灯盏细辛注射液对TNF-α 诱导内皮细胞炎症分子的影响.pdf

CHINESEJOURNALOFNEWDRUGS2009,183253中国新药杂志2009年第18卷第3期基金项目国家973计划2005CB523404；国家自然科学基金30572348；云南省科技计划2006YX03作者简介郭虹,女,博士研究生。联系电话02281125698,E2MAILCACTI1983163COM。通讯作者胡利民,男,研究员,主要从事中药神经药理和毒理研究。联系电话02223051120,E2MAILHULIMINTJUTCMEDUCN。实验研究灯盏细辛注射液对TNF2Α诱导内皮细胞炎症分子的影响郭虹,康立源,柴丽娟,胡利民,赵琳天津中医药大学中医药研究院,天津市中药药理学重点实验室,天津300193摘要目的研究灯盏细辛注射液ERIGERONBREVISCAPUSINJECTION,EBI对离体培养的大鼠脑微血管内皮细胞BMEC炎症相关细胞因子白细胞介素21ΒIL21Β及细胞间黏附分子21ICAM21、血管细胞黏附分子21VCAM21蛋白表达的影响,初步探讨EBI抗脑缺血炎症损伤的机制。方法采用肿瘤坏死因子2ΑTUMORNECROSISFACTOR2Α,TNF2Α建立离体培养的大鼠BMEC炎症损伤模型,分别用01MGL1和1MGL1EBI处理内皮细胞,使用ELISA试剂盒分析IL21Β蛋白表达的变化,流式细胞仪测定ICAM21和VCAM21荧光强度的变化。结果EBI可以抑制TNF2Α诱导的内皮细胞IL21Β高表达,降低TNF2Α诱导的内皮细胞ICAM21和VCAM21高表达。结论EBI可以降低由TNF2Α诱导的内皮细胞过度表达IL21Β,ICAM21和VCAM21,从而对脑缺血炎症损伤具有一定保护作用。关键词灯盏细辛注射液；脑微血管内皮细胞；肿瘤坏死因子2Α中图分类号R2855；R74331文献标识码A文章编号10033734200903025304EFFECTOFERIGERONBREVISCAPUSINJECTIONONTHEEXPRESSIONOFINFLAMMATORYMOLECULESINDUCEDBYTNF2ΑINENDOTHELIALCELLSGUOHONG,KANGLI2YUAN,CHAILI2JUAN,HULI2MIN,ZHAOLINTIANJINUNIVERSITYOFTRADITIONALCHINESEMEDICINE,TIANJINLABORATORYOFCHINESEMEDICINEPHARMACOLOGY,TIANJIN300193,CHINAABSTRACTOBJECTIVETOINVESTIGATETHEEFFECTOFERIGERONBREVISCAPUSINJECTIONEBIONTHEEXPRESSIONOFINTERLEUKIN21ΒIL21Β,INTERCELLULARADHESIONMOLECULE21ICAM21,ANDVASCULARCELLADHESIONMOLECULE21VCAM21INRATBRAINMICROVASCULARENDOTHELIALCELLSBMECCULTUREDINVITROMETHODSTHEINFLAMMATORYIN2JURYWASINDUCEDBYTUMORNECROSISFACTOR2ΑTNF2ΑINBMECSTHEENDOTHELIALCELLSWERETREATEDWITHEBIAT01AND1MGL1THEEXPRESSIONOFIL21ΒPROTEINWASDETECTEDBYELISA,ANDTHOSEOFICAM21ANDVCAM21WEREMEASUREDBYFLOWCYTOMETRYRESULTSEBIINHIBITEDTNF2Α2ENHANCEDEXPRESSIONOFIL21ΒINBMECSMEANWHILEITDIMINISHEDTNF2Α2ENHANCEDEXPRESSIONOFICAM21ANDVCAM21INBMECSCONCLUSIONEBIDECREASESTNF2Α2ENHANCEDEXPRESSIONOFIL21Β,ICAM21ANDVCAM21INBMECS,RESULTINGINAPROTECTIVEEFFECTONINFLAMMATORYIN2JURYAFTERCEREBRALISCHEMIAKEYWORDSERIGERONBREVISCAPUSINJECTION；CEREBRALMICROVASCULARENDOTHELIALCELLS；TUMORNECROSISFACTOR2ΑTNF2Α炎症反应在脑缺血发生后的迟发性脑损伤过程中扮演了重要角色,脑缺血时炎性细胞因子和其他炎性介质相继产生,并以网络形式在脑缺血损伤病理过程中发挥作用12。灯盏细辛是菊科植物短葶飞蓬ERIGERMBREVISCAPUSVANTHAND2MAZZ的干燥全草,又名灯盏花,但其作用机制尚未完全阐明3。本研究旨在考察灯盏细辛注射液ERIGERONBREVISCAPUSINJEC2TION,EBI对肿瘤坏死因子2ΑTNF2Α诱导的脑微血管内皮细胞BRAINMICROVASCULARENDOTHELIALCELL,BMEC黏附分子细胞间黏附分子21INTERCELLULARADHESIONMOL2CHINESEJOURNALOFNEWDRUGS2009,183254中国新药杂志2009年第18卷第3期ECULE21,ICAM21、血管细胞黏附分子21VASCULARCELLADHESIONMOLECULE21,VCAM21以及细胞因子白细胞介素21ΒINTERLEUKIN21Β,IL21Β的影响,初步探讨EBI抗脑缺血炎症损伤的机制,为临床用药提供实验依据。材料与方法1材料DMEM培养基GIBCO,胎牛血清HYCLONE,Ⅱ型胶原酶INVITROGEN,胶原酶/分散酶ROCHE,牛血清白蛋白BSA,ROCHE,PERCOLLGEHEALTHCARE,第Ⅷ因子相关抗原抗体与S2P免疫组化试剂盒北京中山试剂公司,乳酸脱氢酶LDH检测试剂盒中生北控生物科技有限公司,TNF2ΑPEPRO2TECH,噻唑蓝MTT,SIGMA,ICAM21和VCAM21抗体BDBIOSCIENCES,大鼠IL21ΒELISA检测试剂盒RD。MICROLAB300半自动生化分析仪VITALSCIENTIFIC,酶标仪TECAN公司,FACSCAN流式细胞仪BECKMAN公司。EBI由云南生物谷灯盏花药业有限公司提供,产品批号20050809,10ML含野黄芩苷和总咖啡酸酯共30MG。2BMEC培养根据CALABRIA等4的方法略加改动。取20D左右WISTAR大鼠脱臼处死,75乙醇消毒3～5MIN,取全脑置于冷D2HANKS液中去除小脑、间脑,仔细剥除血管、软脑膜等,保留大脑皮质,将其剪碎成1MM3大小,加入07GL1Ⅱ型胶原酶37℃消化1H,1000G离心10MIN,弃上清。加入20BSA悬浮混匀1000G离心20MIN,弃上层保留底部沉淀。加入1GL1胶原酶/分散酶37℃消化1H,700G离心6MIN,弃上清。加入DMEM培养液悬浮铺于经离心形成连续梯度的50的PERCOLL,1000G离心10MIN,吸出微血管段层,DMEM完全培养液悬浮后接种于75CM2培养瓶中,每隔2D换液1次,细胞长至70～80融合即可传代,实验选用第2代细胞。3BMEC鉴定形态结构观察在相差倒置显微镜下观察细胞生长情况。Ⅷ因子鉴定将生长在盖玻片上的细胞用4多聚甲醛固定,磷酸盐缓冲液PBS洗3次,滴加复合消化液室温放置10MIN,PBS洗3次,加含05TRITONX2100的山羊血清封闭30MIN,滴加兔抗鼠第Ⅷ因子相关抗原抗体1∶50,4℃孵育18H后,PBS洗3次,滴加生物素标记羊抗兔IGG,室温孵育1H,PBS洗3次,滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液,室温孵育20MIN,PBS洗3次,DAB显色。4EBI对BMEC的影响将传代的BMEC种于96孔板内长至融合状态,分为对照组正常培养液、01MGL1EBI组、1MGL1EBI组,继续培养24H,取上清液测定LDH活性；细胞加入MTT溶液孵育4H,弃培养液,加入二甲基亚砜,酶标仪492NM波长检测各孔的吸收度值。5双抗体夹心ELISA法检测IL21Β的水平将传代的BMEC种于6孔板内长至细胞融合,分为对照组正常培养液、TNF2Α终浓度25ΜGL1组、01MGL1EBITNF2Α组、1MGL1EBITNF2Α组,继续孵育16H,收集上清液,双抗体夹心ELISA法检测各组上清液中IL21Β的水平。6流式细胞仪检测ICAM21和VCAM21的荧光强度实验分组同“5”,细胞孵育16H后胰酶2EDTA消化成单细胞悬液,PBS洗涤,加入FITC标记的ICAM21和VCAM21抗体孵育,PBS洗涤后流式细胞仪检测阳性细胞百分率,每个样本计数3000个细胞。7统计学处理数据以均数标准差珋XS表示,用SPSS统计软件包进行分析,组间比较采用单因素方差分析。结果1BMEC形态与鉴定倒置显微镜下观察,细胞呈短梭形,偶见多角形,单层生长并有接触抑制现象,符合内皮细胞生长特性。通过Ⅷ因子免疫细胞化学染色鉴定,阳性细胞胞浆呈棕褐色。见图1。A融合后的BMEC100BⅧ因子染色阳性200CⅧ因子染色阴性200图1BMEC形态及Ⅷ因子免疫细胞化学染色鉴定CHINESEJOURNALOFNEWDRUGS2009,183255中国新药杂志2009年第18卷第3期2EBI对BMEC活力和LDH释放的影响EBI01和1MGL1与BMEC共同孵育24H后,细胞活力、LDH释放与正常组比较均无显著性差异,EBI01和1MGL1对BMEC活力无明显影响。结果见表1。表1EBI对BMEC的影响N6,珋XS组别剂量/MGL1MTTA492NMLDH/UL1对照017900292900712EBI01016100122071263EBI10173002533715593EBI对TNF2Α诱导BMEC释放IL21Β的影响对照组IL21Β的水平很低,TNF2Α组IL21Β的水平较对照组显著性升高P001,01和1MGL1EBI孵育的BMEC分泌的IL21Β水平低于TNF2Α组P005,P001,差异有统计学意义。结果见图2。A对照；BTNF2Α；C01MGL1EBITNF2Α；D1MGL1EBITNF2Α与A组比较,AP001；与B组比较,BP005,CP001图2EBI对TNF2Α诱导BMEC释放IL21Β的影响N54EBI对TNF2Α诱导BMEC膜表面ICAM21和VCAM21荧光强度的影响流式细胞仪检测细胞膜表面ICAM21和VCAM21的荧光强度,结果显示TNF2Α刺激内皮细胞16H后ICAM21和VCAM21荧光强度显著性增加P0101,P005,1MGL1EBI可显著降低ICAM21和VCAM21荧光强度P005,01MGL1EBI有降低的趋势。结果见图3。A对照；BTNF2Α；C01MGL1EBITNF2Α；D1MGL1EBITNF2Α与A组比较,AP005,BP001；与B组比较,CP005图3EBI对TNF2Α诱导BMEC膜表面ICAM21和VCAM21荧光强度的影响N5讨论脑缺血损伤后,缺血区产生大量具有致炎作用的细胞因子,诱导多种黏附分子的表达,促进白细胞的浸润,产生炎症反应,因此黏附分子及细胞因子与脑缺血损伤密切相关5。TNF2Α是具有多效性作用的促炎性细胞因子,能通过促进凝血、增加内皮细胞通透性及诱导黏附分子或其他炎性介质表达,从而加重缺血脑损伤。研究报道67,TNF2Α可增加内皮细胞黏附分子的表达,促使细胞因子的MRNA转录及表达,从而起到协同致炎作用。本研究考察了EBI是否能抑制TNF2Α诱导的炎症蛋白表达。参考文献8并初步筛选,25ΜGL1TNF2Α诱导内皮细胞16H黏附分子表达可维持较高水平,此方法可用于后期实验。EBI主要含野黄芩苷和总咖啡酸酯,有一定的内皮细胞保护作用及抗氧化作用,能够保护内皮细胞免受损伤9。体内实验研究表明,灯盏花素能显著下调大鼠脑缺血后ICAM2LMRNA及其蛋白的表达,从而抑制内皮细胞2白细胞的黏附,减轻缺血后再灌注损伤10。本研究首先观察了EBI是否能够抑制TNF2Α诱导内皮细胞IL21Β的水平。结果显示单独使用TNF2Α刺激内皮细胞16H,IL21Β水平明显增加,01和1MGL1EBI分别与TNF2Α共同作用内皮细胞16H,IL21Β水平明显降低。其次,本研究观察了EBI对TNF2Α诱导内皮细胞ICAM21和VCAM21表达的影响。ICAM21和VCAM21在正常脑血管内皮表达水平较低,TNF2Α刺激后表达明显升高,这与HAN等11的研究结果基本一致。EBI和TNF2Α共同作用的内皮细胞膜表面ICAM21和VCAM21的荧光强度明显降低,表明EBI抑制了CHINESEJOURNALOFNEWDRUGS2009,183256中国新药杂志2009年第18卷第3期TNF2Α诱导的炎症蛋白分子表达。这些结果提示EBI对BMEC炎性细胞因子、黏附分子具有一定调节作用,可能是其治疗脑缺血炎症机制之一。研究报道1213,抑制内皮细胞NF2KAPPAB活性,可以抑制黏附分子高表达。也有研究表明蛋白激酶CPKC抑制剂可拮抗黏附分子的表达,减轻脑缺血/再灌注神经元损伤14。EBI是通过何种途径降低TNF2Α诱导的内皮细胞黏附分子及细胞因子高表达的,还有待于进一步研究。参考文献1PRUNELLGF,SVENDGAARDNA,ALKASSK,ETALINFLAM2MATIONINTHEBRAINAFTEREXPERIMENTALSUBARACHNOIDHEMORRHAGEJNEUROSURGERY,2005,565108210922SIMAKJ,GELDERMANMP,YUH,ETALCIRCULATINGENDO2THELIALMICROPARTICLESINACUTEISCHEMICSTROKEALINKTOSEVERITY,LESIONVOLUMEANDOUTCOMEJJTHROMBHAEMOST,2006,46129613023张春霞,康立源,胡利民,等灯盏细辛中黄酮类成分药理活性的研究进展J中国新药杂志,2008,1721101134CALABRIAAR,WEIDENFELLERC,JONESAR,ETALPURO2MYCIN2PURIFIEDRATBRAINMICROVASCULARENDOTHELIALCELLCULTURESEXHIBITIMPROVEDBARRIERPROPERTIESINRESPONSETOGLUCOCORTICOIDINDUCTIONJJNEUROCHEM,2006,9749229335张丽慧,魏尔清ICAM21、VCAM21在脑缺血损伤炎症机制中的作用及调控J中国药理学通报,2005,2111128112856RADOMSKA2LES’NIEWSKADM,SADOWSKAAM,VANOVER2VELDFJ,ETALINFLUENCEOFN2ACETYLCYSTEINEONICAM21EXPRES2SIONANDIL28RELEASEFROMENDOTHELIALANDEPITHELIALCELLSJJPHYSIOLPHARMACOL,2006,57SUPPL43253347KIMYS,AHNY,HONGMH,ETALCURCUMINATTENUATESIN2FLAMMATORYRESPONSESOFTNF2ALPHA2STIMULATEDHUMANENDOTHELIALCELLSJJCARDIOVASCPHARMACOL,2007,50141498HUGHESCC,MALEDK,LANTOSPLADHESIONOFLYMPHO2CYTESTOCEREBRALMICROVASCULARCELLSEFFECTSOFINTERFERON2GAMMA,TUMOURNECROSISFACTORANDINTERLEUKIN21JIMMUNOLOGY,1988,6446776819王应灯,孙耕耘灯盏花素对血小板活化因子致肺微血管内皮细胞损伤的影响J中国药理学通报,2004,20778078310薛峥,王雪松,阮旭中灯盏花素对大鼠脑缺血后细胞间黏附分子21及其MRNA表达的影响J中国病理生理杂志,2004,20122287229011HANJM,LEEWS,KIMJR,ETALEFFECTSOFDIARYLHEPTANOIDSONTHETUMORNECROSISFACTOR2ALPHA2INDUCEDEXPRESSIONOFADHESIONMOLECULESINHUMANUMBILICALVEINENDOTHELIALCELLSJJAGRICFOODCHEM,2007,55239457946412KUMARS,SINGHBK,PANDEYAK,ETALACHROMONEANALOGINHIBITSTNF2ALPHAINDUCEDEXPRESSIONOFCELLADHESIONMOLECULESONHUMANENDOTHELIALCELLSVIABLOCKINGNF2KAPPABACTIVATIONJBIOORGMEDCHEM,2007,1582952296213CSISZARA,SMITHK,LABINSKYYN,ETALRESVERATROLAT2TENUATESTNF2ALPHA2INDUCEDACTIVATIONOFCORONARYARTERIALENDO2THELIALCELLSROLEOFNF2KAPPABINHIBITIONJAMJPHYSIOLHEARTCIRCPHYSIOL,2006,2914H1694169914DEFAZIOG,NICOB,TROJANOM,ETALINHIBITIONOFPROTEINKINASECCOUNTERACTSTNFALPHA2INDUCEDINTERCELLULARADHESIONMOLECULE1EXPRESSIONANDFLUIDPHASEENDOCYTOSISONBRAINMICRO2VASCULARENDOTHELIALCELLSJBRAINRES,2000,863122245248编辑朱振家/接受日期20080523★药用植物灭绝是一场“无声的灾难”用于治疗癌症、疟疾和其他疾病的关键药用植物正在被过度开采,这有可能让数百万人的健康面临风险。本周,国际自然保护组织PLANTLIFE发出了这一警告。根据该组织的一份报告,将近1/3的药用植物可能灭绝,中国、印度、肯尼亚、尼泊尔、坦桑尼亚和乌干达都报告了有药用植物灭绝。导致灭绝的原因包括过度的商业攫取、污染、来自入侵物种的竞争,以及栖息地的破坏。该报告的作者ALANHAMILTON说,解决方案是“为当地社区提供保护这些植物的激励措施”。这种方法已经被证明在乌干达获得了成功,在那里已经建立了一个低成本的疟疾药物的可持续供应来源。而中国则建立了一个社区运营的药用植物保护区。该报告提到了10个这样的基层项目。“改善健康、获得收入并维护文化传统,这些手段对于激励人们保护药用植物及其栖息地是很重要的。”HAMILTON说。来源NEWSCIENTIST★欧盟批准达芦那韦作为联合用药组分用于初治HIV21成人感染者TIBOTEC制药公司2月3日宣布,欧盟委员会已经批准一日1次用药剂量为800MG的达芦那韦DARUNAVIR,辈力,PREZISTA片剂与低剂量利托那韦RITONAVIR合用作为联合用药的组成部分用于初治HIV21成人感染者。欧盟做出此次批准是基于一项在初治HIV21成人感染者中进行的开放标记III期临床研究ARTEMIS研究所获得的48周血浆HIVRNA水平和CD4细胞计数分析。此项研究比较了达芦那韦利托那韦和洛匹那韦LOPINAVIR利托那韦分别与其他抗逆转录病毒药联用的疗效和安全性。研究资料显示,达芦那韦不逊于洛匹那韦达芦那韦组有84的患者病毒载量降至检测限低于50拷贝/ML以下,而洛匹那韦组为78。达芦那韦组报告的中度及以上≥2级常见不良反应有高三酰甘油血症、高胆固醇血症、头痛、腹泻、恶心及丙氨酸转氨酶升高。来源中国医药数字图书馆网站