灯盏细辛注射液对TNF-α 诱导内皮细胞炎症分子的影响.pdf

ChineseJournalofNewDrugs2009,18(3)253中国新药杂志2009年第18卷第3期基金项目国家973计划(2005CB523404)；国家自然科学基金(30572348)；云南省科技计划(2006YX03)作者简介郭虹,女,博士研究生。联系电话:(022)81125698,E2mail:。通讯作者胡利民,男,研究员,主要从事中药神经药理和毒理研究。联系电话:(022)23051120,E2mail:。实验研究灯盏细辛注射液对TNF2诱导内皮细胞炎症分子的影响郭虹,康立源,柴丽娟,胡利民,赵琳(天津中医药大学中医药研究院,天津市中药药理学重点实验室,天津300193)摘要目的:研究灯盏细辛注射液(Erigeronbreviscapusinjection,EBI)对离体培养的大鼠脑微血管内皮细胞(BMEC)炎症相关细胞因子白细胞介素21(IL21)及细胞间黏附分子21(ICAM21)、血管细胞黏附分子21(VCAM21)蛋白表达的影响,初步探讨EBI抗脑缺血炎症损伤的机制。方法:采用肿瘤坏死因子2(tumornecrosisfactor2,TNF2)建立离体培养的大鼠BMEC炎症损伤模型,分别用0.1mgL-1和1mgL-1EBI处理内皮细胞,使用ELISA试剂盒分析IL21蛋白表达的变化,流式细胞仪测定ICAM21和VCAM21荧光强度的变化。结果:EBI可以抑制TNF2诱导的内皮细胞IL21高表达,降低TNF2诱导的内皮细胞ICAM21和VCAM21高表达。结论:EBI可以降低由TNF2诱导的内皮细胞过度表达IL21,ICAM21和VCAM21,从而对脑缺血炎症损伤具有一定保护作用。关键词灯盏细辛注射液；脑微血管内皮细胞；肿瘤坏死因子2中图分类号R285.5；R743.31文献标识码A文章编号1003-3734(2009)03-0253-04EffectofErigeronbreviscapusinjectionontheexpressionofinflammatorymoleculesinducedbyTNF2inendothelialcellsGUOHong,KANGLi2yuan,CHAILi2juan,HULi2min,ZHAOLin(TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine,TianjinLaboratoryofChineseMedicinePharmacology,Tianjin300193,China)AbstractObjective:ToinvestigatetheeffectofErigeronbreviscapusinjection(EBI)ontheexpressionofinterleukin21(IL21),intercellularadhesionmolecule21(ICAM21),andvascularcelladhesionmolecule21(VCAM21)inratbrainmicrovascularendothelialcells(BMEC)culturedinvitro.Methods:Theinflammatoryin2jurywasinducedbytumornecrosisfactor2(TNF2)inBMECs.TheendothelialcellsweretreatedwithEBIat0.1and1mgL-1.TheexpressionofIL21proteinwasdetectedbyELISA,andthoseofICAM21andVCAM21weremeasuredbyflowcytometry.Results:EBIinhibitedTNF22enhancedexpressionofIL21inBMECs.MeanwhileitdiminishedTNF22enhancedexpressionofICAM21andVCAM21inBMECs.Conclusion:EBIdecreasesTNF22enhancedexpressionofIL21,ICAM21andVCAM21inBMECs,resultinginaprotectiveeffectoninflammatoryin2juryaftercerebralischemia.KeywordsErigeronbreviscapusinjection；cerebralmicrovascularendothelialcells；tumornecrosisfactor2(TNF2)炎症反应在脑缺血发生后的迟发性脑损伤过程中扮演了重要角色,脑缺血时炎性细胞因子和其他炎性介质相继产生,并以网络形式在脑缺血损伤病理过程中发挥作用1-2。灯盏细辛是菊科植物短葶飞蓬Erigermbreviscapus(Vant.)Hand.2Mazz的干燥全草,又名灯盏花,但其作用机制尚未完全阐明3。本研究旨在考察灯盏细辛注射液(Erigeronbreviscapusinjec2tion,EBI)对肿瘤坏死因子2(TNF2)诱导的脑微血管内皮细胞(brainmicrovascularendothelialcell,BMEC)黏附分子细胞间黏附分子21(intercellularadhesionmol2ChineseJournalofNewDrugs2009,18(3)254中国新药杂志2009年第18卷第3期ecule21,ICAM21)、血管细胞黏附分子21(vascularcelladhesionmolecule21,VCAM21)以及细胞因子白细胞介素21(interleukin21,IL21)的影响,初步探讨EBI抗脑缺血炎症损伤的机制,为临床用药提供实验依据。材料与方法1材料DMEM培养基(Gibco),胎牛血清(Hyclone),型胶原酶(Invitrogen),胶原酶/分散酶(Roche),牛血清白蛋白(BSA,Roche),Percoll(GEHealthcare),第因子相关抗原抗体与S2P免疫组化试剂盒(北京中山试剂公司),乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒(中生北控生物科技有限公司),TNF2(Pepro2Tech),噻唑蓝(MTT,Sigma),ICAM21和VCAM21抗体(BDBiosciences),大鼠IL21ELISA检测试剂盒(R&D)。Microlab300半自动生化分析仪(VitalScientific),酶标仪(TECAN公司),FACScan流式细胞仪(Beckman公司)。EBI由云南生物谷灯盏花药业有限公司提供,产品批号20050809,10mL含野黄芩苷和总咖啡酸酯共30mg。2BMEC培养根据Calabria等4的方法略加改动。取20d左右Wistar大鼠脱臼处死,75%乙醇消毒35min,取全脑置于冷D2Hanks液中去除小脑、间脑,仔细剥除血管、软脑膜等,保留大脑皮质,将其剪碎成1mm3大小,加入0.7gL-1型胶原酶37消化1h,1000g离心10min,弃上清。加入20%BSA悬浮混匀1000g离心20min,弃上层保留底部沉淀。加入1gL-1胶原酶/分散酶37消化1h,700g离心6min,弃上清。加入DMEM培养液悬浮铺于经离心形成连续梯度的50%的Percoll,1000g离心10min,吸出微血管段层,DMEM完全培养液悬浮后接种于75cm2培养瓶中,每隔2d换液1次,细胞长至70%80%融合即可传代,实验选用第2代细胞。3BMEC鉴定形态结构观察:在相差倒置显微镜下观察细胞生长情况。因子鉴定:将生长在盖玻片上的细胞用4%多聚甲醛固定,磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次,滴加复合消化液室温放置10min,PBS洗3次,加含0.5%TritonX2100的山羊血清封闭30min,滴加兔抗鼠第因子相关抗原抗体(150),4孵育18h后,PBS洗3次,滴加生物素标记羊抗兔IgG,室温孵育1h,PBS洗3次,滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液,室温孵育20min,PBS洗3次,DAB显色。4EBI对BMEC的影响将传代的BMEC种于96孔板内长至融合状态,分为对照组(正常培养液)、0.1mgL-1EBI组、1mgL-1EBI组,继续培养24h,取上清液测定LDH活性；细胞加入MTT溶液孵育4h,弃培养液,加入二甲基亚砜,酶标仪492nm波长检测各孔的吸收度值。5双抗体夹心ELISA法检测IL21的水平将传代的BMEC种于6孔板内长至细胞融合,分为对照组(正常培养液)、TNF2(终浓度25gL-1)组、0.1mgL-1EBI+TNF2组、1mgL-1EBI+TNF2组,继续孵育16h,收集上清液,双抗体夹心ELISA法检测各组上清液中IL21的水平。6流式细胞仪检测ICAM21和VCAM21的荧光强度实验分组同“5”,细胞孵育16h后胰酶2EDTA消化成单细胞悬液,PBS洗涤,加入FITC标记的ICAM21和VCAM21抗体孵育,PBS洗涤后流式细胞仪检测阳性细胞百分率,每个样本计数3000个细胞。7统计学处理数据以均数标准差(珋xs)表示,用SPSS统计软件包进行分析,组间比较采用单因素方差分析。结果1BMEC形态与鉴定倒置显微镜下观察,细胞呈短梭形,偶见多角形,单层生长并有接触抑制现象,符合内皮细胞生长特性。通过因子免疫细胞化学染色鉴定,阳性细胞胞浆呈棕褐色。见图1。(a)融合后的BMEC(100)(b)因子染色阳性(200)(c)因子染色阴性(200)图1BMEC形态及因子免疫细胞化学染色鉴定ChineseJournalofNewDrugs2009,18(3)255中国新药杂志2009年第18卷第3期2EBI对BMEC活力和LDH释放的影响EBI0.1和1mgL-1与BMEC共同孵育24h后,细胞活力、LDH释放与正常组比较均无显著性差异,EBI0.1和1mgL-1对BMEC活力无明显影响。结果见表1。表1EBI对BMEC的影响n=6,珋xs组别剂量/mgL-1MTT(A492nm)LDH/UL-1对照0.1790.02929.007.12EBI0.10.1610.01220.712.63EBI10.1730.02533.715.593EBI对TNF2诱导BMEC释放IL21的影响对照组IL21的水平很低,TNF2组IL21的水平较对照组显著性升高(P0.01),0.1和1mgL-1EBI孵育的BMEC分泌的IL21水平低于TNF2组(P0.05,P0.01),差异有统计学意义。结果见图2。A:对照；B:TNF2；C:0.1mgL-1EBI+TNF2；D:1mgL-1EBI+TNF2与A组比较,a:P0.01；与B组比较,b:P0.05,c:P0.01图2EBI对TNF2诱导BMEC释放IL21的影响(n=5)4EBI对TNF2诱导BMEC膜表面ICAM21和VCAM21荧光强度的影响流式细胞仪检测细胞膜表面ICAM21和VCAM21的荧光强度,结果显示TNF2刺激内皮细胞16h后ICAM21和VCAM21荧光强度显著性增加(P0101,P0.05),1mgL-1EBI可显著降低ICAM21和VCAM21荧光强度(P0.05),0.1mgL-1EBI有降低的趋势。结果见图3。A:对照；B:TNF2；C:0.1mgL-1EBI+TNF2；D:1mgL-1EBI+TNF2与A组比较,a:P0.05,b:P0.01；与B组比较,c:P0.05图3EBI对TNF2诱导BMEC膜表面ICAM21和VCAM21荧光强度的影响(n=5)讨论脑缺血损伤后,缺血区产生大量具有致炎作用的细胞因子,诱导多种黏附分子的表达,促进白细胞的浸润,产生炎症反应,因此黏附分子及细胞因子与脑缺血损伤密切相关5。TNF2是具有多效性作用的促炎性细胞因子,能通过促进凝血、增加内皮细胞通透性及诱导黏附分子或其他炎性介质表达,从而加重缺血脑损伤。研究报道6-7,TNF2可增加内皮细胞黏附分子的表达,促使细胞因子的mRNA转录及表达,从而起到协同致炎作用。本研究考察了EBI是否能抑制TNF2诱导的炎症蛋白表达。参考文献8并初步筛选,25gL-1TNF2诱导内皮细胞16h黏附分子表达可维持较高水平,此方法可用于后期实验。EBI主要含野黄芩苷和总咖啡酸酯,有一定的内皮细胞保护作用及抗氧化作用,能够保护内皮细胞免受损伤9。体内实验研究表明,灯盏花素能显著下调大鼠脑缺血后ICAM2lmRNA及其蛋白的表达,从而抑制内皮细胞2白细胞的黏附,减轻缺血后再灌注损伤10。本研究首先观察了EBI是否能够抑制TNF2诱导内皮细胞IL21的水平。结果显示单独使用TNF2刺激内皮细胞16h,IL21水平明显增加,0.1和1mgL-1EBI分别与TNF2共同作用内皮细胞16h,IL21水平明显降低。其次,本研究观察了EBI对TNF2诱导内皮细胞ICAM21和VCAM21表达的影响。ICAM21和VCAM21在正常脑血管内皮表达水平较低,TNF2刺激后表达明显升高,这与Han等11的研究结果基本一致。EBI和TNF2共同作用的内皮细胞膜表面ICAM21和VCAM21的荧光强度明显降低,表明EBI抑制了ChineseJournalofNewDrugs2009,18(3)256中国新药杂志2009年第18卷第3期TNF2诱导的炎症蛋白分子表达。这些结果提示EBI对BMEC炎性细胞因子、黏附分子具有一定调节作用,可能是其治疗脑缺血炎症机制之一。研究报道12-13,抑制内皮细胞NF2kappaB活性,可以抑制黏附分子高表达。也有研究表明蛋白激酶C(PKC)抑制剂可拮抗黏附分子的表达,减轻脑缺血/再灌注神经元损伤14。EBI是通过何种途径降低TNF2诱导的内皮细胞黏附分子及细胞因子高表达的,还有待于进一步研究。参考文献1PRUNELLGF,SVENDGAARDNA,ALKASSK,etal.Inflam2mationinthebrainafterexperimentalsubarachnoidhemorrhageJ.Neurosurgery,2005,56(5):1082-1092.2SIMAKJ,GELDERMANMP,YUH,etal.Circulatingendo2thelialmicroparticlesinacuteischemicstroke:alinktoseverity,lesionvolumeandoutcomeJ.JThrombHaemost,2006,4(6):1296-1302.3张春霞,康立源,胡利民,等.灯盏细辛中黄酮类成分药理活性的研究进展J.中国新药杂志,2008,17(2):110-113.4CALABRIAAR,WEIDENFELLERC,JONESAR,etal.Puro2mycin2purifiedratbrainmicrovascularendothelialcellculturesexhibitimprovedbarrierpropertiesinresponsetoglucocorticoidinductionJ.JNeurochem,2006,97(4):922-933.5张丽慧,魏尔清.ICAM21、VCAM21在脑缺血损伤炎症机制中的作用及调控J.中国药理学通报,2005,21(11):1281-1285.6RADOMSKA2LESNIEWSKADM,SADOWSKAAM,VANOVER2VELDFJ,etal.InfluenceofN2acetylcysteineonICAM21expres2sionandIL28releasefromendothelialandepithelialcellsJ.JPhysiolPharmacol,2006,57(Suppl4):325-3347KIMYS,AHNY,HONGMH,etal.Curcuminattenuatesin2flammatoryresponsesofTNF2alpha2stimulatedhumanendothelialcellsJ.JCardiovascPharmacol,2007,50(1):41-49.8HUGHESCC,MALEDK,LANTOSPL.Adhesionoflympho2cytestocerebralmicrovascularcells:effectsofinterferon2gamma,tumournecrosisfactorandinterleukin21J.Immunology,1988,64(4):677-681.9王应灯,孙耕耘.灯盏花素对血小板活化因子致肺微血管内皮细胞损伤的影响J.中国药理学通报,2004,20(7):780-783.10薛峥,王雪松,阮旭中.灯盏花素对大鼠脑缺血后细胞间黏附分子21及其mRNA表达的影响J.中国病理生理杂志,2004,20(12):2287-2290.11HANJM,LEEWS,KIMJR,etal.Effectsofdiarylheptanoidsonthetumornecrosisfactor2alpha2inducedexpressionofadhesionmoleculesinhumanumbilicalveinendothelialcellsJ.JAgricFoodChem,2007,55(23):9457-9464.12KUMARS,SINGHBK,PANDEYAK,etal.AchromoneanaloginhibitsTNF2alphainducedexpressionofcelladhesionmoleculesonhumanendothelialcellsviablockingNF2kappaBactivationJ.BioorgMedChem,2007,15(8):2952-2962.13CSISZARA,SMITHK,LABINSKYYN,etal.Resveratrolat2tenuatesTNF2alpha2inducedactivationofcoronaryarterialendo2thelialcells:roleofNF2kappaBinhibitionJ.AmJPhysiolHeartCircPhysiol,2006,291(4):H1694-1699.14DEFAZIOG,NICOB,TROJANOM,etal.InhibitionofproteinkinaseCcounteractsTNFalpha2inducedintercellularadhesionmolecule1expressionandfluidphaseendocytosisonbrainmicro2vascularendothelialcellsJ.Br