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丹红注射液对体外培养星形胶质细胞的影响.pdf丹红注射液对体外培养星形胶质细胞的影响.pdf -- 5 元

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丹红注射液对体外培养星形胶质细胞的影响徐江华,蒋海丽,梅元武(华中科技大学同济医学院附属协和医院神经内科,武汉430022)[摘要]目的观察丹红注射液对星形胶质细胞(astrocyte,As)增殖作用。方法不同浓度丹红注射液作用于体外培养的大鼠As,噻唑蓝染色(MTT)比色法对丹红注射液进行细胞毒性分析,流式细胞技术分析细胞增殖情况。结果MTT比色分析得出丹红注射液对细胞生长的半数抑制率(IC50)约为17.8%(丹红注射液与培养基的体积比),安全作用浓度<8%流式细胞分析结果药物组细胞DNA合成期细胞所占百分比(S%)和增殖指数(PI值)(S+G2/M)100%较正常对照组显著增高(P<0.01)。结论适当浓度丹红注射液可促进星形胶质细胞增殖。[关键词]丹红注射液星形胶质细胞细胞增殖[中图分类号]R286R966[文献标识码]A[文章编号]10040781(2008)01003202胶质细胞在中枢神经系统中扮演重要角色,而且与神经系统疾病的形成有密切关系[1]。随着对星形胶质细胞(astrocyte,As)研究的日趋深入,学者们对As在缺血性脑血管病中的变化和作用产生浓厚兴趣。丹红注射液是由中药丹参与红花精制萃取制备,具有保护血管内皮、促进血管增生及抗凝作用已有动物实验提示丹红注射液对大鼠局灶脑缺血后脑细胞有保护作用[2],具体作用机制未完全明确,As受丹红注射液作用后有何反应尚不清楚,尽管缺血再灌注的动物模型更接近于真实的生理病理情况,但由于中枢神经系统内细胞成分复杂、作用机制彼此交织,很难精确分辨As的具体变化。笔者采取体外培养As的方法,从而避开体内其他因素干扰,探讨丹红注射液对As的影响。1材料与方法1.1试剂与仪器DMEM(高糖)培养基、胎牛皿清(Hyclone),左旋多聚赖氨酸、MTT、DMSO、PI均购自Sigma公司,1250胰蛋白酶(AMRESCO),GFAP多克隆抗体(武汉博士德公司),FITC标记的羊抗兔抗体(北京中杉金桥),倒置相差显微镜(日本Olympus公司),荧光显微镜(日本Olympus公司),流式细胞仪(型号FACSCablibur,美国BD公司),紫外分光光度仪(德国Beckman公司)。1.2方法1.2.1大鼠As的原代培养及纯化取出生24h内SD大鼠,-20℃冰箱内冷冻15min处死,经75%乙醇消毒1min。主要取材过程在冰上进行,开颅取大脑皮层并移入含有预冷PBS液的培养皿中,去脑膜,将剪碎的脑组织吸入胰蛋白酶(0.25%)的离心管中消化,置37℃水浴缓慢震荡20min,用含20%胎牛血清的DMEM终止消化,稍用力吹打混匀后收集细胞悬液,经孔径(75.0±4.1)μm(200目)过滤网过滤,以1000rmin1离心7min,去上清液,每管加入3mL含20%胎牛血清的DMEM,[收稿日期]20070416[作者简介]徐江华(1973-),男,山东章丘人,在读硕士,主要从事脑血管病研究。电话(0)13476013498,Emailjianghuaxu88@yahoo.com.cn。[通讯作者]梅元武(1952-),男,湖北武汉人,教授,博士生导师,主要从事脑血管病和神经康复等疾病的研究工作。电话027-85726925,Emailmeiyuanwu@sohu.com。种入赖氨酸(10μgmL1过夜)包被的培养瓶中。10d后细胞长满瓶底,将培养瓶置于摇床上以260rmin-1振荡16h纯化细胞,摇床后贴壁的细胞为As,用胰蛋白酶(0.25%)消化后进行首次传代。3d换液1次。1.2.2荧光免疫鉴定As纯度GFAP荧光免疫细胞法鉴定As的纯度。传代3次后的细胞制作细胞爬片,赖氨酸包被12孔培养板内的玻片,消化细胞并种板培养48h,估计玻片上的细胞融合约70%,PBS液洗3次,加预冷固定剂(无水乙醇和丙酮等体积混合),固定15min然后风干。0.2%TritronX100破膜,山羊血清封闭,加一抗GFAP(1100),爬片放入湿盒4℃冰箱过夜,加二抗FITC标记的羊抗兔抗体(1100),室温避光30min,加PI(0.2mgmL1)染核。荧光倒置微镜下观察并照相,所有细胞核染成红色,As是GFAP阳性细胞着有绿色荧光,其他细胞细胞质没有着色,以上各步之间均用PBS液冲洗3次。1.2.3MTT比色法测定细胞毒力实验取已传代3次的As,消化后以5104个mL1的密度接种于96孔板中(每孔100μL),随机分8组。分别为对照组,0.5%,1.0%,2.0%,4.0%,8.0%,16.0%,32.0%组,每组复5孔,由于丹红注射液为褐色液体,为消除颜色对结果的影响,每一丹红浓度都对应3个调零孔。48h后各组均加入MTT液15μL(5mgmL1,溶于0.0lmolL1PBS液中),继续培养4h,小心吸弃上清,然后加入DMSO100μL,振荡10min后在多功能酶标仪上测各孔吸光度(A值),检测波长为570nm,参比波长620nm。1.2.4流式细胞技术测细胞周期实验细胞分为两组(空白对照组,4%丹红组),3个时间点分别种于6个培养皿中,分别在细胞培养24,48和72h后实验组加入上述浓度丹红注射液,继续培养24h,收集6个培养皿种的细胞,0.25%胰蛋白酶消化,吹打成单细胞悬液,1000rmin1离心8min,弃上清,冷PBS重悬,洗2次,离心后用75%冷乙醇固定,4℃冰箱过夜。上机测试前,再经冷PBS洗2次,调整细胞浓度为l106个mL1,再加入50μgmL1的PI染色30min,行流式细胞仪测试,经多参数细胞周期分析软件分析处理后输出测试结果。1.3统计学方法计量资料以均数±标准差(x±s)表示,应用SPSS12.0软件统计,各组间比较用方差分析(ONE-WAY-ANOVA),P<0.05表示差异有显著性。23HeraldofMedicineVol27No1January20082结果2.1As形态以及纯度鉴定倒置显微镜下可见较纯化的As胞体较大,呈多形性、扁平状,细胞突起较多较长,胞核呈圆形或卵圆形,偏心。在荧光显微镜下拍照,As为GFAP阳性细胞,细胞质为绿色荧光,细胞核为红色其他细胞细胞质未能染色,细胞核也为红色。以随机3个视野中阳性细胞数占总细胞数的比例来计算As的纯度,经计算As的纯度96%。2.2细胞毒力各实验组A值和抑制率见表1,实验结果说明浓度>16%丹红各组的A值与正常组比较显著降低(P<0.05),0.5%~8.0%丹红浓度与对照组比较差异无显著性(P>0.05),提示丹红对As的安全工作浓度<8.0%,抑制率(%)=(1-实验组A值/正常组A值)100%,丹红注射液对As的半数抑制率IC50为17.8%浓度,根据以上结果本实验所用丹红浓度为4%。2.3细胞生长周期流式细胞分析结果见表2,4%丹红组各时间点DNA合成期(S期)细胞所占比例以及增殖指数(PI)表明,各时间点丹红组均能促进细胞增殖,与对照组比较差异有极显著性(P<0.01),药物作用48h后,其DNA合成期细胞所占百分比和PI值(S+G2/M)100%显著增高,并且和24,72h药物实验组比较差异有极显著性(P<0.01)。提示4%丹红注射液对As具有增值作用,在48h作用最明显。表1各组As的A值和抑制率比较x±s组别A值抑制率/%丹红注射液0.5%组0.412±0.02911.01.0%组0.425±0.0128.22.0%组0.417±0.02210.04.0%组0.413±0.02710.88.0%组0.405±0.01812.516.0%组0.232±0.020149.932.0%组0.130±0.035171.9对照组0.463±0.020-与对照组比较,1P<0.05表2各组As的S期和PI值比较x±s组别24hSPI48hSPI72hSPI4%丹红组20.72±0.61121.16±0.07131.59±0.48234.49±0.46216.87±0.72122.21±0.761对照组15.45±0.0615.65±0.0615.39±0.1215.64±0.0915.56±0.1315.79±0.11药物组分别与同一时间点对照组比较,1P<0.01与同组24,72h比较,2P<0.013讨论缺血性脑血管病梗死灶是由中心坏死区及周围缺血半暗带组成,由于缺血半暗带内仍有侧枝循环,尚有大量可存活的神经元,抢救缺血半暗带保护这些神经元是缺血性脑血管病治疗成功的关键。在缺血性损害下,As通常会发生细胞肿胀、过度肥大增生,部分As凋亡,更严重的是As凋亡会促成神经元的继发性死亡,导致梗死区的进一步扩大[3]。但在缺血半暗带区存活的As可能有利于受损神经元的恢复,不仅抑制神经元死亡,并且有利于缺血性脑损伤的神经功能恢复[4]。BROWN等[5]研究表明,缺血性脑损伤时,激活的AS可以通过分泌神经营养因子,如血管内皮生长因子、成纤维生长因子保护神经元减轻脑损伤。所以缺血性脑血管病后的治疗不仅要激活As使其产生大量的神经保护因子,促进受损神经元的恢复,同时还应该阻断半暗带内的As的凋亡,以避免神经元继发性凋亡。丹红注射液是植物丹参、红花提取物,其主要成分是丹参素[6]。丹参具有扩张脑动脉,降低血管阻力,降低血液黏度,增强红细胞变形能力,并能清除氧自由基,改善三磷腺苷(ATP)酶活性,同时也可提高脑组织耐低氧能力,对脑组织具有明显的保护作用[7]。本实验通过体外实验观察丹红注射液对As的影响,通过MTT比色法初筛丹红注射液对As的安全作用范围,结果显示0.5%~8.0%丹红浓度组与对照组A值差异无显著性(P>0.05),得出丹红注射液对As的安全工作浓度<8.0%用流式细胞技术测细胞周期结果显示4%丹红浓度在24,48,72h与对照组比较均能促进细胞增殖,提示4%丹红注射液对As具有增值作用,在48h作用最明显。脑缺血时只有受累脑区的As被激活增殖,而且增殖后部分As继发性凋亡,而本实验提示丹红注射液可以激活无缺血脑区的As,改变As周期使其增殖,保护神经元。[参考文献][1]朱长庚.胶质细胞与神经元间的信号交流及其与癫G22发病机制的关系[J].中国组织化学细胞化学杂志,2003,12(3)323-326.[2]邓芬,胡长林,谢运兰.丹红注射液对大鼠局灶脑缺血后一氧化氮合酶的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志,2006,4(10)880-881.[3]GIBSONCL,COUGHLANTC,MURPHYSP.Glialnitricoxideandischemia[J].Glia,2005,50(4)417-426.[4]PANICKARKS,NORENBERGMD.Astrocytesincerebralischemicinjurymorphologicalandgeneralconsiderations[J].Glia,2005,50(4)287-298.[5]BROWNRC,MARKKS,EGLETONRD,etal.Protectionagainsthypoxiainducedincreaseinbloodbrainbarrierpermeability,roleoftightjunctionproteinandNFκB[J].JCellSci,2003,116(4)693-700.[6]李正国,赵淑杰,王宝.HPLC法测定丹红注射液中丹参素的含量[J].中药新药与临床药理,1999,l0(2)293-294.[7]辛勤,李秀芳,司端运,等.丹参红花注射液对实验性大鼠脑缺血的保护作用[J].中成药,2004,26(3)222-224.33医药导报2008年1月第27卷第1期
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