200MG/KG剂量透皮,与同等剂量口服组相比,经皮给药的血液浓度较口服高一倍,且8H后仍维持在一个稳定水平,而口服组8H后血液浓度几乎为零[14]。吡喹酮透皮剂不仅能够阻止血吸虫的正常发育,而且也能杀灭部分血吸虫童虫,血吸虫感染早期的治疗效果仍不如晚期对成虫的治疗效果好,但早期治疗能使宿主的肝脏病变减轻[1518]。3.3吡喹酮透皮剂对二次感染的治疗效果二次感染实验旨在考察宿主在产生特异性免疫后,对血吸虫感染早期使用吡喹酮透皮剂的杀虫效果是否具有协同作用。实验结果表明,透皮剂对二次感染比一次感染早期童虫的杀灭效果有所提高。吡喹酮杀灭血吸虫有免疫依赖性[19],如果没有宿主免疫因素的介入,吡喹酮的杀虫效果就不明显,反之,吡喹酮的杀虫效果就会明显增加[20]。由于一次感染并治疗未杀灭所有的血吸虫成虫,成虫在宿主体内可以释放可溶性抗原,可能导致宿主产生特异性的带虫免疫,因此透皮剂对血吸虫二次感染早期童虫的杀灭作用明显增高,提示吡喹酮透皮剂对血吸虫的杀灭作用与宿主的免疫系统具有协同性。虽然二次感染的肝减卵率和减毛蚴孵化率并无优势,这可能是由于一次感染并治疗未杀灭宿主体内所有的成虫,因此在二次感染的血吸虫未产卵前,一次感染残留的成虫仍继续产卵,从而增加了二次感染宿主肝脏的虫卵数。综上所述,浓度为24%的吡喹酮透皮剂浓度较高,在有效治疗的前提下,体积需求量较适中,为透皮剂的实际应用提供了新的选择。条件允许的情况下,采用每天一次的连续透皮,即透皮次数越多,治疗效果越好。不同发育程度的血吸虫对透皮使用吡喹酮依然存在不同的敏感性,血吸虫感染28D透皮治疗效果比较明显。在感染早期和童虫发育期有一定效果,可能和皮肤的储存药物功能有关。对于重复感染组实施吡喹酮透皮治疗,减虫率有所提高,这和特异性免疫与吡喹酮透皮剂的协同作用有关。在今后的研究中,应注重探究透皮剂治疗的最适方案以及特异性免疫协同吡喹酮对各感染时期的杀灭作用。参考文献[1]李龙.抗血吸虫病药物的研究现状[J].兽医导刊,2009,4(8)58.[2]陈龙达,王水清,柳建发.日本血吸虫病防治研究进展[J].地方病通报,2009,4(5)9091.[3]李朝晖,董兴齐.血吸虫病治疗药物研究进展[J].中国血吸虫病防治杂志,2009,21(4)334336.[4]杭盘宇,梁幼生,戴建荣,等.不同阶段日本血吸虫对吡喹酮敏感性的研究[J].中国血吸虫病防治杂志,2001,13(6)343346.[5]陈名刚.国外吡喹酮防治血吸虫病的进展[J].国际医学寄生虫病杂志,2006,33(1)2027.[6]任润香,鲁敏,冯冬初,等.吡喹酮经皮肤途径给药治疗家兔血吸虫病的实验报告[J].湖北预防医学杂志,1990,1(1)40,52.[7]金玉明,黄铭西,刘竹青.吡喹酮等药物口服与皮涂预防小鼠日本血吸虫感染的初步研究[J].中国热带医学,2001,1(3)251253.[8]苏景,张秀英,张喜丰,等.透皮制剂的研究概述及其临床应用[J].中国畜牧兽医,2005,32(11)4143.[9]望西玉,王过渡,樊中丽,等.吡喹酮涂肤剂预防及治疗小鼠血吸虫病的研究[J].动物学杂志,1997,32(5)3537.[10]郑新生,郑新安,黄静,等.高浓度吡喹酮溶液的透皮吸收及对日本血吸虫病鼠的治疗试验[J].中国药学杂志,2007,42(6)450453.[11]唐山枫,胡小风,郑新生.透皮给药后吡喹酮在小鼠体内组织分布及药代动力学[J].中国兽医寄生虫病,2007,15(5)2527.[12]黄一心.吡喹酮抗血吸虫作用机理的奥秘[J].中国血吸虫病防治杂志,2010,22(2)101104.[13]尤纪青,梅静艳,肖树华.吡喹酮与篙甲醚合并治疗小鼠血吸虫病的效果观察[J].中国寄生虫病防治杂志,1994,7(1)5051.[14]彭慧玲.吡喹酮透皮给药治疗动物血吸虫病的最低有效剂量,血浓及毒性观察[J].湖北预防医学杂志,1991,2(2)2224,37.[15]黄一心.吡喹酮是否具有免疫调节作用[J].中国血吸虫病防治杂志,2007,19(1)7677.[16]杨元清,杨惠中,乐文菊.吡喹酮实验治疗家兔血吸虫病肝硬化的形态学观察[J].中国医学科学院学报,1982,4(1)3739.[17]赵雪云,陈静卿,蒋明森,等.吡喹酮对感染血吸虫小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