丙型肝炎病毒核心抗原检测技术国内外临床研究应用情况.doc

丙型肝炎病毒核心抗原检测技术国内外临床研究应用情况（综述）张贺秋丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（hepatitisCvirus,HCV）感染引起的一种重要的世界性传染病。一般地，1520%左右的HCV感染者为自限性感染，可以很快的康复。但是，也有8085%的感染者发展为慢性丙型肝炎，其中又有20%的可发展为肝纤维化，最终有45%的肝纤维化患者发生肝细胞性肝癌，危害十分严重。目前，慢性丙型肝炎除了干扰素有确切的疗效外，尚无其它有效的治疗药物。国际上近来报道，PEG修饰的干扰素加利巴韦林联合治疗可在4050%左右的患者获得较好的反应，但也有疗程长、价格昂贵、毒副作用大以及易反弹等缺点。此外，丙型肝炎疫苗的研制也因HCV高度变异而困难重重，短期内难有突破性进展。因此，尽早检出HCV感染者，阻断HCV的传播是当务之急。1HCV检测技术的现状HCV一般通过被HCV污染的血液和血液制品传播，现在常用的HCV检测技术有两种方式：（1）间接检测，主要检测抗HCV抗体；（2）直接检测，通过定性或定量检测HCV病毒粒子的组成成分确定病毒的存在，例如HCVRNA。这两种检测方式在确诊HCV感染，选择HCV感染者的治疗方案以及评价抗HCV治疗的疗效方面起到了关键作用。1.1抗HCV抗体的检测上世纪九十年代初，利用重组HCV抗原开发出了抗HCV抗体检测技术，即酶免疫分析（enzymeimmunoassays,EIAs）技术，已经发展到第三代。该技术可检测样本中针对不同HCV抗原（如C区、NS3区、NS4区和NS5区等）的混合抗体，目前检测的特异性已高达99%以上。由于缺乏更敏感的金标准，抗HCVEIA技术的敏感性还很难确定。在免疫健全的患者中，抗HCVEIA的检测敏感性高于99%，几乎所有的HCV感染者都可以被检测出来。但对于正进行血液透析的患者和严重免疫缺损患者，虽然其体内有HCV复制活跃，但EIA检测可能就是阴性结果。为此，某些厂商又开发了免疫条带分析作为确证实验，如Ortho公司开发的RIBA等。因第三代EIA在临床检测中表现良好，目前免疫条带分析在临床的实际应用的意义已不是很大。但因为在血站EIA检测结果阳性的阳性预测值（positivepredictivevalue,PPV）相对较低，其在血站仍然有很大的用武之地。1.2HCVRNA的检测1.2.1定性检测HCVRNA定性检测中HCVRNA的存在被视为HCV病毒复制的标志。因其敏感性比现有的任何一种定量检测方法都要高，定性检测HCVRNA是非常有用的一种直接检测HCV是否存在的技术。该技术基于利用RT-PCR技术或转录介导的扩增（transcription-mediatedamplification,TMA）技术特异性扩增HCV基因组RNA序列，又称为核酸扩增（nucleicacidamplificationtechniques,NAT）技术。目前市面上的HCVRNA定性检测试剂的检测临界值为50HCVRNAIU/mL和10IU/mL，主要产品有Roche公司的CobasAmplicororAmplicorHCVTest,Version2.0；Chiron公司基于TMA技术的ProcleixaHIV-1/HCV，可一个反应同时检测HIV-1RNA和HCVRNA。1.2.2定量检测HCVRNA样本中HCVRNA含量可通过NAT技术和信号扩增技术（分支DNA检测）来确定。目前市面上的HCVRNA定量检测试剂的最低检测临界值介于30IU/mL和615IU/mL之间，线性定量的上限在500,000IU/mL和7,700,000IU/mL之间。样本中病毒水平高于检测上限的，应稀释1/10或1/100后重新检测。HCVRNA定量检测结果不受HCV基因型的影响，而所谓的国际单位（internationalunit,IU）是按WHOHCVRNA标准参比血清来确定的。为了比较不同HCVRNA定量检测试剂的检测结果和在全球推广，在不久的将来所有的HCVRNA定量检测试剂都应该采用此标准。目前市面上的HCVRNA定量检测试剂主要产品有基于分支DNA技术的Bayer公司VersantHCVRNA3.0；基于竞争性PCR技术的Roche公司CobasAmplicororAmplicorHCVMonitorTest,Version2.0和Abbott公司LCxHCVRNAQuantitativeAssay。2现有常用检测技术的局限性2.1抗HCVEIA检测存在“窗口期”由于现有的第三代抗HCVEIA检测技术的特异性和敏感性已经很高，基本上能够检出所有的HCV感染者，使输血后丙型肝炎的发生率大大降低（美国在19971999年间为1/230,000，同期法国为1/700,000）。但是，在HCV感染后至抗HCV抗体产生之前还有一段约4070天的较长时期（平均66天）。此时，献血员已被感染并具有感染性，应用目前的第三代EIA检测试剂不能检出，称为感染后血清阳转前的窗口期（preseroconversionwindowphase,PWP）。PWP的存在，是输血安全的重要威胁之一，使受血者依然有经输入抗HCV筛选阴性的血液而感染HCV的危险，国内外已经有关于输入抗HCV筛选阴性的血液而感染HCV的报道。2.2HCVRNA检测难以普及由于在HCV感染后615天（平均11天）HCVRNA就在感染者血液中出现，并在血清阳转之前达到一个较高的水平，RNA滴度在100,000至100,000,000拷贝/mL之间。为了降低PWP感染的危险，缩短PWP以实现HCV感染的早期检测，许多国家引入敏感性很高的NAT检测技术对献血员进行常规筛选。敏感的NAT试剂可以检测出100至500份样品的混合血样中的HCVRNA。美国已开始对16至24份样品的混合血样进行NAT筛选，目前已经在16,300,000份血样中筛选出62份HCVRNA阳性血。尽管NAT检测在发达国家已经成功的筛选出了感染性献血员，但由于NAT技术需要昂贵精密的仪器、较高的实验技巧、试剂比较昂贵以及容易交叉污染导致假阳性偏高，使其很难推广到单个献血员，在发展中国家的应用也受到很大限制。3HCV核心抗原检测技术的进展3.1HCV核心抗原检测技术HCV核心抗原也是在HCV感染者体内出现的早期感染的标志，几乎与HCVRNA同时出现。目前已经开发出两种检测HCV核心抗原的ELISA检测试剂，一种是直接检测血清或血浆样品中的游离HCV核心抗原，另一种是检测血清或血浆样品中的总的HCV核心抗原。一般直接检测血清或血浆样品中的游离HCV核心抗原主要用于血液筛查以缩短窗口期，保证输血安全。而检测血清或血浆样品中总HCV核心抗原则用途较广，不仅可用于血液筛查，而且还可指导慢性丙型肝炎患者的治疗，判断预后。Abbott公司的Muerhoff等研究出了一种基于微球的自动化化学发光免疫分析：PRISMHCV核心抗原检测试剂，该方法首先以抗HCV核心抗原的单抗包被微球捕捉血清或血浆中的核心抗原，然后以丫啶色素结合的单抗检测捕获的抗原，利用单通道化学发光检测仪确定结果。检测14套血清阳转系列血清盘和1004名献血员的结果表明，该方法的特异性达99.9%，与HCVRNA检测的符合率为98.6%（69/70），平均可缩短窗口期32.7天，只比NAT检测时间晚0.66天（平均），这与其它报道HCV核心抗原检测检出时间比NAT检出时间晚1天左右是一致的。日本的Kashiwakuma等人也利用重组HCV核心抗原免疫BALB/c小鼠制备单抗建立了类似的荧光酶免疫分析技术，其所用的二抗是半乳糖苷酶结合的单抗，与相应的底物作用检测荧光。初步检测结果表明，该方法检测的HCV核心抗原定量与HCVRNA水平显著相关，可用于总HCV核心抗原的定量检测。3.1游离HCV核心抗原检测技术及应用游离HCV抗原检测试剂尤其适于在血清阳转前使用，可缩短HCV感染检测的窗口期约4050天，应用于献血员筛查可显著改善输血安全。Ortho公司的Peterson等人为了评价一种可检测血清中HCV核心抗原的ELISA检测试剂原型，通过24份血清阳转系列血清对抗HCV抗体、HCVRNA和HCV抗原出现时间进行了比较。结果表明，83%（20/24）的样品中HCV核心抗原与HCVRNA同时检出。HCV核心抗原的平均检出时间只比HCVRNA晚约1天。总体来讲，87%的HCVRNA阳性样品中含有可检测到的HCV核心抗原。Peterson等认为，HCV核心抗原可在HCV感染后抗体阴性的窗口期通过常规的ELISA技术检出，对于缩短检测窗口期非常有用。军事医学科学院与景达基因公司的张贺秋等人利用其研制的HCV核心抗原ELISA检测试剂盒，通过对2.75万人献浆员，采用抗HCV、HCVRNA和HCVcAg检测试剂进行连续两年的HCV感染状况跟踪研究。研究表明，对两年内确诊的11例HCV感染，HCV核心抗原诊断试剂、HCVRNA检测试剂较HCV抗体检测试剂对HCV感染后的检出时间缩短。HCV核心抗原诊断试剂较HCV抗体检测对HCV感染的阳性检测提前1468天，平均35.2天；HCVRNA诊断试剂较HCV抗体检测时间对HCV感染的阳性检测提前1968天，平均39.3天；HCVRNA诊断试剂较HCV抗原检测对HCV感染的阳性检测提前017天，平均4.1天。说明HCV抗原检测是一种适合我国国情缩短检测“窗口期”的简单有效经济的方法。Ortho公司、景达基因公司推出了商业化的游离HCV核心抗原ELISA检测试剂，资料显示试剂可比已有的HCV抗体检测试剂早35天以上检测出HCV感染。更为重要的是，该方法操作快速、简便，可在3小时内获得结果，并且与现有的仪器设备兼容，适合用于献血员的大规模筛选。然而，一旦HCV感染者体内产生抗体发生血清阳转，抗核心抗原抗体与HCVcAg之间便可形成抗原抗体复合物，其检测的敏感性就大大降低了。3.2总HCV核心抗原检测技术及应用为了克服游离HCV核心抗原检测试剂的不足，Aoyagi等对样品进行了一步简单的预处理，将免疫复合物解离及病毒颗粒裂解后再行检测。预处理的方法十分简便，可以很好地与常规ELISA方法整合，使该方法可在更广泛的人群中应用，也进一步扩大了方法的用途。Ortho公司开发了可定量检测血清或血浆中总HCV核心抗原的检测试剂Track-C，无论抗HCV抗体存在与否均可使用。Laperche等的研究发现，其敏感性比第一代用于血液筛查的检测游离HCV核心抗原ELISA试剂还要高，可以作为NAT试剂的替代产品用于窗口期HCV感染的诊断。Veillon等人通过与两种HCVRNA定量分析方法：QuantiplexHCVRNA2.0（bDNAv2.0）或VersantHCVRNA3.0（bDNAv3.0）和CobasAmplicorHCVMonitorversion2.0（HCMV2.0）进行比较研究，对该方法的敏感性、特异性和可重复性进行了评价。结果表明，对于不同的HCV基因型样品，该方法都取得了较好的结果，检测的批内和批间变异系数分别为5.11%和9.95%，在献血员中检测的特异性为99.5%，与两种HCVRNA定量方法相比较有较好的相关性。Maynard等为确定总HCV核心抗原定量检测在预测PEG修饰的干扰素和利巴韦林联合治疗的反应性上的效果，利用Ortho公司的总HCV核心抗原检测试剂和HCVRNA定量检测技术共同检测了116位接受联合治疗的患者的病毒血症情况。他们发现，在治疗前和治疗3个月后，总HCV核心抗原检测的反应预测性与HCVRNA检测相同，似乎总HCV核心抗原检测的效果在治疗早期（4周以内）要优于HCVRNA检测，在3个月后达到最佳效果。与HCVRNA检测相比，在监测治疗和预测PEG修饰的干扰素和利巴韦林联合治疗的反应性上，监测血清中总HCV核心抗原水平是一种精确和可靠的方法，可代替HCVRNA定量检测。4结语抗HCV抗体检测、HCVRNA检测和HCV基因分型技术已在临床和血站广为应用，为保证血供安全做出了重要贡献。而HCV核心抗原检测是近两年得到快速发展的一种新的检测HCV复制的间接指标，它的出现使克服抗HCVEIA筛选的局限缩短窗口期成为可能，而且总HCV核心抗原检测还可用于监控慢性丙型肝炎患者体内病毒载量，评价抗HCV治疗的效果。参考文献1.ZanettiAR,RomanoL,brunetoM,etal.TotalHCVcoreantigenassay:anewmarkerofhepatitisCviremiaformonitoringtheprogressoftherapy.JMedvirol,2003；70:27-30.2.PetersonJ,GrenG,IidaK,etal.DetectionofhepatitisCcoreantigenintheantibodynegativewindowphaseofhepatitsCinfection.VoxSang,2000,78:80-85.3.LapercheS,LeMarrecN,SimonN,etal.AnewHCVcoreantigenassaybasedondisassociationofimmunecomplexes:analternativetomolecularbiologyinthediagnosisofearlyHCVinfection.Transfusion.2003,43(7):958-62.4.VeillonP,Payanc,PicchioG,etal.ComparativeevaluationofthetotalhepatitisCviruscoreantigen,branched-DNA,andAmplicorMonitorassaysindeterminingviremiaforpatientswithchronichepatitisCduringinterferonplusribavirincombinationtherapy.JclinMicrobiol,2003,41(7):3212-3220.5.MaynardM,PradatP,BerthillonP,etal.ClinicalrelevanceoftotalHCVcoreantigentestingforhepatitisCmonitoringandforpredictingpatientsresponsetotherapy.JViralHepat.2003；10(4):318-23.6.ZanettiAR,RomanoL,BrunettoM,etal.TotalHCVcoreantigenassay:anewmarkerofhepatitisCviremiaformonitoringtheprogressoftherapy.JMedVirol.2003；70(1):27-30.7.EirasA,FrancoE,MontoroJA,etal.HCVNAT(minipoolRT-PCR)andHCVcoreantigenELISA.Transfusion.2003；43(1):118；authorreply118-119.8.LaggingLM,GarciaCE,WestinJ,etal.ComparisonofserumhepatitisCvirusRNAandcoreantigenconcentrationsanddeterminationofwhetherlevelsareassociatedwithliverhistologyoraffectedbyspecimenstoragetime.JClinMicrobiol.2002；40(11):4224-4229.9.Bouvier-aliasMPatelK,DahariH,etal.ClinicalutilityoftotalHCVcoreantigenquantification:anewindirectmarkerofHCVreplication.Hepatology,2002；36(1):211-218.10.NublingCM,UngerG,ChudyM,etal.SensitivityofHCVcoreantigenandHCVRNAdetectionintheearlyinfectionphase.Transfusion.2002；42(8):1037-1045.11.GrantPR,SimsCM,TedderRS.QuantificationofHCVRNAlevelsanddetectionofcoreantigenindonationsbeforeseroconversion.Transfusion.2002；42(8):1032-1036.12.WidellA,MolnegrenV,PieksmaF,etal.DetectionofhepatitisCcoreantigeninserumorplasmaasamarkerofhepatitisCviraemiaintheserologicalwindow-phase.TransfusMed.2002；12(2):107-11313.MuerhoffAS,JiangL,ShahDO,etal.DetectionofHCVcoreantigeninhumanserumandplasmawithanautomatedchemiluminescentimmunoassay.Transfusion.2002；42(3):349-356.14.WidellA,MolnegrenV,PieksmaF,etal.DetectionofhepatitisCcoreantigeninserumorplasmaasamarkerofhepatitisCviraemiaintheserologicalwindow-phase.TransfusMed.2002；12(2):107-13.15.AoyagiK,IidaK,OhueC,etal.PerformanceofaconventionalenzymeimmunoassayforhepatitisCviruscoreantigenintheearlyphasesofhepatitisCinfection.ClinLab.2001；47(3-4):119-27.16.CourouceAM,LeMarrecN,BouchardeauF,EfficacyofHCVcoreantigendetectionduringthepreseroconversionperiod.Transfusion.2000；40(10):1198-1202.17.AoyagiK,OhueC,IidaK,DevelopmentofasimpleandhighlysensitiveenzymeimmunoassayforhepatitisCviruscoreantigen.JClinMicrobiol.1999；37(6):1802-1808.18.TanakaE,OhueC,AoyagiK,etal.Evaluationo