Bax抑制肽对HIBD新生大鼠海马区细胞色素C及Caspase3蛋白的影响

Bax抑制肽对BD新生大鼠海马区细胞色素C及Oaspase一3蛋白的影响于葡妻目的 观察Bax-抑制肽(Baxinhibiting peptide，BIP)对缺氧缺血性脑损伤(hypoxiaischemic brain damage，HIBD)新生大鼠海马神经细胞的细胞色素C(cytocllrome C，Cyt C)及促凋亡蛋白半胱氨酸蛋白酶(caspase一3)的影响，以探讨Bax抑制肽对HIBD后的神经保护作用，为临床治疗新生儿缺氧缺血性脑损伤提供理论依据。方法182只7日龄Wistar大鼠，随机分为假手术组(n=14只)、对照组(n=84只)、干预组(n=84只)。对照组与干预组通过结扎新生大鼠左侧颈总动脉和8低氧处理2h制备新生大鼠HIBD模型，假手术组仅游离左侧颈总动脉，不予结扎及低氧处理。干预组于HI即刻、6h、12h、24h、48h、72h左侧侧脑室内注射5ugBIP(即5u1)，对照组于相同时间点予等量生理盐水(5u1)左侧侧脑室内注射，按注射时间点不同分别分为6个不同亚组。所有实验动物均于术后7d处死。应用HE染色、末端脱氧核甘酸转移酶(TdT)介导的生物素化-dUTP原位缺口末端标记法(TUNEL)及蛋白免疫印迹法(Western Blot)观察各组病理变化、细胞凋亡及Cyt C、Caspase一3蛋白释放情况。结果 (1)海马区TUNEL阳性细胞数目变化：对照组及干预组HIBD后左侧大脑海马区TUNEL阳性细胞表达较假手术组显著增加，差异有极显著性意义(尸001)。干预组与对照组在0h、6h、12h、24h、48h亚组比较，凋亡细胞数目明显减少(P001)，干预组0h亚组凋亡细胞数较干预组6h、12h、24h、48h亚组减少(PO05)；(2)活性caspase一3及Cyt C的含量变化：对照组及干预组caspase一3活性片段、Cyt C释放量较假手术组显著增加，差异有极显著性意义(p001)。干预组与对照组在Oh、6h、12h、24h、48h亚组比较，caspase-3活性片段、Cyt C释放量显著减少(PO01)，干预组0h亚组caspase一3活性片段、Cyt C释放量较干预组6h、12h、24h、48h亚组减少(PO05)。结论Bax一抑制肽治疗能显著降低HIBD新生大鼠海马神经细胞凋亡发生率，HI后48小时内为BIP最佳治疗时间窗，治疗时间越早作用越显著，以HIBD即刻注射效果最佳。其机制可能与保护线粒体膜，减少Cyt C释放，减轻或抑制caspase一3蛋白酶活性有关。硕士研究生 于茂敏(儿科学)指导教师 姜红教授关键词： capase一3；细胞色素C；Bax抑制肽；缺氧缺血，脑；凋亡；新生，大鼠Effect of Baxinhibiting peptide on cytochrome C and Caspase-3expression in Neonatal Rats with hypoxic-ischemicAbstractbrain damageIIMIIIkklIIllllIIIIllIIIIImIIIIIIIJY2338742objectives To observe the effects of cytochrome C and Caspase3 expression byBax-inhibiting peptide(BIP)in different interval intracerebroventricular injection inneonatal rats with hypoxic-ischemic brain damage(HIBD)，and to explore theneuroprotective effect Bax-inhibiting peptide after hypoxic-ischemic brain damage，providing a theoretical basis for the clinical treatment of neonatal hypoxicischemicbrain damageMethods 1 82 sevenday-old Wistar rats were randomly divided intosham。operated group(n 2 1 4)，control group(n 2 84)，treatment group(n=84)，Theright carotid arteries of rats in sham-operated group were only isolated，withoutligation，ischemia，hypoxia and medication，while control group and treatment groupwere made by shearing fight carotid arteries communis and breathing 8oxygen fortwo hoursThe newborn rats of treatment group and control group was separatelyinjected Bax-inhibitory peptide(5 u1)and normal saline(5 u1)through the left laeralventricular respectively in immediately、6 h，1 2 h、24 h、48 h and 72 h after HIBDmodel establishment，divided into 6 subgroups by inj ection time pointAll newbornrats included in this study were put to death at 7 days after HIBD model establishmentCerebral pathomorphological changes was observed by HE staining and TUNELmethodThe cytochrome C and Caspase3 expression in neonatal rats brain，asexamined by Western blot detectionResults(1)Changes in the number of TUNELpositive cells in the hippocampus：Compared with sham-operated group，TUNEL-positive cells in the left hippocampuswere significantly increased in control group and treatment group after HIBDThedifference was very significant(PO0 1)The number of TUNEL positive cells intreatment group was lower than that in control group significantly at 0 h，6 h，1 2 h，24h，48 h after HIBD(P00 1)The number of TUNEL positive cells in Oh group waslower than that in 6h，1 2h，24h，48 group(P00 1)(2)Expression of active caspase-3and Cyt C：Compared with sham-operated group，The amount of active caspase3 andCyt C were significantly increased in control group and treatment group after HIBDThe difference was very significant(PO0 1)The amount of active caspase3expression and Cyt C in treatment group was lower than that in control groupsignificantly at 0 h，6 h，1 2 h，24 h，48 h after HIBD(P00 1)The amount of activecaspase一3 expression and Cyt C in Oh group was lower than that in 6h，1 2h，24h，48hgroup fP001)Conclusions Bax-inhibiting peptide treatment attenuates neuronal apoptosisfollowing HIBDThe effective treatment time window of Bax inhibitor peptide inhypoxia ischemia time is within 48h after HIBDIts mechanism may be related toprotect the mitochondrial membrane，through a reduction in Cyt C release frommitochondria and an inhibition of caspase3 enzyme activityPostgraduate student：Yu Maomin(Pediatrics)Directied by ProfJiang HongKey words Capase-3；Cytochrome C；Bax-inhibiting peptide；Hypoxiaischemicbrain；Cell apoptosis；Neonatal rats目录引言一l第1章材料与方法311 材料3111 实验动物31i2 实验药品和试剂3113 主要实验仪器及设备412 方法4121 实验动物的分组与处理4122 标本采集5I23 制备脑组织切片5124 HE切片制作6125 TUNEL法检测神经细胞凋亡6I26 Western blot检测caspase一3和细胞色素C的释放量7第2章数据采集及处理“821 数据采集822 统计学处理8第3章结果93I 新生大鼠HIBD模型建立后的神经行为评价一932 新生大鼠脑组织海马区HE染色形态学改变”933 TUNEL技术检测新生大鼠海马区凋亡细胞计数934 Western blot检测细胞色素C的释放量1035 Western blot检测活性caspase3的释放量11第4章讨论1 3第5章 结论1 9刚图表20参考文献24综杰盎29攻读学位期间的研究成果37iil：谢3 8学位论文独创性声明、学位论文知识产权权属声明39引言Bax抑制肽对BD新生大鼠海马区细胞色素C及Caspase一3蛋白的影响引言缺氧缺血性脑损伤(hypoxicIschemicbraindamage，HIBD)是由于胎儿宫内窘迫、新生儿窒息等引起的新生儿脑部严重损伤，目前仍是新生儿期最多见及最严重的疾病之一，发病率及死亡率居高不下，也是导致智能落后和脑性瘫痪等儿童伤残的主要原因，受到国内外学者的广泛关注。HBID的发生受多种因素影响，目前尚缺乏特异的治疗方法晗1，如何及时采取有效的干预措施，改善预后，提高患儿的生存质量是临床工作者亟待解决的问题。HIBD发病机制复杂，涉及能量代谢障碍、氧自由基损伤、钙超载、N0的神经毒性作用、兴奋性氨基酸的毒性作用等因素，最终引起神经元多发性损伤而导致细胞死亡。细胞死亡存在坏死及凋亡两种形式。其中细胞凋亡是后期神经细胞缺失和功能障碍的主要原因。Hill口1等用新生7日龄大鼠制成HIBD模型证实了缺氧缺血性脑损伤后神经细胞凋亡的存在，缺氧缺血后导致的神经细胞死亡其机制比较复杂并涉及多条信号传导途径，其中线粒体在不同死亡信号传导途径中起关键调节作用，成为调控细胞凋亡的靶点。已知至少有两条通路可导致线粒体通透性增加H剖。一种是存在于线粒体内膜的渗透性转换孔(PT)的开放；另一种是依赖于BaxBak的线粒体外膜的直接开放。在成熟脑中缺血可以引起线粒体PT孔道开放导致细胞坏死。抑制PT孔道对成年脑损伤有保护作用。但是在未成熟脑中，线粒体PT孔道抑制剂对缺氧缺血性脑损伤无任何保护作用。而Bax在未成熟脑中呈高表达盯1，并且在线粒体通透性调节中起关键作用。Bax途径导致的线粒体膜通透性的改变可能是引起幼年脑损伤的重要环节。Bax是Bcl一2家族中一种促进细胞凋亡的蛋白，在未成熟脑中呈高表达，通常在胞质中以单体的形式存在，细胞接受到死亡信号的刺激时，胞浆中的促凋亡蛋白Bax发生构象改变睛3。激活Bax蛋白并使其移位至线粒体内形成同源二聚体蛋白通道，线粒体膜上的细胞色素C通过插入到线粒体外膜上的Bax通道释放到胞浆，在ATPdATP的参与下，在胞质中与Apaf一1结合形成寡聚体，Apaf-l通过其氨基端和Caspase一9前体的功能前区相互作用，导致Caspase一3激活成为具有活性的酶，从而降解下游底物，导致细胞凋亡。近年来对细胞凋亡的研究认为细胞色素C和半胱氨酸蛋白酶caspase一3是凋亡发生和调控机制中最重要的组成部分。缺氧缺血等因素可使线粒体膜通透性增加，线粒体受破坏，释放细胞色素C和其他死亡因子(如青岛大学硕士学位论文凋亡诱导因子AIF)到胞浆中，胞浆内细胞色素C与凋亡蛋白活性因子工(apoptoticprotease activatingfactor一1，Apaf一1)结合使之活化，后Apaf一1者可导致caspase9的自身剪切与活化，活化的caspase 9可激活caspase 3，进而导致细胞凋亡u2。1。Bax抑制肽(BIPs)是一种从Ku70(一种核蛋白)提取的细胞通透性多肽，能够通过血脑屏障，通过Bax蛋白结合域与促凋亡蛋白Bax相互作用，阻止其构象发生改变和线粒体移动，从而保护细胞免受Bax介导的凋亡的影响，可以有效地阻断Caspase依赖的细胞凋亡n引。目前已有研究发现Bax抑制性肽可以降低未成熟脑缺氧缺血后线粒体膜腔隙中的促凋亡蛋白的释放以及Caspase级联反应的激活减轻脑损伤u71。国外已有相关体外实验研究发现，Bax一抑制肽具有良好的细胞膜穿透能力，其氨基酸序列与bax的结合结构域相对应，可与胞浆中的内Bax蛋白相结合，抑制Bax结构的改变及向线粒体的移位，进而抑制线粒体膜上bax通道开放，阻止线粒体膜通透性下降，抑制细胞色素C从线粒体中释放，阻断capase蛋白酶系列级联反应，从而保护神经细胞对抗细胞凋亡H引。目前尚缺乏Bax抑制肽在体内阻止线粒体膜通透性下降，抑制细胞色素C从线粒体中释放，与Caspase一3等蛋白酶结合发生级联反应的相关报道，因此本研究在选用新生7日龄Wistar大鼠制备围产期缺氧缺血脑损伤HIBD模型的基础上，通过抑制线粒体膜通透性转变(MPT)激活的第二条途Bax途径，在新生大鼠HIBD后不同时间点予侧脑室注射Bax一抑制肽，利用HE、TUNEL、免疫组织化学染色、Western Blot技术定量分析Bax抑制肽对细胞色素C和促凋亡蛋白半胱氨酸蛋白酶caspase一3在新生大鼠HIBD后大脑皮质海马区的改变，以评价Bax抑制肽的线粒体保护作用，防治新生大鼠缺氧缺血性脑损伤神经细胞凋亡的疗效，为临床应用神经类营养药物提供实验及理论依据。2材料与方法第一章材料与方法11材料111实验动物新生7日龄Wistar大鼠SCXK(鲁)20090007，雌雄不限，体质量12169，共182只，由青岛市实验动物和动物实验中心提供。1。12实验药品和试剂1 细胞色素C抗体产品编号：BS-0013R英文名称：AntiCytochrome C生产商名：北京博奥森生物技术有限公司2 活化半胱胺酸蛋白酶蛋白一3抗体产品编号：BS0081R英文名称：AntiCaspase一3(Active)生产商名：北京博奥森生物技术有限公司4 Bax一抑制肽英文名称：BaxInhibiting Peptide，V5产品批号：196810生产商名：德国默克医药公司产品规格：5 mgmL5 高灵敏度化学发光检测试剂盒产品货号：CW0049生产商名：北京康为世纪生物科技有限公司6 细胞凋亡试剂盒英文名称：(Roche)Tunel试剂盒产品货号：11684817生产商名：上海罗氏公司7 自各试剂及用品手术器械载玻片及盖玻片防脱片用多聚赖氨酸02molL磷酸氢二钠储存液：500ml蒸馏水加Na2HP0412H20 3581902molL磷酸二氢钠储存液：500ml蒸馏水加NaH2P042H20 1560902molL磷酸缓冲液(pH 76)1青岛大学硕士学位论文4中性缓冲多聚甲醛固定液：40甲醛与001M PBS之比为l：9配制1 0水合氯醛溶液8氮氧混合气体：青岛华瑞气体科技有限公司113主要实验仪器及设备1 显微镜及显微成像系统2微量注射器(10u1)3脑组织切片机4 蛋白电泳系统5 蛋白转膜系统6 化学发光成像系统7 常压缺氧舱装置12方法OLYMPUS BX4 1上海医用仪器厂Leika2235BioRad MiniPROTEANTetra II北京六一DYY一7C型Fusion X7型自制(见照片3)121实验动物的分组与处理1 动物分组新生7日龄Wistar大鼠，雌雄不限，体质量12169，共182只，随机分为假手术组(n=14只)、对照组(n=84只)、干预组(n=84只)，干预组和对照组根据侧脑室注射Bax-抑制肽和生理盐水的时间点不同分为0h、6h、i2h、24h、48h、72h六个亚组。模型制作过程、侧脑室穿刺过程及后期喂养过程中共死亡12只，按随机原则以经过相同处理的动物补充。2新生大鼠HIBD模型制作HIBD模型制作：参照Rice法n81制作HIBD模型，选择新生7目龄Wistar大鼠根据体质量腹腔注射10水合氯醛3mlkg进行麻醉，仰卧位，头部和四肢固定在手术板上，局部消毒颈部皮肤。于颈部作一O6 cm正中切口，暴露与气管平行的胸骨舌骨肌、肩胛舌骨肌和胸锁乳突肌；将胸骨舌骨肌和肩胛舌骨肌分离，沿胸骨舌骨肌做分离，暴露并游离出左侧颈总动脉(图1)，并予双线结扎，用4-0号线缝合切口(手术时间在lO分钟之内)。术后将新生鼠放回母鼠笼内恢复2小时；将苏醒大的鼠放入透明密闭容器缺氧处理，向容器内输入经湿化处理的8氮氧混合气体(速度为2Lmin)，密闭容器置于37。C恒温水浴箱中；缺氧2小时后，取出大鼠放回母鼠身边喂养，避免强光和噪音刺激。建立HIBD模型成功的指标：新生鼠术后出现感觉及运动功能障碍、体重增长迟缓、与正常的脑组织相比较，病变侧脑组织在形态上及组织病理上存在明显差异。新生鼠于缺氧20分钟左右时出现烦躁、紫绀、呼吸急促；30分钟左右时出现站立不稳、抽搐；l小时左右开始出现嗜睡、昏迷等状态。缺血缺氧性脑损伤可以导致4材料与方法大脑皮层下运动中枢损害，本实验约有64的新生鼠在模型建立后可出现自发或夹尾左旋，符合HIBD模型制备成功的行为学特征，进一步证实本实验模型建立成功。