茶叶抗氧化能力测定的流动注射化学发光法研究.pdf

中国茶叶加工2009，（1）随着社会生活水平的大幅度提高，人们越来越追求既营养又健康的饮食。抗氧化饮食因为其所提供的抗氧化性物质能够清除体内过多的活性氧自由基，起到延缓衰老、增强人体抵抗力的作用，更加符合当前的消费理念。茶叶中所富含的茶多酚除了具有抗癌1、抗突变2等药理功能外，还具有显著的抗氧化功能3。体外测定茶叶抗氧化性的方法主要有FRAP(Ferric-reducingantioxidantpower)、TRAP(totalradicaltrappingantioxidantparameter)、ORAC(oxygenradicalabsorbingcapacity)、TEAC(thetroloxequivalentantioxidantcapacity)、ECL(enhancedchemiluminescence)、DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)等方法4,5,6,7，其中化学发光法通常是在碱性条件下利用抗氧化物质加入前后，抑制氧化成份攻击鲁米诺化学发光的差值来衡量物质的抗氧化性。但是这些方法存在测定条件较苛刻，或测定耗时，不便于快速测定。流动注射分析(FIA,flowinjectionanalysis)主要是一种利用化学反应在未达到平衡的条件下建立的一种快速、高度重现性的技术方法。将该方法与化学方法相结合，可以进行抗氧化测定，为了避免环境条件对发光体系及抗氧化物质稳定性干扰，我们摸拟了人体pH7.4的缓冲体系，同时利用Fenton反应产生的人体最具毒害作用的活性氧羟自由基攻击鲁米诺发光(见图1)，并对该体系进行了较为详细的实验设计优化。图1Fenton反应及羟自由基攻击鲁米诺化学发光机理1材料与方法1.1试验材料与试剂供试茶样为绿茶、红茶等数种，随机从市场购得；鲁米诺、30%双氧水(H2O2)、七水硫酸亚铁(FeSO47H2O)、乙二铵四乙酸二钠盐(EDTA2Na)、无水磷酸二氢钾(KH2PO4)、氢氧化钠(NaOH)，均为分析纯。1.2试验仪器IFFM-E型流动注射化学发光分析仪(西安瑞茶叶抗氧化能力测定的流动注射化学发光法研究*涂云飞毛志方杨秀芳（中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院杭州310020)摘要为了快速、准确的衡量茶叶抗氧化能力，本文采用了流动注射化学发光法对其进行测定，并以响应面实验设计对测定条件进了优化。结果表明，二价铁离子与双氧水方差分析极显著，并有高度协同作用。出于试验的可操作性及环保性，试验选择在25mL容量瓶中加入配制好的0.2mL鲁米诺及5mLFe2+-EDTA离子溶液并以缓冲溶液定量后作为载流，以去离子水配制的8.4%的双氧水作为进样环溶液进行分析；其峰形较好，发光强度适度，适合抗氧化性测定。同时以DPPH法与该方法进行了茶叶抗氧化性测定对比，在以IC50为指标的前提下，测定的茶叶抗氧化性趋势一致。关键词流动注射抗氧化性鲁米诺化学发光茶叶收稿日期：2009-01-03*基金项目：浙江省大型科学仪器设备协作共用平台科研计划项目(2008F70048)作者简介：涂云飞，男，(1981-)，主要从事茶叶深加工研究。中国茶叶加工2009，(1)：4245检测分析检测分析涂云飞：茶叶抗氧化能力测定的流动注射化学发光法研究称取茶样1.0g（精确到0.0001g），以1:50(m/v)沸水提取45min，其间每隔15min摇瓶一次，趁热抽滤，滤液冷至室温后用去离子水定容至200mL后,分别100L、200L、400L加入茶汤于流动相中，进行发光分析，并以如下公式计算发光抑制率(%)，同时以DPPH法对相应茶汤进行抗氧化性对比试验6；茶叶抗氧化性能以IC50来衡量。发光抑制率(%)=100，其中Fa为未加茶汤抗氧化物质的发光强度；Fb为加入茶汤抗氧化物质后的发光强度。1.3.4试验数据处理响应面优化采集数据利用专业统计软件Matlab进行分析；茶叶抗氧化试验数据采用平均数标准偏差表示(n=3)。2结果与讨论2.1响应面优化试验结果试验采用三因素二次响应面设计法对流动注射发光条件进行了优化；不同组合的运行结果如表3所示。表3组合设计试验实施表及试验结果12345678910111213141516171819201111-1-1-1-11.682-1.682000000000011-1-111-1-1001.682-1.682000000001-11-11-11-100001.682-1.68200000010.874.963.232.1011.315.952.832.124.456.6211.890.180.930.185.906.836.986.606.856.792.081.124.776.260.941.584.171.982.942.661.1724.221.454.060.293.036.332.081.972.46试验号Z1Z2Z3发光强度面积(104)变异系数CV(n=3)迈分析仪器有限公司)分析天平（梅特勒AL-204）1.3实验方法1.3.1流动注射化学发光体系的建立用pH7.4、0.05mol/L的KH2PO4-NaOH缓冲溶液，配制2.010-4mol/L的鲁米诺溶液及3.010-1mol/L的Fe2+-EDTA溶液；并用去离子水配制一定浓度的双氧水溶液。图2示意流动注射化学发光流程吸取一定量的Fe2+-EDTA溶液与鲁米诺溶液，置25mL容量瓶中，用该缓冲溶液定容至刻度，混匀后作为载流流动相；同时将配制好的双氧水注入进样环,按运行程序(表1)进行流动注射化学发光分析(图2)，以600V，50Hz，扩增1倍信号值条件，进行20次/sec自动归零数据采集。1.3.2流动注射化学发光响应面优化设计试验在单因素的基础上，确定了鲁米诺、Fe2+、H2O2三个因素的体积浓度变化范围，并通过响应面试验设计对三个主要影响因子进行了优化。试验因素编码表如表2所示。1.3.3茶叶样品的制备及抗氧化性测定表1流动注射化学发光仪运行参数程序步号123泵运行时间5秒10秒15秒主泵速度20转/min0转/min0转/min副泵速度30转/min30转/min50转/min重复次数113阀位LLR数据读取YYY主泵方向FFF副泵方向FFF跳转231注：蠕动泵用橡皮乳胶管内径为1mm表2因素编码表(=1.682)单位：ml10-1-10.8380.60.3620.2108.015.12.1870.21310.56773.4331注：为极值点，零水平中心值计算公式为(-+)/2；水平1计算公式为中心值-(-)/2。Z1(鲁米诺)Z2(Fe2+-EDTA)Z3(H2O2)因素水平Fa-FbFa43中国茶叶加工2009，（1）c1c2c3c1c2c3c4c5c6c7c8c4c5c9c10c3c1c4c5c6c7c8c9c10c11c12c1通过三因素方差分析(表4)，可以看出，因素鲁米诺对流动注射化学发光强度影响不显著，而Fe2+与H2O2两因子对发光强度影响较为显著，其中Fe2+离子的影响最为明显，并且与H2O2有协同作用。表4中，回归项方差分析显著，说明试验通过响应面设计所得出的回归方程相关性显著；因此在去除不显著因子鲁米诺的基础上，将因素回代并转换成加入相应体积后，所建立的回归方程为y=-1443.0432+1134.8323+17361.963+2736.272-38973.73(2、3分别为Fe2+、H2O2测定时所加体积，ml)由回归方程，因素Fe2+与H2O2的体积变化对应的化学发光强度三维响应面如图3所示。此图直观的说明了在试验浓度范围内，发光强度随着Fe2+浓度的增加而上升；但是H2O2浓度的增加，发光强度先增大，之后经历了一个平缓阶段后，反而降低。这一现象的原因可能是因为流动注射过程中，双氧水浓度较小时，两相密度相关不大且混合较充分，从而Fe2+的增加使得更多的羟自由基产生，攻击鲁米诺发光。随着H2O2浓度的增加，其密度也增加，致使两相不能得到更好的混合，减少了两相接触面上相应羟自由基的产生，而使发光强度降低。图3Fe2+与H2O2交互作用的化学发光强度响应曲面上述结果亦表明，随着相应试剂浓度的增大，发光强度也会成倍增加；但是要清除其发光强度一半(IC50)所需加入的茶汤体积或浓度也会相应增加。出于试验的可操作性及环保性，最终选择已配制好的Fe2+与鲁米诺分别为5mL与0.2mL分别用缓冲溶液定容至25mL容量瓶中，并以相应去离子水配制的8.4%的双氧水作为流动注射化学发光分析。2.2茶叶抗氧化性测定实验在空白0L800L的水加入后，发光强度基本没有改变的基础上，利用在2.1流动注射化学发光体系建立的发光条件，进行了茶叶的抗氧化性试验测定。茶汤的加入可以降低化学发光的强度(图4)；不同茶叶的抗氧化测定结果如表4所示。14只茶样中，绿茶的抗氧化性最强，红茶次之，这一次序的决定主要是因为不同茶样的茶多酚内含成分的组成及总量的不同8。而黑茶七子饼的抗氧化性在两种方法测定结果中不一致，可能是因为黑茶的加工工艺使得茶叶中的多酚类转化成抗氧化性较弱的原故，具体原因有待进一步的分析。3结论由流动注射化学发光所建立的测定条件过程，我们可以推断随着化学发光试剂相应浓度的加大，发光强度会进一步增加，但是本次试验在适度发光条件下，即可以进行茶叶抗氧化性测定。试表4因素方差分析及相应回归系数方差来源Z0Z1Z2Z3Z1Z2Z1Z3Z2Z3Z12Z22Z32回归残差Df111111111910SS(108)1.62132.2215.090.410.1149.50211.3016.19MS(108)1.62132.2215.090.410.1149.5023.481.62F1.0081.689.320.250.076.870.060.6930.5814.50F0.05(1,10)=4.96；显著性*F0.05(9,10)=3.02回归系数53779.63-3445.1731113.1810512.49-2268.381218.0411793.04840.732752.44-18362.3844图4茶汤加入前后发光强度的变化验采用了加入0.2mL鲁米诺溶液及5mLFe2+溶液于25mL容量瓶中作为载流，以去离子水配制的8.4%的双氧水作为进样环溶液进行发光分析，测定结果稳定。对比DPPH测定方法所得结果，说明了试验所建立的流动注射体外测定茶叶抗氧化具有可靠性与可比性；并且所用试剂绿色安全，所需试剂量小、操作方便。致谢：感谢王盈峰及其他科研人员在试验过程中给予的支持与帮助。参考文献1Isao,T.PreventiveeffectsofteaoncancerJ.FragranceJ.1990,11:54-61.2Chen,H.Y.Comparisonofantimutageniceffectofvariousteaextracts(green,oolong,pouchongandblacktea)J.J.FoodProt.1994,57:54-58.3沈生荣,金超芳,陈子元等.茶多酚及其儿茶素单体对过氧化氢诱导的线粒体通透性改变孔道开放的影响J.生物化学与生物物理进展.2001,28(6):098498.4AntonRietveldandSheilaWiseman.Antioxidanteffectsoftea:evidencefromhumanclinicaltrialsJ.Thejournalofnutrition.2003,S:32853292.5陈留记,杨贤强,沈生荣等.茶儿茶素清除活性氧自由基的机制J.浙江大学学报（农业与生命科学版）.2002,28(5):573574.6涂云飞,毛志方,周卫龙等.2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)法测定茶抗氧化性能条件的研究J.中国茶叶加工.2008,3:2930.7回瑞华,侯冬岩,刘晓媛等.绿茶及其饮料中茶多酚的光谱分析及抗氧化性能测定J.卫生研究.2005,34(6):752754.8AnesiniClaudia,FerraroGracielaE.,andFilipRosana.TotalPolyphenolContentandAntioxidantCapacityofCommerciallyAvailableTea(Camelliasinensis)inArgentinaJ.J.Agric.FoodChem.,2008,56(19):92259229.表5茶叶样品抗氧化性测定茶叶样品龙井1龙井2金毫滇红特级滇红祁红碎七子生饼开化龙顶安吉白茶龙井3祁红六级云南七子饼三杯香祁红三级小沱线性方程y=26.985Ln(x)-77.443y=27.749Ln(x)-80.328y=23.252Ln(x)-68.52y=21.103Ln(x)-63.431y=30.024Ln(x)-122.5y=34.741Ln(x)-155.08y=25.622Ln(x)-68.225y=27.977Ln(x)-89.207y=25.853Ln(x)-69.703y=25.82Ln(x)-94.431y=25.517L