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125OH2D3对哮喘小鼠肺内TIM4表达的影响125OH2D3对哮喘小鼠肺内TIM4表达的影响 -- 260 元

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AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterEffectof1,25一OH2D3ontheexpressionofTIM4●●●●●inlungofasthmatlCmiceByYaZheWangSupervisorProf.BinLuanPaediatricsTheThirdAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversityMay2013学位论文原创性声明本人郑重声明所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者Fillzof弓年6月f日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品,知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时,第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者日期hB年月f日摘要1,25.oH2D3对哮喘小鼠肺内TIM.4表达的影响硕士研究生王亚哲导师栾斌专业儿科学郑州大学第三临床学院河南郑州450052摘要支气管哮喘是儿童时期呼吸系统常见的疾病之一,以气道慢性炎症、气道高反应性和气道结构的重塑为基本病理特征,其发病机制复杂,主要考虑和机体自身免疫反应异常应答相关,但目前尚未完全阐明。支气管哮喘的发病机制主要集中于1111胁2细胞分化失衡后引起的一系列异常免疫应答。Thl、Th2细胞的分化方向及分泌功能己逐步被人了解,但其刺激分化的分子机制尚未完全清楚。T细胞免疫球蛋白域粘蛋白域蛋白Tcellimmunoglobulinmucinprotein,TIM基因家族是新近发现的哮喘易感基因家族成员,因其转录蛋白最早被发现表达,于T淋巴细胞表面,故而得此名。研究表明,TIM蛋白具有双向调节T细胞分化的作用。TIM.4仅表达于抗原提呈细胞表面,如树突状细胞、巨噬细胞等,包括四个区段。研究证实其与免疫性疾病如肿瘤免疫耐受、肾脏缺血再灌注损伤及支气管哮喘等有密切关系,但对其发挥生物学效应的具体机制尚未完全明确。1,25.OH2D3是维生素D3的活性代谢产物,除骨钙调节作用外,还调节着机体自身免疫反应。其免疫调节作用亦主要通过改变树突状细胞及单核细胞的活性来实现。目前关于l,25.OH2D3对哮喘患儿的保护作用,在流行病学调查及临床实践中,已得到证实,但其明确的机制原理,尚未明确。本研究通过建立哮喘小鼠气道重塑模型,使用1,25.OH2D3腹腔注射进行干预治疗,观察哮喘小鼠气道重塑改善情况及TIM.4蛋白及mRNA表达改变,从而更深入挖掘哮喘的发病机制,为哮喘的治疗寻找新的靶点。摘要目的在哮喘小鼠气道重塑模型上,使用l,25.OH2D3腹腔注射,进行干预治疗,测量治疗后哮喘小鼠气道壁厚度,与哮喘组比较是否有所好转测定肺组织内TIM.4表达量的改变。旨在从新的角度分析哮喘发病机制,为哮喘的治疗开辟道路。II摘要材料和方法1实验动物分组及哮喘模型制备30只雌性、健康、8周龄的BALB/c系小鼠,适应性饲养l周后,按照随机原则将小鼠分为对照组、哮喘组和1,25.OH203干预组,每组10只,制备动物模型。模型致敏阶段哮喘组及1,25.OH203干预组小鼠在实验的第1、8、15天分别给予腹腔注射抗原混合液O.2mL含OVA50g、10%氢氧化铝O.15mL和生理盐水0.05mL,对照组则给予0.2mL生理盐水代替。模型激发阶段哮喘组及1,25.OH2D3干预组小鼠分别于实验的第22天在自制玻璃容器中给予雾化吸入1%OVA溶液5mL进行激发,1次/天,30miIl/次,持续雾化14次,至实验第35天结束,对照组以生理盐水取代OVA雾化吸入。模型干预治疗1,25.oH2D3干预组于雾化激发前30min给予腹腔注射l,25.OH2D3混合液0.1mL含l,25.OH2D3O.1ug、无水乙醇2.5此、生理盐水O.1mL,哮喘组及对照组小鼠均以等剂量生理盐水替代1,25.OH2D3混合液。2肺组织标本的制备末次雾化结束后24小时内,采用乙醚吸入麻醉各组小鼠,将小鼠固定于操作台上,开胸,暴露小鼠肺组织及心脏,结扎左侧肺门,取出左肺,冻存于液氮,转存至.80℃冰箱内,留做RT.PCT检测标本迅速经右心室插管至肺动脉,用大量生理盐水快速冲洗肺组织至肺叶颜色呈白色,无血液样物质流出时,换4%甲醛溶液冲洗进行内固定,剪断支气管取出右肺组织及心脏,摘取右肺中叶,置于4%甲醛溶液中避光进行外固定48h以上,石蜡包埋,3岬厚度切片,用于HE染色及免疫组织化学染色。3HE染色石蜡切片后,将切片置于二甲苯溶液中常规脱蜡后,进行苏木精.伊红染色,显微镜下观察支气管壁形态学改变及周围炎症细胞浸润情况,测定同等级别支气管壁厚度,比较气道重塑情况。III摘要4免疫组化染色将己切片好的3lam厚度的石蜡切片放入60℃恒温烤箱中进行烘烤,时间设定2小时,结束后取出自然冷却,放入二甲苯溶液中重复脱蜡2次,浓度逐渐下降的乙醇溶液中浸泡使肺组织标本水化,蒸馏水冲洗、PBS液冲洗后,加入抗原修复液进行修复,而后在切片上依次滴加山羊抗小鼠一抗、二抗、辣根酶标记的链霉卵白素、DBA显色、苏木素复染、盐酸分化,而后脱水封片,进行免疫组化操作。应用计算机病理图像分析系统在光学显微镜高倍镜视野10x40下观察并测定阳性细胞中蛋白的表达。每张切片选取5个以上高倍镜视野,取平均值做为该片的蛋白半定量结果。5RTPCR检测TIM.4mRNA表达取黄豆大小冻存的左肺肺组织,用Tfizol提取总RNA,加入逆转录试剂后,在RTPCR扩增仪中合成单链eDNA,加入已设计引物,扩增目的基因。TIM.4PCR产物为291bp上游引物为5.CAATCGAGGTGACAGTGGG.3下游引物为5.AAGGAGCCAGGTGTTGTTG.3退火温度58℃。内参PCR产物为549bp上游引物5.ATCACTGTCTTCCAGGAGC.3下游引物5ATCATACTTGGCAGGTTTcT.3t退火温度52。C。扩增产物在琼脂糖凝胶上进行电泳,并采用凝胶电泳成像系统观察目的基因,并测定目的基因的灰度值。6统计学分析采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析。各组计量资料均采用均数4标准差X±S表示,组间差异性分析采用单因素方差分析、LSDt检验,以QO.05为检验标准。结果1各组小鼠病理形态学改变在普通光学显微镜高倍镜10x40下观察哮喘组小鼠支气管壁增厚、受损,管腔狭窄变形,可见大量粘液分泌,平滑肌层增厚,杯状细胞化生,上皮细胞脱落,支气管壁周围及血管壁周围炎性细胞浸润增多。1,25.OH2D3干预组IV摘要小鼠亦出现上述变化,较哮喘组有所减轻,支气管壁厚度较哮喘组明显变薄。对照组小鼠气管壁结构完整光滑,上皮细胞排列整齐,无杯状细胞化生,气道壁厚度正常。各组间支气管壁厚度的两两比较,差异有统计学意义。2各组小鼠免疫组化结果免疫组化染色后,TIM.4呈棕黄色,主要存在于肺泡间质、支气管壁及血管周围。哮喘组小鼠中可见大量TIM.4黄染颗粒,呈强阳性表达1,25.OH2D3干预组较哮喘组表达有所减弱,对照组仅少量黄染颗粒,呈弱阳性。各组问比较,差异具有统计学意义。3各组小鼠肺组织内TIM.4mRNA检测结果RTPCR电泳结果是哮喘组亮度最强,其定量灰度均值为0.650士0.023,干预组亮度弱于哮喘组,强于对照组,其灰度值为0.4350.020,对照组为O.10540.011各组间比较有差异,且差异有统计学意义。结论1.1,25.0H2D3通过下调TIM.4的表达来降低哮喘发作的严重程度,减轻气道炎症反应,改善气道重塑。2.1,25.OH2D3可望成为哮喘新的辅助治疗药物。关键词哮喘气道重塑1,25.oH2D3TIM.4小鼠VAbstractEffectof1,25一OH2D3ontheexpressionofTIM4inlungofasthmaticmicePostgraduateYazheWangSupervisorBinLuanMajorPediatricsTheThirdAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversityZhengzhouHenan450052AbstractBronchialasthmaisacommondiseaseofchildrespiratorysystem.ItSbasicpathologicalfeaturearechronicinflammation、airwayhyperreactivity、airwayremodeling.ItSpathogenesisiscomplex,themainconsiderationisabnormalresponseofthebodysownimmuneresponsebuthasnotyetbeenfullyelucidated.ThepathogenesisofbronchialasthmaismainlyfocusedonThl/Th2celldifferentimionimbalance,thenleadtoaseriesofabnormalimmuneresponse.Thl、Th2cellsdifferentiationandsecretoryfunctionhasgraduallybeenunderstoodbutstimulatingthedifferentiationofthemolecularmechanismsarenotyetfullyclear.Tcellimmunoglobulinmucinproteingenefamilyisanewlydiscoveredgenefamily.AsitStranscriptionproteinfirsttobediscoveredexpressedonthesurfaceofTlymphocytes,SOwascalledTIMgenefamily.StudyshowthatTIMproteinwithbi.directionalregulationofTcelldifferentiation.IntheTimproteinfamily,thereisaproteinnamedTim4,itmainlyexpressesinthesurfaceofactiveddendriticcellandmacrophage。Itplayaimportantroleintumorimmunetolerance、kidneyischemiareperfusioninjury、bronchialasthmaandsomeotherimmunedisease,butitisremainunclearabouthowtoexertitSbiologicaleffect。1,25OH2D3istheactivemetaboliteofVataminD3.Excepttheaffectofbonecalciumregulation,italsocanregulatetheimmunizationviadendriticcellandmacrophage。Atpresent,aboutwhetherl,25OH2D3doprotectiveeffecttopatientsofasthma,haveVIAbstractnoclearconclusion。Inourstudy,weestablishasthmamiceSairwayremodlingmodel,use1,25.OH2D3intraperitonealinjectionintervene,getthechangeofthemiceairwayremodlingcondition、TIM一4proteinanditsmRNA,tofindmoreaboutasthmapathogenesis,inordertofindnowcureforasthma。ObjectiveWeestablishedasthmamiceairwayremodlingmodel,use1,25OH2D3intraperitonealinjectiontointervene.Thenmeasuretheairwaythicknessoftheinterventiongroupmice,andcomparedwithasthmagroup,obtainwhetheritimprovedornot.ObtainthechangeofasthmamiceTim一4.Consequently,seekthenewwayforasmathtreat,openthewayforthetreatmentofasthma.MaterialsandMethods1Animalgroupsandasthmamodelpreparation30healthy、clean、8weeksfemaleBALB/cmice,adaptivefeedingforoneweek,accordingtotheprincipleofrandom,dividedthe30miceintothreegroupsthecontrolgroup,theasthmagroup,1,25一OH2D3interventiongroup。Eachgrouphas10mice,usedtomakeanimalmodel。ModelsensitizationphaseTheasthmagroupand1,25.OH2D3interventiongroup,inthedayof1、8、15oftheexperiment,equalyintraperitonealinjectionofantigenmixture0.2mLtosensitize,andthemixtureincludeovalbumin50¨g、10%aluminum0.15mL、normalsaline0.05mL。Thecontr01groupwasgiven0.2mLofnormalsalineinsteadof.ModelexcitationphaseTheasthmagroupand1,25一OH2D3interventiongroupfromthedayof22,use1%ovalbumin5mEaerosolinhalationtostimulate,onceeveryday,everytime30minute,untilthedayof35,14timesina11.ThecontrolgroupusenormalsalinereplaceOVAtoatomizedinhalation.ModelinterventionBeforestimulateof0.5h,1,25.OH2D3interventiongroupWasgivenintraperitonealinjectionof1,25。OH2D3mixture0.1mLeverytime,andthemixtureinclude1,25OH2D30.1ug、absoluteethylalcohol2.5uL、normalsaline0.1mL.TheasthmagroupandthecontrolgroupVII
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vyyolyg827上传于2014-03-19

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