丹红注射液对体外培养星形胶质细胞的影响.pdf

丹红注射液对体外培养星形胶质细胞的影响徐江华，蒋海丽，梅元武（华中科技大学同济医学院附属协和医院神经内科，武汉）摘要目的观察丹红注射液对星形胶质细胞（，）增殖作用。方法不同浓度丹红注射液作用于体外培养的大鼠，噻唑蓝染色（）比色法对丹红注射液进行细胞毒性分析，流式细胞技术分析细胞增殖情况。结果比色分析得出丹红注射液对细胞生长的半数抑制率（）约为（丹红注射液与培养基的体积比），安全作用浓度；流式细胞分析结果：药物组细胞合成期细胞所占百分比（）和增殖指数（值）（）较正常对照组显著增高（）。结论适当浓度丹红注射液可促进星形胶质细胞增殖。关键词丹红注射液；星形胶质细胞；细胞增殖中图分类号；文献标识码文章编号（）胶质细胞在中枢神经系统中扮演重要角色，而且与神经系统疾病的形成有密切关系。随着对星形胶质细胞（，）研究的日趋深入，学者们对在缺血性脑血管病中的变化和作用产生浓厚兴趣。丹红注射液是由中药丹参与红花精制萃取制备，具有保护血管内皮、促进血管增生及抗凝作用已有动物实验提示丹红注射液对大鼠局灶脑缺血后脑细胞有保护作用，具体作用机制未完全明确，受丹红注射液作用后有何反应尚不清楚，尽管缺血再灌注的动物模型更接近于真实的生理病理情况，但由于中枢神经系统内细胞成分复杂、作用机制彼此交织，很难精确分辨的具体变化。笔者采取体外培养的方法，从而避开体内其他因素干扰，探讨丹红注射液对的影响。材料与方法试剂与仪器（高糖）培养基、胎牛皿清（），左旋多聚赖氨酸、均购自公司，胰蛋白酶（），多克隆抗体（武汉博士德公司），标记的羊抗兔抗体（北京中杉金桥），倒置相差显微镜（日本公司），荧光显微镜（日本公司），流式细胞仪（型号，美国公司），紫外分光光度仪（德国公司）。方法大鼠的原代培养及纯化取出生内大鼠，冰箱内冷冻处死，经乙醇消毒。主要取材过程在冰上进行，开颅取大脑皮层并移入含有预冷液的培养皿中，去脑膜，将剪碎的脑组织吸入胰蛋白酶（）的离心管中消化，置水浴缓慢震荡，用含胎牛血清的终止消化，稍用力吹打混匀后收集细胞悬液，经孔径（）（目）过滤网过滤，以离心，去上清液，每管加入含胎牛血清的，收稿日期作者简介徐江华（），男，山东章丘人，在读硕士，主要从事脑血管病研究。电话：（），：。通讯作者梅元武（），男，湖北武汉人，教授，博士生导师，主要从事脑血管病和神经康复等疾病的研究工作。电话：，：。种入赖氨酸（过夜）包被的培养瓶中。后细胞长满瓶底，将培养瓶置于摇床上以振荡纯化细胞，摇床后贴壁的细胞为，用胰蛋白酶（）消化后进行首次传代。换液次。荧光免疫鉴定纯度荧光免疫细胞法鉴定的纯度。传代次后的细胞制作细胞爬片，赖氨酸包被孔培养板内的玻片，消化细胞并种板培养，估计玻片上的细胞融合约，液洗次，加预冷固定剂（无水乙醇和丙酮等体积混合），固定然后风干。破膜，山羊血清封闭，加一抗（），爬片放入湿盒冰箱过夜，加二抗标记的羊抗兔抗体（），室温避光，加（）染核。荧光倒置微镜下观察并照相，所有细胞核染成红色，是阳性细胞着有绿色荧光，其他细胞细胞质没有着色，以上各步之间均用液冲洗次。比色法测定细胞毒力实验取已传代次的，消化后以个的密度接种于孔板中（每孔），随机分组。分别为：对照组，组，每组复孔，由于丹红注射液为褐色液体，为消除颜色对结果的影响，每一丹红浓度都对应个调零孔。后各组均加入液（，溶于液中），继续培养，小心吸弃上清，然后加入，振荡后在多功能酶标仪上测各孔吸光度（值），检测波长为，参比波长。流式细胞技术测细胞周期实验细胞分为两组（空白对照组，丹红组），个时间点分别种于个培养皿中，分别在细胞培养，和后实验组加入上述浓度丹红注射液，继续培养，收集个培养皿种的细胞，胰蛋白酶消化，吹打成单细胞悬液，离心，弃上清，冷重悬，洗次，离心后用冷乙醇固定，冰箱过夜。上机测试前，再经冷洗次，调整细胞浓度为个，再加入的染色，行流式细胞仪测试，经多参数细胞周期分析软件分析处理后输出测试结果。统计学方法计量资料以均数标准差（）表示，应用软件统计，各组间比较用方差分析（），表示差异有显著性。结果形态以及纯度鉴定倒置显微镜下可见较纯化的：胞体较大，呈多形性、扁平状，细胞突起较多较长，胞核呈圆形或卵圆形，偏心。在荧光显微镜下拍照，为阳性细胞，细胞质为绿色荧光，细胞核为红色；其他细胞细胞质未能染色，细胞核也为红色。以随机个视野中阳性细胞数占总细胞数的比例来计算的纯度，经计算的纯度。细胞毒力各实验组值和抑制率见表，实验结果说明浓度丹红各组的值与正常组比较显著降低（），丹红浓度与对照组比较差异无显著性（），提示丹红对的安全工作浓度，抑制率（）（实验组值正常组值），丹红注射液对的半数抑制率为浓度，根据以上结果本实验所用丹红浓度为。细胞生长周期流式细胞分析结果见表，丹红组各时间点合成期（期）细胞所占比例以及增殖指数（）表明，各时间点丹红组均能促进细胞增殖，与对照组比较差异有极显著性（），药物作用后，其合成期细胞所占百分比和值（）显著增高，并且和，药物实验组比较差异有极显著性（）。提示丹红注射液对具有增值作用，在作用最明显。表各组的值和抑制率比较组别值抑制率丹红注射液组组组组组组组对照组与对照组比较，表各组的期和值比较组别丹红组对照组药物组分别与同一时间点对照组比较，；与同组，比较，讨论缺血性脑血管病梗死灶是由中心坏死区及周围缺血半暗带组成，由于缺血半暗带内仍有侧枝循环，尚有大量可存活的神经元，抢救缺血半暗带保护这些神经元是缺血性脑血管病治疗成功的关键。在缺血性损害下，通常会发生细胞肿胀、过度肥大增生，部分凋亡，更严重的是凋亡会促成神经元的继发性死亡，导致梗死区的进一步扩大。但在缺血半暗带区存活的可能有利于受损神经元的恢复，不仅抑制神经元死亡，并且有利于缺血性脑损伤的神经功能恢复。等研究表明，缺血性脑损伤时，激活的可以通过分泌神经营养因子，如血管内皮生长因子、成纤维生长因子保护神经元减轻脑损伤。所以缺血性脑血管病后的治疗不仅要激活使其产生大量的神经保护因子，促进受损神经元的恢复，同时还应该阻断半暗带内的的凋亡，以避免神经元继发性凋亡。丹红注射液是植物丹参、红花提取物，其主要成分是丹参素。丹参具有扩张脑动脉，降低血管阻力，降低血液黏度，增强红细胞变形能力，并能清除氧自由基，改善三磷腺苷（）酶活性，同时也可提高脑组织耐低氧能力，对脑组织具有明显的保护作用。本实验通过体外实验观察丹红注射液对的影响，通过比色法初筛丹红注射液对的安全作用范围，结果显示丹红浓度组与对照组值差异无显著性（），得出丹红注射液对的安全工作浓度；用流式细胞技术测细胞周期结果显示丹红浓度在，与对照组比较均能促进细胞增殖，提示丹红注射液对具有增值作用，在作用最明显。脑缺血时只有受累脑区的被激活增殖，而且增殖后部分继发性凋亡，而本实验提示丹红注射液可以激活无缺血脑区的，改变周期使其增殖，保护神经元。参考文献朱长庚胶质细胞与神经元间的信号交流及其与癫G22发病机制的关系中国组织化学细胞化学杂志，（