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不同剂量氟尿嘧啶缓释植入剂腹腔给药治疗H22小鼠腹水瘤疗效的实验研究1通讯作者,EMAILQINSK@CSCO.ORG.CN2210002解放军八一医院全军肿瘤中心3210042江苏先声药物研究有限公司研究院4210009东南大学附属中大医院肿瘤科210009南京东南大学医学院梅魁敏,秦叔逵1,2,殷晓进3,陈亚利3,魏红梅2,张改琴,李苏宜4【摘要】目的探讨不同剂量氟尿嘧啶缓释植入剂(中人氟安)治疗小鼠恶性腹腔积液的有效性和安全性。方法采用肝癌H22细胞株建立小鼠腹水瘤模型,68只成模小鼠随机分为4组,即赋型剂对照组、中人氟安低剂量组(2MG/只)、中剂量组(4MG/只)和高剂量组(6MG/只)。观察小鼠的一般状态、体重变化和生存期,计算腹水体积并计数腹水内肿瘤细胞,流式细胞仪检测腹水肿瘤细胞凋亡及细胞周期。结果与对照组相比,中人氟安三个剂量组小鼠的一般状态良好,体重增长缓慢,全身症状出现较晚,中位生存期均有延长(16、20、20天VS.13天,P<001),但中、高剂量组间生存期差异无统计学意义(P>005)。实验第13天,中人氟安低、中、高3个剂量组的腹水体积(ML)分别为9209、5610和5911,每毫升中的肿瘤细胞数分别为(1011131)108、(725100)108和(747111)108,均少于对照组的(13315)ML和(1473125)108(P均<001);腹水肿瘤细胞的凋亡率分别为(14814)%、(23926)%和(21531)%,S期比例分别为(3123326)%、(5017460)%和(4708411)%,均高于对照组的(7619)%和(2057408)%(P均<001),其中中、高剂量组与低剂量组的差异具有统计学意义(P<005),而中、高剂量组差异无统计学意义(P>005)。结论中人氟安对于实验小鼠H22腹水瘤的形成具有良好的控制作用,可以延长腹水瘤小鼠的生存期,且安全性好,以中剂量组的效果最佳。因此,提示在临床上对于恶性腹腔积液和腹膜转移的患者,可以应用中人氟安进行局部治疗,但需选择合适的剂量。【关键词】氟尿嘧啶缓释植入剂/中人氟安;腹腔内化疗;H22细胞株;恶性腹腔积液中图分类号R7336文献标识码A文章编号1009-0460(2011)05-0389-04EFFECTOFDIFFERENTDOSESOFSUSTAINEDRELEASEFLUOROURACILONMICEBEARINGH22ASCITICTUMORINTRAPERITONEALLYMEIKUIMIN,QINSHUKUI,YINXIAOJIN,CHENYALI,WEIHONGMEI,ZHANGGAIQIN,LISUYI.MEDICALCOLLEGE,SOUTHEASTUNIVERSITY,NANJING210009,CHINACORRESPONDINGAUTHORQINSHUKUI,EMAILQINSK@CSCO.ORG.CN【ABSTRACT】OBJECTIVETOINVESTIGATETHEEFFECTOFSUSTAINEDRELEASEFLUOROURACIL(SINOFUAN)INJECTEDINTRAPERITONEALLYONTHEMICEWITHASCITICTUMOR.METHODSMOUSEMODELSBEARINGASCITESTUMORSWEREESTABLISHEDVIAINJECTINGH22CELLSINTRAPERITONEALLY.SIXTYEIGHTMODELMICEWEREASSIGNEDINTO4GROUPSRANDOMLY,THECONTROLGROUP,THELOWDOSE(2MG),MEDIUMDOSE(4MG),HIGHDOSE(6MG)SINOFUANGROUP.THEMICE’SGENERALSTATES,BODYWEIGHTANDSURVIVALTIMEWEREOBSERVED.THECUMULATIVEASCITESVOLUMEANDNUMBEROFTUMORCELLSWERECALCULATED.THEAPOPTOSISRATESANDCELLCYCLEOFTUMORCELLSWEREANALYZEDWITHFLOWCYTOMETRY.RESULTSCOMPAREDWITHTHECONTROLGROUP,THETHREESINOFUANGROUPSSHOWEDBETTERGENERALSTATE,SLOWERBODYWEIGHTINCREASEANDLONGERMEDIUMSURVIVAL(160,200,200VERSE130DAYS;P<001).ASCITESACCUMULATIONOFTHREESINOFUANGROUPS(LOW,MEDIUM,HIGHDOSE)WERE9209ML,5610MLAND5911ML;THECOUNTOFASCITESTUMORCELLSPERMILLILITERWERE(1011131)108,(725100)108AND(747111)108,ALLOFWHICHWERELOWERTHANTHATOFCONTROLGROUP(13315MLAND1473125108),WITHSIGNIFICANTDIFFERENCES(P<001).THEAPOPTOSISRATESWERE14814%,23926%AND21531%RESPECTIVELY,ANDSPHASEPERCENTAGESWERE3123326%,5017460%AND4708411%,ALLOFWHICHWEREHIGHERTHANTHATOFCONTROL584临床肿瘤学杂志2011年5月第16卷第5期CHINESECLINICALONCOLOGY,MAY2011,VOL.16,NO.5GROUP(7619%AND2057408%),SHOWINGSIGNIFICANTDIFFERENCES(P<001).THEDIFFERENCESBETWEENTHEMEDIUMANDHIGHDOSEGROUPWERENOTSIGNIFICANT(P>005).CONCLUSIONSINOFUAN,ESPECIALLYINMEDIUMDOSE,SHOWSAGOODEFFECTANDSAFETYINTHETREATMENTOFTHEMICEBEARINGH22ASCITESTUMORS.ITSUGGESTSTHATSINOFUANMAYBEAPPLIEDTOTREATTHEMALIGNANTASCITESANDPERITONEALMETASTASESINAPPROPRIATEDOSES.【KEYWORDS】SUSTAINEDRELEASEFLUOROURACILFORIMPLANT/SINOFUAN;INTRAPERITONEALCHEMOTHERAPY;HEPATOCARCINOMA22CELLLINE;MALIGNANTASCITES恶性腹腔积液和腹膜转移是恶性肿瘤晚期的常见并发症,严重影响患者的生活质量,虽然有关治疗方法较多,但相当一部分治疗棘手,总体疗效不尽人意,正在探索寻求新的治疗方法和药物。氟尿嘧啶缓释植入剂(中人氟安)腹腔内给药后药代动力学优势明显,有效作用时间长达15天,远远超过氟尿嘧啶普通制剂(5FU)[1],因此在治疗恶性腹腔积液和防治腹膜转移方面具有潜在的临床价值。本实验拟通过腹腔内给予不同剂量中人氟安,观察其对H22小鼠腹水瘤变化,并探讨其最佳剂量,为临床上腹腔内用药提供实验依据。1材料与方法11细胞株和实验动物ICR小鼠购自上海斯莱克实验动物公司,雌性,6周龄,体重(202)G,饲养于SPF级环境中,动物许可证号SCXK(沪)20070005。小鼠肝癌H22细胞株由中科院上海细胞所提供。12主要药物、试剂和仪器中人氟安购自芜湖中人药业公司(2MG/粒,国药准字H20030345,生产批号20090416);赋形剂对照品购自芜湖中人药业公司;ANNEXINⅤFITC细胞凋亡试剂盒、细胞周期试剂盒均购自南京凯基生物技术有限公司;VANTAGESE型流式细胞仪购自美国BD公司。13小鼠H22腹水瘤模型的建立H22细胞株复苏培养传代后取对数生长期的细胞,经RPMI1640稀释制成单细胞悬液,02ML细胞悬液腹腔注射于2只ICR小鼠。取接种8天后的ICR小鼠,抽取小鼠的腹水,PBS稀释和调整细胞浓度(10107/ML),取02ML注入68只小鼠腹腔,作为实验第1天。14实验分组和给药方法68只腹水瘤模型小鼠随机分为4组,每组17只(5只用于检测,另12只用于生存期观察)赋形剂对照组、中人氟安低剂量组、中剂量组和高剂量组。实验第4天,对照组腹腔内注射缓释剂对照品2粒,中人氟安低剂量组为腹腔内注射中人氟安1粒(含5FU2MG),中剂量组为中人氟安2粒(含5FU4MG),高剂量组为中人氟安3粒(含5FU6MG)。15检测指标和检测方法151观察小鼠的一般状态、体重变化和生存期实验过程中隔日观察各组小鼠的饮食、精神状态和体型外观的变化,隔日监测每组小鼠的体重并记录,绘制小鼠体重变化曲线。记录各组小鼠的存活时间,KAPLANMEIER法绘制生存期曲线。152检测小鼠腹水体积、腹水中的肿瘤细胞数实验第13天,以颈椎脱位法随机处死每组5只小鼠。无菌条件下开腹,收集腹水,计算体积,并进行相关指标的检测。每份标本以4℃PBS稀释10倍,按白细胞计数法记录每毫升腹水中的肿瘤细胞数。153流式细胞仪检测腹水标本处理同上,以4℃PBS调整细胞浓度为20105个/ML,按照ANNEXINⅤFITC试剂盒说明书,检测肿瘤细胞的凋亡率;调整细胞浓度为20106/ML,按照细胞周期试剂盒说明书,检测肿瘤细胞周期分布。16统计学分析采用SPSS130软件,实验数据以珋XS表示。用单因素方差分析,组间多重比较用LSD法,用KAPLANMEIER法绘制生存期曲线。以P<005为差异具有统计学意义。2结果21各组小鼠的生活状态、体重变化和生存期接种后第1~4天对照组小鼠的体重随腹水的增多呈快速增加,但一般状态尚可,第5天后小鼠逐渐表现为精神萎靡不振、呆滞少动和反应性差,进食进水减少,晚期腹部极度膨隆,呈恶液质状态,至第12天对照组小鼠开始死亡,第18天全部死亡。与对照组相比,用药后中人氟安各剂量组小鼠的一般状态良好,腹水生长缓慢,全身症状出现较晚,尤以中剂量组最明显,第17天开始死亡,直至第24天全部死亡。与低、中剂量组相比,高剂量组小鼠出现化疗相关毒副反应的比例较高(1176%、1765%VS.3529%,P<005),如出现落毛、粪便稀,甚至血样便等。684临床肿瘤学杂志2011年5月第16卷第5期CHINESECLINICALONCOLOGY,MAY2011,VOL.16,NO.5接种后第1~4天各组小鼠体重均增加较快;与对照组相比,给药后中人氟安各剂量组体重增加较平缓,以中剂量组和高剂量组明显;中、高剂量组体重增加速度相似。见图1。图1中人氟安对H22腹水瘤小鼠体重变化的影响对照组和中人氟安低、中、高剂量组小鼠的中位生存期分别为13、16、20和20天。与对照组相比,中人氟安各剂量组的生存期均有明显延长(P均<001);其中,中、高剂量组较低剂量组延长(P<005),但是中、高剂量组差异无统计学意义(P>005)。见表1。表1中人氟安对H22腹水瘤小鼠生存期的影响(天)组别MOS95%CI对照组131216~1384中人氟安低剂量组16▲1488~1712▲中人氟安中剂量组20▲1840~2160▲中人氟安高剂量组20▲1893~2107▲注与对照组比较,▲P<005;与低剂量组比较,P<00522中人氟安对小鼠腹水生长和腹水中肿瘤细胞数的影响中人氟安各剂量组的腹水体积和每毫升腹水肿瘤细胞数均较对照组减少(P均<001);其中,中、高剂量组较低剂量组减少(P<005),而中、高剂量组差异不显著(P>005)。见表2。23中人氟安对小鼠腹水中肿瘤细胞凋亡和周期分布的影响中人氟安各剂量组的腹水肿瘤细胞凋亡率均较对照组明显增加(P均<001),其中中、高剂量组较低剂量组高(P<005),而中、高剂量组间差异不明显(P>005)。中人氟安各剂量组的腹水肿瘤细胞S期比例均较对照组明显增加(P均<表2中人氟安对H22腹水瘤小鼠腹水体积和腹水中肿瘤细胞数的影响(珋XS)组别腹水体积(ML)肿瘤细胞数(108/ML)对照组133151473125中人氟安低剂量组9209▲1011131▲中人氟安中剂量组5610▲725100▲中人氟安高剂量组5911▲742111▲注与对照组比较,▲P<005;与低剂量组比较,P<005001);其中中、高剂量组较低剂量组高(P<005),而中、高剂量组差异不显著(P>005)。见表3。表3中人氟安对H22腹水瘤凋亡和细胞周期的影响(珋XS,%)组别凋亡率S期比例对照组76192057408中人氟安低剂量组14814A3123326A中人氟安中剂量组23926AB5017460AB中人氟安高剂量组21531AB4708411AB注与对照组比较,AP<005;与低剂量组比较,BP<0053讨论恶性腹腔积液及腹膜转移是由恶性肿瘤累及腹膜或腹膜原发肿瘤所致,据统计约50%晚期或复发性腹腔恶性肿瘤患者在其病程中可能出现恶性腹腔积液或其他表现[2]。多数患者的中位生存期为57个月,消化道来源的预后更差,仅为3个月[3]。目前,临床上主要的治疗手段有穿刺抽液或置管引流、利尿、腹腔内灌注化疗药物或免疫制剂以及现代中药制剂等,其中腹腔内化疗即在腹腔内注入化疗药物,直接杀灭癌细胞,因具有特殊的药代动力学特点及诸多优点,已成为治疗恶性腹腔积液的重要方法。一般来说,化疗药物的疗效和浓度及作用时间呈正相关。由于人体腹膜血液屏障的存在,化疗药物进入腹腔后一方面其腹腔内浓度远远高于血液浓度,另一方面其作用时间也大大延长。研究发现,化疗药物腹腔注射后不仅其药物浓度曲线下面积(AUC)是静脉给药的10~1000倍[4],因此腹腔内化疗使得肿瘤细胞长时间直接浸泡在高浓度的化疗药液中,增加了其杀伤能力,另外,低体循环药物浓度低使得全身毒性大大降低。尽管腹腔内化疗具有诸多优点,但其整体疗效却尚不令人满意,同时还存在较多局部毒副反应,因此迫切需要对常规的腹腔784临床肿瘤学杂志2011年5月第16卷第5期CHINESECLINICALONCOLOGY,MAY2011,VOL.16,NO.5内化疗方法及药物进行改进以寻求更加安全有效的治疗效果。5FU是最常用的腹腔内化疗药物之一,作为细胞周期特异性化疗药物,其疗效不仅与药物浓度有关,而且与作用时间更加密切相关。研究[56]表明5FU48H持续滴注方式较冲击疗法方式提高了晚期直肠癌患者的缓解率和无进展生存期,同时安全性也更好。中人氟安采用5FU为原料,高分子聚合物为骨架制成,植入体内后,体液逐层渗入药粒微囊,溶解膜内的药物,在膜内形成高浓度,在浓度梯度的作用下向膜外扩散(即渗透扩散机制),释药时间的长短由膜层数控制,形成较稳定的释放速度。洪艳艳等[1]的研究显示恶性胸腹水患者腔内植入中人氟安后,胸腹水中5FU在4~8H达峰值,有效作用时间达到15天以上。由此可以看出,腹腔内给予中人氟安在治疗恶性腹腔积液方面具有潜在的临床应用价值。实验通过腹腔内给予不同剂量中人氟安,观察其对小鼠腹水瘤的抑制作用,探讨不同剂量的疗效,寻找合适的剂量,为临床提供实验依据。实验结果表明不同剂量的中人氟安对小鼠腹水瘤均具有抑制作用,改善了腹水瘤小鼠的一般生活状态,延缓了腹水生成,延长了生存。实验第13天时中人氟安各剂量组的腹水量均较对照组少(P<001),且腹水中的肿瘤细胞密度也较低(P<001)。中人氟安三个剂量组中以中剂量组(4MG/只)的效果为佳,腹水瘤小鼠的中位生存可长达20天,而对照组仅为13天。虽然中人氟安中、高剂量组的中位生存期无明显差异(20VS.20天,P>005),但高剂量组小鼠出现毒副反应的比例较高(3529%VS.1765%,P<005),说明更高剂量的中人氟安不仅不能延长生存,反而增加毒副反应。研究表明,5FU的抗肿瘤作用主要是通过其代谢产物5氟尿嘧啶脱氧核苷酸(5FDUMP)干扰细胞核酸代谢导致肿瘤细胞凋亡及阻滞细胞周期使其停滞在S期[78]。本实验通过检测腹水中肿瘤细胞的凋亡率与细胞周期S期比例来探讨不同剂量的中人氟安对小鼠腹水瘤凋亡和细胞周期的影响,结果发现,中人氟安低、中、高剂量组对小鼠腹水中肿瘤细胞的凋亡率和S期比例呈先明显升高后略下降的趋势,其中中、高剂量组的凋亡率分别为(23926)%和(21531)%,S期比例分别为(5017460)%和(4708411)%,但差异无统计学意义(P>005)。因此需要指出的是,超过一定浓度后进一步增加中人氟安的剂量并不能增加腹水中肿瘤细胞的凋亡率与S期比例。综上所述,本研究表明氟尿嘧啶缓释植入剂(中人氟安)对实验小鼠H22腹水瘤的形成具有良好的抑制作用,可以延长腹水瘤小鼠的生存期,且安全性好,以中剂量组的效果最佳。因此,提示在临床上对于恶性腹腔积液和腹膜转移的患者,可以应用中人氟安进行局部治疗,但需选择合适的剂量。至于中人氟安在有效性与安全性方面是否比普通的5FU注射液具有优越性以及联合其他药物能否增加疗效,值得进一步研究。参考文献[1]洪艳艳,陈振东,张明军,等.氟尿嘧啶植入剂治疗恶性胸腹水的药代动力学研究[J].中国临床药理学杂志,2009,25(4)298-301.[2]SMITHEM,JAYSONGC.THECURRENTANDFUTUREMANAGEMENTOFMALIGNANTASCITES[J].CLINONCOL(RCOILRADIOL),2003,15(2)59-72.[3]AYANTUNDEAA,PARSONSSL.PATTERNANDPROGNOSTICFACTORSINPATIENTSWITHMALIGNANTASCITESARETROSPECTIVESTUDY[J].ANNONCOL,2007,18(5)945-949.[4]SUGARBAKERPH,MORAJT,CARMIGNANIP,ETAL.UPDATEONCHEMOTHERAPEUTICAGENTSUTILIZEDFORPERIOPERATIVEINTRAPERITONEALCHEMOTHERAPY[J].ONCOLOGIST,2005,10(2)112-122.[5]ANDRET,COLINP,LOUVETC,ETAL.SEMIMONTHLYVERSUSMONTHLYREGIMENOFFLUOROURACILANDLEUCOVORINADMINISTEREDFOR24OR36WEEKSASADJUVANTTHERAPYINSTAGEIIANDIIICOLONCANCERRESULTSOFARANDOMIZEDTRIAL[J].JCLINONCOL,2003,21(15)2896-2903.[6]DEGRAMONTA,BOSSETJF,MILANC,ETAL.RANDOMIZEDTRIALCOMPARINGMONTHLYLOWDOSELEUCOVORINANDFLUOROURACILBOLUSWITHBIMONTHLYHIGHDOSELEUCOVORINANDFLUOROURACILBOLUSPLUSCONTINUOUSINFUSIONFORADVANCEDCOLORECTALCANCERAFRENCHINTERGROUPSTUDY[J].JCLINONCOL,1997,15(2)808-815.[7]ODWYERPJ,KINGSA,HOTHDF,ETAL.ROLEOFTHYMIDINEINBIOCHEMICALMODULATIONAREVIEW[J].CANCERRES,1987,47(15)3911-3919.[8]INADAT,ICHIKAWAA,IGARASHIS,ETAL.EFFECTOFPREOPERATIVE5FLUOROURACILONAPOPTOSISOFADVANCEDGASTRICCANCER[J].JSURGONCOL,1997,65(2)106-110.收稿日期2011-01-15;修回日期2011-02-19884临床肿瘤学杂志2011年5月第16卷第5期CHINESECLINICALONCOLOGY,MAY2011,VOL.16,NO.5
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