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丙型肝炎病毒核心抗原检测技术国内外临床研究应用情况.doc丙型肝炎病毒核心抗原检测技术国内外临床研究应用情况.doc -- 5 元

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丙型肝炎病毒核心抗原检测技术国内外临床研究应用情况(综述)张贺秋丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus,HCV)感染引起的一种重要的世界性传染病。一般地,1520左右的HCV感染者为自限性感染,可以很快的康复。但是,也有8085的感染者发展为慢性丙型肝炎,其中又有20的可发展为肝纤维化,最终有45的肝纤维化患者发生肝细胞性肝癌,危害十分严重。目前,慢性丙型肝炎除了干扰素有确切的疗效外,尚无其它有效的治疗药物。国际上近来报道,PEG修饰的干扰素加利巴韦林联合治疗可在4050左右的患者获得较好的反应,但也有疗程长、价格昂贵、毒副作用大以及易反弹等缺点。此外,丙型肝炎疫苗的研制也因HCV高度变异而困难重重,短期内难有突破性进展。因此,尽早检出HCV感染者,阻断HCV的传播是当务之急。1HCV检测技术的现状HCV一般通过被HCV污染的血液和血液制品传播,现在常用的HCV检测技术有两种方式(1)间接检测,主要检测抗HCV抗体(2)直接检测,通过定性或定量检测HCV病毒粒子的组成成分确定病毒的存在,例如HCVRNA。这两种检测方式在确诊HCV感染,选择HCV感染者的治疗方案以及评价抗HCV治疗的疗效方面起到了关键作用。1.1抗HCV抗体的检测上世纪九十年代初,利用重组HCV抗原开发出了抗HCV抗体检测技术,即酶免疫分析(enzymeimmunoassays,EIAs)技术,已经发展到第三代。该技术可检测样本中针对不同HCV抗原(如C区、NS3区、NS4区和NS5区等)的混合抗体,目前检测的特异性已高达99以上。由于缺乏更敏感的金标准,抗HCVEIA技术的敏感性还很难确定。在免疫健全的患者中,抗HCVEIA的检测敏感性高于99,几乎所有的HCV感染者都可以被检测出来。但对于正进行血液透析的患者和严重免疫缺损患者,虽然其体内有HCV复制活跃,但EIA检测可能就是阴性结果。为此,某些厂商又开发了免疫条带分析作为确证实验,如Ortho公司开发的RIBA等。因第三代EIA在临床检测中表现良好,目前免疫条带分析在临床的实际应用的意义已不是很大。但因为在血站EIA检测结果阳性的阳性预测值(positivepredictivevalue,PPV)相对较低,其在血站仍然有很大的用武之地。1.2HCVRNA的检测1.2.1定性检测HCVRNA定性检测中HCVRNA的存在被视为HCV病毒复制的标志。因其敏感性比现有的任何一种定量检测方法都要高,定性检测HCVRNA是非常有用的一种直接检测HCV是否存在的技术。该技术基于利用RTPCR技术或转录介导的扩增(transcriptionmediatedamplification,TMA)技术特异性扩增HCV基因组RNA序列,又称为核酸扩增(nucleicacidamplificationtechniques,NAT)技术。目前市面上的HCVRNA定性检测试剂的检测临界值为50HCVRNAIU/mL和10IU/mL,主要产品有Roche公司的CobasAmplicoräorAmplicoròHCVTest,Version2.0Chiron公司基于TMA技术的ProcleixaHIV1/HCV,可一个反应同时检测HIV1RNA和HCVRNA。1.2.2定量检测HCVRNA样本中HCVRNA含量可通过NAT技术和信号扩增技术(分支DNA检测)来确定。目前市面上的HCVRNA定量检测试剂的最低检测临界值介于30IU/mL和615IU/mL之间,线性定量的上限在500,000IU/mL和7,700,000IU/mL之间。样本中病毒水平高于检测上限的,应稀释1/10或1/100后重新检测。HCVRNA定量检测结果不受HCV基因型的影响,而所谓的国际单位(internationalunit,IU)是按WHOHCVRNA标准参比血清来确定的。为了比较不同HCVRNA定量检测试剂的检测结果和在全球推广,在不久的将来所有的HCVRNA定量检测试剂都应该采用此标准。目前市面上的HCVRNA定量检测试剂主要产品有基于分支DNA技术的Bayer公司Versant™HCVRNA3.0基于竞争性PCR技术的Roche公司CobasAmplicoräorAmplicoròHCVMonitorTest,Version2.0和Abbott公司LCxHCVRNAQuantitativeAssay。2现有常用检测技术的局限性2.1抗HCVEIA检测存在窗口期由于现有的第三代抗HCVEIA检测技术的特异性和敏感性已经很高,基本上能够检出所有的HCV感染者,使输血后丙型肝炎的发生率大大降低(美国在19971999年间为1/230,000,同期法国为1/700,000)。但是,在HCV感染后至抗HCV抗体产生之前还有一段约4070天的较长时期(平均66天)。此时,献血员已被感染并具有感染性,应用目前的第三代EIA检测试剂不能检出,称为感染后血清阳转前的窗口期(preseroconversionwindowphase,PWP)。PWP的存在,是输血安全的重要威胁之一,使受血者依然有经输入抗HCV筛选阴性的血液而感染HCV的危险,国内外已经有关于输入抗HCV筛选阴性的血液而感染HCV的报道。2.2HCVRNA检测难以普及由于在HCV感染后615天(平均11天)HCVRNA就在感染者血液中出现,并在血清阳转之前达到一个较高的水平,RNA滴度在100,000至100,000,000拷贝/mL之间。为了降低PWP感染的危险,缩短PWP以实现HCV感染的早期检测,许多国家引入敏感性很高的NAT检测技术对献血员进行常规筛选。敏感的NAT试剂可以检测出100至500份样品的混合血样中的HCVRNA。美国已开始对16至24份样品的混合血样进行NAT筛选,目前已经在16,300,000份血样中筛选出62份HCVRNA阳性血。尽管NAT检测在发达国家已经成功的筛选出了感染性献血员,但由于NAT技术需要昂贵精密的仪器、较高的实验技巧、试剂比较昂贵以及容易交叉污染导致假阳性偏高,使其很难推广到单个献血员,在发展中国家的应用也受到很大限制。3HCV核心抗原检测技术的进展3.1HCV核心抗原检测技术HCV核心抗原也是在HCV感染者体内出现的早期感染的标志,几乎与HCVRNA同时出现。目前已经开发出两种检测HCV核心抗原的ELISA检测试剂,一种是直接检测血清或血浆样品中的游离HCV核心抗原,另一种是检测血清或血浆样品中的总的HCV核心抗原。一般直接检测血清或血浆样品中的游离HCV核心抗原主要用于血液筛查以缩短窗口期,保证输血安全。而检测血清或血浆样品中总HCV核心抗原则用途较广,不仅可用于血液筛查,而且还可指导慢性丙型肝炎患者的治疗,判断预后。Abbott公司的Muerhoff等研究出了一种基于微球的自动化化学发光免疫分析PRISMHCV核心抗原检测试剂,该方法首先以抗HCV核心抗原的单抗包被微球捕捉血清或血浆中的核心抗原,然后以丫啶色素结合的单抗检测捕获的抗原,利用单通道化学发光检测仪确定结果。检测14套血清阳转系列血清盘和1004名献血员的结果表明,该方法的特异性达99.9,与HCVRNA检测的符合率为98.6(69/70),平均可缩短窗口期32.7天,只比NAT检测时间晚0.66天(平均),这与其它报道HCV核心抗原检测检出时间比NAT检出时间晚1天左右是一致的。日本的Kashiwakuma等人也利用重组HCV核心抗原免疫BALB/c小鼠制备单抗建立了类似的荧光酶免疫分析技术,其所用的二抗是半乳糖苷酶结合的单抗,与相应的底物作用检测荧光。初步检测结果表明,该方法检测的HCV核心抗原定量与HCVRNA水平显著相关,可用于总HCV核心抗原的定量检测。3.1游离HCV核心抗原检测技术及应用游离HCV抗原检测试剂尤其适于在血清阳转前使用,可缩短HCV感染检测的窗口期约4050天,应用于献血员筛查可显著改善输血安全。Ortho公司的Peterson等人为了评价一种可检测血清中HCV核心抗原的ELISA检测试剂原型,通过24份血清阳转系列血清对抗HCV抗体、HCVRNA和HCV抗原出现时间进行了比较。结果表明,83(20/24)的样品中HCV核心抗原与HCVRNA同时检出。HCV核心抗原的平均检出时间只比HCVRNA晚约1天。总体来讲,87的HCVRNA阳性样品中含有可检测到的HCV核心抗原。Peterson等认为,HCV核心抗原可在HCV感染后抗体阴性的窗口期通过常规的ELISA技术检出,对于缩短检测窗口期非常有用。军事医学科学院与景达基因公司的张贺秋等人利用其研制的HCV核心抗原ELISA检测试剂盒,通过对2.75万人献浆员,采用抗-HCV、HCVRNA和HCVcAg检测试剂进行连续两年的HCV感染状况跟踪研究。研究表明,对两年内确诊的11例HCV感染,HCV核心抗原诊断试剂、HCVRNA检测试剂较HCV抗体检测试剂对HCV感染后的检出时间缩短。HCV核心抗原诊断试剂较HCV抗体检测对HCV感染的阳性检测提前14-68天,平均35.2天HCVRNA诊断试剂较HCV抗体检测时间对HCV感染的阳性检测提前19-68天,平均39.3天HCVRNA诊断试剂较HCV抗原检测对HCV感染的阳性检测提前0-17天,平均4.1天。说明HCV抗原检测是一种适合我国国情缩短检测窗口期的简单有效经济的方法。Ortho公司、景达基因公司推出了商业化的游离HCV核心抗原ELISA检测试剂,资料显示试剂可比已有的HCV抗体检测试剂早35天以上检测出HCV感染。更为重要的是,该方法操作快速、简便,可在3小时内获得结果,并且与现有的仪器设备兼容,适合用于献血员的大规模筛选。然而,一旦HCV感染者体内产生抗体发生血清阳转,抗核心抗原抗体与HCVcAg之间便可形成抗原抗体复合物,其检测的敏感性就大大降低了。3.2总HCV核心抗原检测技术及应用为了克服游离HCV核心抗原检测试剂的不足,Aoyagi等对样品进行了一步简单的预处理,将免疫复合物解离及病毒颗粒裂解后再行检测。预处理的方法十分简便,可以很好地与常规ELISA方法整合,使该方法可在更广泛的人群中应用,也进一步扩大了方法的用途。Ortho公司开发了可定量检测血清或血浆中总HCV核心抗原的检测试剂TrackC,无论抗HCV抗体存在与否均可使用。Laperche等的研究发现,其敏感性比第一代用于血液筛查的检测游离HCV核心抗原ELISA试剂还要高,可以作为NAT试剂的替代产品用于窗口期HCV感染的诊断。Veillon等人通过与两种HCVRNA定量分析方法QuantiplexHCVRNA2.0(bDNAv2.0)或VersantHCVRNA3.0(bDNAv3.0)和CobasAmplicorHCVMonitorversion2.0(HCMV2.0)进行比较研究,对该方法的敏感性、特异性和可重复性进行了评价。结果表明,对于不同的HCV基因型样品,该方法都取得了较好的结果,检测的批内和批间变异系数分别为5.11和9.95,在献血员中检测的特异性为99.5,与两种HCVRNA定量方法相比较有较好的相关性。Maynard等为确定总HCV核心抗原定量检测在预测PEG修饰的干扰素和利巴韦林联合治疗的反应性上的效果,利用Ortho公司的总HCV核心抗原检测试剂和HCVRNA定量检测技术共同检测了116位接受联合治疗的患者的病毒血症情况。他们发现,在治疗前和治疗3个月后,总HCV核心抗原检测的反应预测性与HCVRNA检测相同,似乎总HCV核心抗原检测的效果在治疗早期(4周以内)要优于HCVRNA检测,在3个月后达到最佳效果。与HCVRNA检测相比,在监测治疗和预测PEG修饰的干扰素和利巴韦林联合治疗的反应性上,监测血清中总HCV核心抗原水平是一种精确和可靠的方法,可代替HCVRNA定量检测。4结语抗HCV抗体检测、HCVRNA检测和HCV基因分型技术已在临床和血站广为应用,为保证血供安全做出了重要贡献。而HCV核心抗原检测是近两年得到快速发展的一种新的检测HCV复制的间接指标,它的出现使克服抗HCVEIA筛选的局限缩短窗口期成为可能,而且总HCV核心抗原检测还可用于监控慢性丙型肝炎患者体内病毒载量,评价抗HCV治疗的效果。参考文献1.ZanettiAR,RomanoL,brunetoM,etal.TotalHCVcoreantigenassayanewmarkerofhepatitisCviremiaformonitoringtheprogressoftherapy.JMedvirol,2003702730.2.PetersonJ,GrenG,IidaK,etal.DetectionofhepatitisCcoreantigenintheantibodynegativewindowphaseofhepatitsCinfection.VoxSang,2000,788085.3.LapercheS,LeMarrecN,SimonN,etal.AnewHCVcoreantigenassaybasedondisassociationofimmunecomplexesanalternativetomolecularbiologyinthediagnosisofearlyHCVinfection.Transfusion.2003,43795862.4.VeillonP,Payanc,PicchioG,etal.ComparativeevaluationofthetotalhepatitisCviruscoreantigen,branchedDNA,andAmplicorMonitorassaysindeterminingviremiaforpatientswithchronichepatitisCduringinterferonplusribavirincombinationtherapy.JclinMicrobiol,2003,41732123220.5.MaynardM,PradatP,BerthillonP,etal.ClinicalrelevanceoftotalHCVcoreantigentestingforhepatitisCmonitoringandforpredictingpatientsresponsetotherapy.JViralHepat.200310431823.6.ZanettiAR,RomanoL,BrunettoM,etal.TotalHCVcoreantigenassayanewmarkerofhepatitisCviremiaformonitoringtheprogressoftherapy.JMedVirol.20037012730.7.EirasA,FrancoE,MontoroJA,etal.HCVNATminipoolRTPCRandHCVcoreantigenELISA.Transfusion.2003431118authorreply118119.8.LaggingLM,GarciaCE,WestinJ,etal.ComparisonofserumhepatitisCvirusRNAandcoreantigenconcentrationsanddeterminationofwhetherlevelsareassociatedwithliverhistologyoraffectedbyspecimenstoragetime.JClinMicrobiol.2002401142244229.9.BouvieraliasMPatelK,DahariH,etal.ClinicalutilityoftotalHCVcoreantigenquantificationanewindirectmarkerofHCVreplication.Hepatology,2002361211218.10.NublingCM,UngerG,ChudyM,etal.SensitivityofHCVcoreantigenandHCVRNAdetectionintheearlyinfectionphase.Transfusion.200242810371045.11.GrantPR,SimsCM,TedderRS.QuantificationofHCVRNAlevelsanddetectionofcoreantigenindonationsbeforeseroconversion.Transfusion.200242810321036.12.WidellA,MolnegrenV,PieksmaF,etal.DetectionofhepatitisCcoreantigeninserumorplasmaasamarkerofhepatitisCviraemiaintheserologicalwindowphase.TransfusMed.200212210711313.MuerhoffAS,JiangL,ShahDO,etal.DetectionofHCVcoreantigeninhumanserumandplasmawithanautomatedchemiluminescentimmunoassay.Transfusion.2002423349356.14.WidellA,MolnegrenV,PieksmaF,etal.DetectionofhepatitisCcoreantigeninserumorplasmaasamarkerofhepatitisCviraemiaintheserologicalwindowphase.TransfusMed.200212210713.15.AoyagiK,IidaK,OhueC,etal.PerformanceofaconventionalenzymeimmunoassayforhepatitisCviruscoreantigenintheearlyphasesofhepatitisCinfection.ClinLab.2001473411927.16.CourouceAM,LeMarrecN,BouchardeauF,EfficacyofHCVcoreantigendetectionduringthepreseroconversionperiod.Transfusion.2000401011981202.17.AoyagiK,OhueC,IidaK,DevelopmentofasimpleandhighlysensitiveenzymeimmunoassayforhepatitisCviruscoreantigen.JClinMicrobiol.199937618021808.18.TanakaE,OhueC,AoyagiK,etal.EvaluationofanewenzymeimmunoassayforhepatitisCvirusHCVcoreantigenwithclinicalsensitivityapproximatingthatofgenomicamplificationofHCVRNA.Hepatology.200032238893.19.IijimaA,TanakaE,Kobayashi,etal.RelationshipbetweenhistologicalprognosisofchronichepatitisCandamountofhepatitisCviruscoreproteininserum.JGastroenterolHepatol.20001533119.20.TanakaE,KiyosawaK,MatsumotoA,etal.SerumlevelsofhepatitisCviruscoreproteininpatientswithchronichepatitisCtreatedwithinterferonalfa.Hepatology.199623613301333.21.KashiwakumaT,HasegawaA,KajitaT,etal.DetectionofhepatitisCvirusspecificcoreproteininserumofpatientsbyasensitivefluorescenceenzymeimmunoassayFEIA.JImmunolMethods.199619017989.22.IcardiG,AnsaldiF,BruzzoneBM,etal.NovelapproachtoreducethehepatitisCvirusHCVwindowperiodclinicalevaluationofanewenzymelinkedimmunosorbentassaforHCVcoreantigen.JClinMicorbio.200139931103114.
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