超高效液相色谱! 串联质谱法同时检测口腔卫生用品中的硝基咪唑类药物.pdf

!#年$月!#$!%$&(!#!#$%&%()*$+,(-!*(.+/(0*+12&$&$(技术与应用)*+：#$()!&,-.$/$#!($!#$&$!通讯联系人：徐*娟，硕士，工程师$0123#：4#567389+#!,$42$基金项目：国家检验检疫行业标准制定计划项目（%$!%:#）$收稿日期：!#1#1#$超高效液相色谱!串联质谱法同时检测口腔卫生用品中的硝基咪唑类药物徐*娟!，*陈*捷，*邵琳智，*李*荀（广东出入境检验检疫局，广东广州$#,!(）摘要：建立了采用超高效液相色谱1串联质谱同时检测口腔卫生用品（牙膏及漱口水）中甲硝唑、替硝唑、奥硝唑、二甲硝咪唑和洛硝唑的方法。试样以-#；（体积分数）的甲酸水溶液,乙腈（%$.$，,）稀释，经高速离心后过滤膜净化，采用=#753#=#/色谱柱（#220!-#22，(-$!2）分离，以-#；甲酸水溶液和乙腈为流动相梯度洗脱，质谱检测，外标法定量。$种硝基咪唑类化合物在#-,-!9,?质量浓度范围内线性关系良好，相关系数!均不小于-%!；在#-、!-和#29,9加标水平的平均回收率为%#-$；#/；，相对标准偏差为#-#&；$-!；方法的定量限（?*A，以信噪比为#计）为!-29,9。该方法可靠、稳定，可满足口腔卫生用品中硝基咪唑类药物含量检测与确证的需要。关键词：超高效液相色谱1串联质谱法；硝基咪唑类药物；口腔卫生用品中图分类号：*,$/*文献标识码：B*文章编号：#1/)#(（!#）$1&$1&#$#%&()$*(*+($%*&,)-*.#/(*%).012#(#314.$%)!5#%+*%&)(6#.74,60%*&)$*2%)501!$)(,#&)/5#6$%*&#$%1CD/E8!，=F0%/3，-FB*?38GH3，?+CE8（#$%&(%&)%*!+,)-.*/%0123*.(%$%4#$!$%*.%25#!2$#，#$%&67(#!#$%&，87.%$）83/$%)6$：B2IHJK7IH532E#I8E5JI7238I38K2I783JG#，I383JG#，783JG#，783JG#8JJ32I73JG#387#H(938L(E#I7167K7284#3ME3J4H72I9176H(1I8J2255564I72I7(（D.?=1&-,&-）H5L8J#6J$NH526#O5J3#EIJO3IH-#；K723443J,4I83I73#（%$.$，,848I73KE9J8JK3#I7JO3IH221L78$NH567I38O54773JEI8=#753#=#/4#E28（#220!-#22，(-$!2）O3IHIH97J38I#EI38K-#；K723443J8J4I83I73#5IH2L3#6H55$NH8#(I5O7JI7238JL(D.?=1&-,&-8JME8I3K3JL(PI78#5I8J7J2IHJ$NH4#3L7I384E755HOJ9J#3873I(38IH789K#-1,-!9,?O3IH!#-%!$NH74735O7%#-$；1#/；IIHIH7563J#5K#-，!-8J#29,9，8JIH7#I35I8J7JJ7#-#&；1$-!；$NH352IHJ355(，5853I38J5E3IL#K7IHJI7238I38K83I7323JG#5387#H(938$9#1:*%,/：E#I7167K7284#3ME3J4H72I976H(1I8J2255564I72I7(（D.?=1&-,&-）；83I7323JG#5；7#H(938*硝基咪唑类药物对厌氧菌及原虫有独特的杀灭作用，甲硝唑、替硝唑和奥硝唑分别作为第一、二和三代硝基咪唑类化合物，已成为牙髓及牙周病治疗的首选抗菌药物，并与其他抗生素联合广泛应用于临床的各个领域#1(。*硝基杂环类化合物具有细胞诱变性、动物致癌毒性，已引起了临床的高度重视国外有科学家发表“甲硝唑对啮齿动物有致癌作用”的报道&，此后人们对该药极为关注。经过多年深入研究，国际癌症研究中心将甲硝唑列为!:类致癌物，即对动物的!第期徐!娟，等：超高效液相色谱!串联质谱法同时检测口腔卫生用品中的硝基咪唑类药物致癌作用有充分证据，而对人的致癌作用虽然还没有充足的证据，但还是意味着对人可能是致癌的。!甲硝唑经口腔吸收在大鼠体内的代谢动力学研究证实甲硝唑可经口腔黏膜吸收进入血液。日常生活中，不少人特别是有口腔疾患的人喜欢购买含甲硝唑的牙膏或漱口液经常或长期使用，以为这样能有疾除疾，无病防病。其实，久用这类牙膏或漱口液有隐患。有学者曾对国内市场销售的#$多种口腔卫生用品进行检测，结果发现有%种在基因突变试验中呈阳性反应；进一步分析表明，其致突变作用均是由加入其中的甲硝唑引起的&。!鉴于甲硝唑的遗传毒性作用，化妆品卫生规范（#$年版）中已将甲硝唑列入禁用药物，以免人们长期接触产生不良后果。但随着药物研究的发展，不断有新型的硝基咪唑类化合物被用于口腔疾病的治疗，而口腔卫生用品中违规添加该类药物的现象有愈演愈烈之势。!目前关于硝基咪唑类药物的检测对象主要集中在生物基质如禽肉、蜂蜜等，采用的方法包括气相色谱法（#）、高效液相色谱法（$%&#）及高效液相色谱!串联质谱法（$%&#!()(）等()*+，但尚未见采用$%&#!()(检测口腔卫生用品中硝基咪唑类药物含量的报道。本研究建立了口腔卫生用品中常用的种硝基咪唑类药物的超高效液相色谱!串联质谱（*%&#!()(）检测方法，方法操作简单，结果稳定可靠，可为监管部门规范管理口腔卫生用品市场提供依据。!实验部分!实验仪器!日本岛津公司超高效液相色谱仪（*+&#&#!#$,）；美国,-(./01公司三重串联四极杆质谱联用仪（,%234567%$），配有电喷雾离子源（8(2）；水浴超声波发生装置（瑞士(9:9(；2(公司，(；+$）；美国(2,公司高速离心机（(2,*!*%）；涡旋振荡器（2&(#）规定的一级水。!甲硝唑（:?，#,(:A%+!%(!*）、替硝唑（:?，#,(:A*,+(!,*!(）、奥硝唑（9B:，#,(:A*&+!%#!）、洛硝唑（B:?，#,(:A&(*!&!）、二甲硝咪唑（C?，#,(:A*!,#!(）标准品均购自(2,公司。使用前将各标准品用甲醇配制成质量浓度为*$DE)&的标准储备液，将其置于避光、)*(F以下的冰箱中保存，保存期*#个月。其余工作溶液现用现配。!$样品处理!称取$-E样品（准确至$-$*E）置于*$D&比色管中，加入$-*G甲酸水溶液)乙腈（,.，H)H）定容，于涡旋振荡器上振荡#D/I，水浴（#F以下）中超声提取*$D/I。准确量取$-*D&该样品溶液置于*$D&比色管中，加入$-*G甲酸水溶液)乙腈（,.，H)H）定容，振摇#D/I，静置后取上清液约*-$D&于*-D&带塞离心管中，于*#$5)D/I下离心D/I，过$-#!D滤膜，滤液供*%!&#!()(测定。!%#$%&()(条件!%!*%&#条件!色谱柱：#JH05=/J#*(色谱柱（*$DD/#-*DD，+-!D）。柱温：%$F。流动相：$-*G甲酸水溶液（,）和乙腈（-）；梯度洗脱条件：$0*D/I，,-$G,0&-$G,（曲线类型为）；*0%D/I，&-$G,（曲线类型为$）；%0D/I，&-$G,0,-$G,（曲线类型为$）；0&D/I，,-$G,（曲线类型为$）；&-$*D/I停止。流速：$-+$D&)D/I。进样量：*$!&。!%!#()(条件!离子源：8(2；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测模式（B）；气帘气流速：*&)D/I；雾化气（(*）流速：$&)D/I；辅助加热气（(#）流速：&$&)D/I；碰撞气（#,C）流速：中等；辅助加热气温度：$F；喷雾电压：$K。检测目标物的相关质谱信息见表*。表!&种硝基咪唑类化合物的质谱参数*+,-.!#$%&()(/+0+1.2.0345067+82949:+2958+8；:584901+29585449/I/N6OJ0#%(A$*#*A*!#+A#（:?）,+A*#&95I/N6OJ0#$A*#(A*!$#+A%+（9B:）(#A#%$BI/N6OJ0#$*A*%$A*!+*#A,（B:?）*$A#C/D045/N6OJ0*%#A#,&A*!%#+A$*（C?）(*A*+!PM6I4/464/H0/IA*%色谱第!卷!结果与讨论!#色谱柱的选择及分离条件的优化#在确定分离条件时，分别尝试了相同规格（$%!&!$!，()!）的#$%&()$*色谱柱、*(+,(-.)$*色谱柱以及)/01(+&/)$*色谱柱。前二者无法将替硝唑和洛硝唑很好地分离，且柱压较高，因此选定)/01(+&/)$*色谱柱进行分离。#分别考察了以醋酸缓冲液2乙腈、%$3甲酸水溶液2%$3甲酸乙腈溶液、%$3甲酸水溶液2乙腈为流动相的分离效果。实验表明，%$3甲酸水溶液与乙腈溶液的初始体积比)+)，经$!&$采用曲线)过渡到,)+()，并保持(!&$，能将性质很相近的替硝唑和洛硝唑良好分离，且其余各峰峰形尖锐对称。而采用其他等度洗脱或者是改用其余洗脱曲线类型均无法达到替硝唑和洛硝唑的基线分离。实验还考察了进样体积（)、$%、!%!4）对分析结果的影响，进样量为$%!4时的峰形和灵敏度均为最优，而更大的进样量在检测高浓度化合物时有峰形展宽的现象。!质谱条件的优化#根据以往文献$-报道，尝试使用大气压化学电离（56)7）和87（.）离子源。实验发现，使用569)7离子源的噪声基线低，但目标物的响应值也偏低；87（.）条件下响应较好，满足灵敏度要求。用蠕动泵以$%!42!&$的流速连续注射，分别将)种%)!:24的硝基咪唑类药物标准溶液注入87离子源中，在正离子检测方式下对硝基咪唑类药物进行一级质谱分析（；$扫描），得到准分子离子.$信息（；$!=+，见表$）；对准分子离子峰进行二级质谱分析（子离子扫描），得到碎片离子信息（；(!=+，见表$）。在此过程中，也对去簇电压、碰撞能、离子源温度、雾化气、气帘气、辅助气等参数进行了优化，结果见表$。图$为)种硝基咪唑类药物混合标准溶液（)!:24）在*64)92谱图。!$线性范围、检出限和精密度#量取一定量的各化合物标准溶液配制含)种化合物各$!:24的混合标准溶液，然后以%$3甲酸水2乙腈（)+)，121）溶液为稀释液，配成$%、)%、$%、!%、-%、,%!:24系列质量浓度的混合标准溶液。在所确定的实验条件下分离检测，以仪器响应峰面积（!）对硝基咪唑类化合物的质量浓度（）进行线性回归，结果表明：)种硝基咪唑类化合物的质量浓度在$%/,%!:24范围内（相当于图#%种硝基咪唑类药物混合标准溶液（%!#$）%&%模式下的($)*%+#%+谱图,-!#($)*%+#%+./01234103251632-7480916%:-401-2-；31=9543:；30；51=84-1:5（%!#$）-:%&%21；9样品中!%/$!%!:2.:的硝基咪唑类化合物）时，线性关系良好，其相关系数均不小于%!（见表!）。当样品中的药物超过此线性范围时，可适当加大样品的稀释倍数。因稀释倍数较大，可不!)-!第期徐!娟，等：超高效液相色谱!串联质谱法同时检测口腔卫生用品中的硝基咪唑类药物考虑基质效应影响。本方法对于种硝基咪唑类药物的定量限（以信噪比（!#）为#$计）均为%&$#$%#。以牙膏和漱口水为代表基质，分别添加#$&$、%$&$、#$#$%#个水平，每个水平重复测定#$次，进行回收率实验和精密度实验，平均回收率为(#&)#$*&，相对标准偏差（()）为#&#+&)&%&。结果见表。表!#种硝基咪唑类化合物的线性方程和相关系数!#$%!&(%)%*+,-(.(/0-)%$,-(0-%110%(,.-1#(,)-2/3-$%.*+,-./012+0,3045,/26+76330-,/26+860992820+/:；!$,=-#$+%.$=#$=(?；!$,=*%-#$+%.$=$/$=(0；!$,=+-#$+%.$=#%#$=(%):!$,=+$-#$+%.$=$%$=(/!$：0,%,30,；%：,AA86+80+/3,/26+，!#$1=表$不同基质中#种硝基咪唑类化合物的添加回收率与精密度（!%&）!#$%$456%/)%0-7%)%.(/849.1-)#(,)-2/3-$%.(,:-2,)0%.（!%&）:,/32B(2%0C$（#$%#）:；086D03.$&()$&?；086D03.$&()$&；086D03.$&()$&):66/E,A/0#$=$(%=0=%(/=%(=0=$(=$%=(0#$*#=#+%$=$#$=$#$#=/(=0%=/#$+%=*(#=/%=$*#$(+=*%=+(+=%=0(=/%=+(0=0#=*+(#=#=+0()：30-,/2D0A/,+C,3CC0D2,/26+=!；(实际样品的测定!按照所建立的方法对市场上主要的口腔卫生用品（包括#种牙膏和+种漱口水）进行了检验，仅在一款牙膏中检出含有甲硝唑，含量为$&$&（相当于$#$%#）。表明目前市场上流通的主要口腔卫生用品符合化妆品卫生规范（%$/年版）的要求，消费者可放心使用。$结语!建立了超高效液相色谱!串联质谱同时检测口腔卫生用品（牙膏及漱口水）中甲硝唑、替硝唑、奥硝唑、洛硝唑和二甲硝咪唑等种硝基咪唑类药物含量的方法。该方法操作简单，测定结果准确可靠，适用于口腔卫生用品中的硝基咪唑类药物含量的检测与确证。参考文献：#!66/E,A/0I+C5A/3.（周宝华=牙膏工业），%$（#）：%0%!J5K，12；L=*8/,*8,C02,0:0C282+,0M2+#C,6N+2D032!/,/2A（傅国，李宁毅=青岛大学医学院学报），%$，(（+）：+*0!O5M7，03,/6-，%$+，/$（+）：#/!O2+O，125S:，T,+#H，0/,-=P653+,-69U+