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Bax抑制肽对HIBD新生大鼠海马区细胞色素C及Caspase3蛋白的影响Bax抑制肽对HIBD新生大鼠海马区细胞色素C及Caspase3蛋白的影响 -- 260 元

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Bax抑制肽对BD新生大鼠海马区细胞色素C及Oaspase一3蛋白的影响于葡妻目的观察Bax抑制肽Baxinhibitingpeptide,BIP对缺氧缺血性脑损伤hypoxiaischemicbraindamage,HIBD新生大鼠海马神经细胞的细胞色素CcytocllromeC,CytC及促凋亡蛋白半胱氨酸蛋白酶caspase一3的影响,以探讨Bax抑制肽对HIBD后的神经保护作用,为临床治疗新生儿缺氧缺血性脑损伤提供理论依据。方法182只7日龄Wistar大鼠,随机分为假手术组n14只、对照组n84只、干预组n84只。对照组与干预组通过结扎新生大鼠左侧颈总动脉和8%低氧处理2h制备新生大鼠HIBD模型,假手术组仅游离左侧颈总动脉,不予结扎及低氧处理。干预组于HI即刻、6h、12h、24h、48h、72h左侧侧脑室内注射5ugBIP即5u1,对照组于相同时间点予等量生理盐水5u1左侧侧脑室内注射,按注射时间点不同分别分为6个不同亚组。所有实验动物均于术后7d处死。应用HE染色、末端脱氧核甘酸转移酶TdT介导的生物素化dUTP原位缺口末端标记法TUNEL及蛋白免疫印迹法WesternBlot观察各组病理变化、细胞凋亡及CytC、Caspase一3蛋白释放情况。结果1海马区TUNEL阳性细胞数目变化对照组及干预组HIBD后左侧大脑海马区TUNEL阳性细胞表达较假手术组显著增加,差异有极显著性意义尸0.01。干预组与对照组在0h、6h、12h、24h、48h亚组比较,凋亡细胞数目明显减少P0.01,干预组0h亚组凋亡细胞数较干预组6h、12h、24h、48h亚组减少PO.052活性caspase一3及CytC的含量变化对照组及干预组caspase一3活性片段、CytC释放量较假手术组显著增加,差异有极显著性意义p0.01。干预组与对照组在Oh、6h、12h、24h、48h亚组比较,caspase3活性片段、CytC释放量显著减少PO.01,干预组0h亚组caspase一3活性片段、CytC释放量较干预组6h、12h、24h、48h亚组减少PO.05。结论Bax一抑制肽治疗能显著降低HIBD新生大鼠海马神经细胞凋亡发生率,HI后48小时内为BIP最佳治疗时间窗,治疗时间越早作用越显著,以HIBD即刻注射效果最佳。其机制可能与保护线粒体膜,减少CytC释放,减轻或抑制caspase一3蛋白酶活性有关。硕士研究生于茂敏儿科学指导教师姜红教授关键词capase一3细胞色素CBax抑制肽缺氧缺血,脑凋亡新生,大鼠EffectofBaxinhibitingpeptideoncytochromeCandCaspase3expressioninNeonatalRatswithhypoxicischemicAbstractbraindamageIIMIIIkklIIllllIIIIllIIIIImIIIIIIIJY2338742objectivesToobservetheeffectsofcytochromeCandCaspase.3expressionbyBaxinhibitingpeptideBIPindifferentintervalintracerebroventricularinjectioninneonatalratswithhypoxicischemicbraindamageHIBD,andtoexploretheneuroprotectiveeffectBaxinhibitingpeptideafterhypoxicischemicbraindamage,providingatheoreticalbasisfortheclinicaltreatmentofneonatalhypoxic.ischemicbraindamage.Methods182sevendayoldWistarratswererandomlydividedintosham。operatedgroupn214,controlgroupn284,treatmentgroupn84,Therightcarotidarteriesofratsinshamoperatedgroupwereonlyisolated,withoutligation,ischemia,hypoxiaandmedication,whilecontrolgroupandtreatmentgroupweremadebyshearingfightcarotidarteriescommunisandbreathing8%oxygenfortwohours.ThenewbornratsoftreatmentgroupandcontrolgroupwasseparatelyinjectedBaxinhibitorypeptide5u1andnormalsaline5u1throughtheleftlaeralventricularrespectivelyinimmediately、6h,12h、24h、48hand72hafterHIBDmodelestablishment,dividedinto6subgroupsbyinjectiontimepoint.Allnewbornratsincludedinthisstudywereputtodeathat7daysafterHIBDmodelestablishment.CerebralpathomorphologicalchangeswasobservedbyHEstainingandTUNELmethod.ThecytochromeCandCaspase.3expressioninneonatalratsbrainⅥ,asexaminedbyWesternblotdetection.Results1ChangesinthenumberofTUNEL.positivecellsinthehippocampusComparedwithshamoperatedgroup,TUNELpositivecellsinthelefthippocampusweresignificantlyincreasedincontrolgroupandtreatmentgroupafterHIBD.ThedifferencewasverysignificantPO.01.ThenumberofTUNELpositivecellsintreatmentgroupwaslowerthanthatincontrolgroupsignificantlyat0h,6h,12h,24h,48hafterHIBD.P0.01.ThenumberofTUNELpositivecellsinOhgroupwaslowerthanthatin6h,12h,24h,48groupP0.01.2Expressionofactivecaspase3andCytCComparedwithshamoperatedgroup,Theamountofactivecaspase.3andCytCweresignificantlyincreasedincontrolgroupandtreatmentgroupafterHIBD.ThedifferencewasverysignificantPO.01.Theamountofactivecaspase.3expressionandCytCintreatmentgroupwaslowerthanthatincontrolgroupsignificantlyat0h,6h,12h,24h,48hafterHIBD.P0.01.Theamountofactivecaspase一3expressionandCytCinOhgroupwaslowerthanthatin6h,12h,24h,48hgroupfP0.01.ConclusionsBaxinhibitingpeptidetreatmentattenuatesneuronalapoptosisfollowingHIBD.TheeffectivetreatmenttimewindowofBaxinhibitorpeptideinhypoxiaischemiatimeiswithin48hafterHIBD.Itsmechanismmayberelatedtoprotectthemitochondrialmembrane,throughareductioninCytCreleasefrommitochondriaandaninhibitionofcaspase.3enzymeactivity.PostgraduatestudentYuMaominPediatricsDirectiedbyProf.JiangHongKeywordsCapase3CytochromeCBaxinhibitingpeptideHypoxia.ischemic.brainCellapoptosisNeonatalrats目录引言一l第1章材料与方法31.1材料31.1.1实验动物31.i.2实验药品和试剂31.1.3主要实验仪器及设备41.2方法41.2.1实验动物的分组与处理41.2.2标本采集5I.2.3制备脑组织切片51.2.4HE切片制作61.2.5TUNEL法检测神经细胞凋亡6I.2.6Westernblot检测caspase一3和细胞色素C的释放量7第2章数据采集及处理...82.1数据采集82.2统计学处理8第3章结果93.I新生大鼠HIBD模型建立后的神经行为评价一93.2新生大鼠脑组织海马区HE染色形态学改变93.3TUNEL技术检测新生大鼠海马区凋亡细胞计数93.4Westernblot检测细胞色素C的释放量103.5Westernblot检测活性caspase~3的释放量11第4章讨论13第5章结论19刚图表20参考文献24综杰盎29攻读学位期间的研究成果37ii}l谢38学位论文独创性声明、学位论文知识产权权属声明39引言Bax抑制肽对BD新生大鼠海马区细胞色素C及Caspase一3蛋白的影响引言缺氧缺血性脑损伤hypoxicIschemicbraindamage,HIBD是由于胎儿宫内窘迫、新生儿窒息等引起的新生儿脑部严重损伤,目前仍是新生儿期最多见及最严重的疾病之一,发病率及死亡率居高不下,也是导致智能落后和脑性瘫痪等儿童伤残的主要原因,受到国内外学者的广泛关注Ⅲ。HBID的发生受多种因素影响,目前尚缺乏特异的治疗方法晗1,如何及时采取有效的干预措施,改善预后,提高患儿的生存质量是临床工作者亟待解决的问题。HIBD发病机制复杂,涉及能量代谢障碍、氧自由基损伤、钙超载、N0的神经毒性作用、兴奋性氨基酸的毒性作用等因素,最终引起神经元多发性损伤而导致细胞死亡。细胞死亡存在坏死及凋亡两种形式。其中细胞凋亡是后期神经细胞缺失和功能障碍的主要原因。Hill口1等用新生7日龄大鼠制成HIBD模型证实了缺氧缺血性脑损伤后神经细胞凋亡的存在,缺氧缺血后导致的神经细胞死亡其机制比较复杂并涉及多条信号传导途径,其中线粒体在不同死亡信号传导途径中起关键调节作用,成为调控细胞凋亡的靶点。已知至少有两条通路可导致线粒体通透性增加H剖。一种是存在于线粒体内膜的渗透性转换孔PT的开放另一种是依赖于Bax/Bak的线粒体外膜的直接开放。在成熟脑中缺血可以引起线粒体PT孔道开放导致细胞坏死。抑制PT孔道对成年脑损伤有保护作用。但是在未成熟脑中,线粒体PT孔道抑制剂对缺氧缺血性脑损伤无任何保护作用。而Bax在未成熟脑中呈高表达盯1,并且在线粒体通透性调节中起关键作用。Bax途径导致的线粒体膜通透性的改变可能是引起幼年脑损伤的重要环节。Bax是Bcl一2家族中一种促进细胞凋亡的蛋白,在未成熟脑中呈高表达,通常在胞质中以单体的形式存在,细胞接受到死亡信号的刺激时,胞浆中的促凋亡蛋白Bax发生构象改变睛3。激活Bax蛋白并使其移位至线粒体内形成同源二聚体蛋白通道,线粒体膜上的细胞色素C通过插入到线粒体外膜上的Bax通道释放到胞浆,在ATP/dATP的参与下,在胞质中与Apaf一1结合形成寡聚体,Apafl通过其氨基端和Caspase一9前体的功能前区相互作用,导致Caspase一3激活成为具有活性的酶,从而降解下游底物,导致细胞凋亡∞。¨。近年来对细胞凋亡的研究认为细胞色素C和半胱氨酸蛋白酶caspase一3是凋亡发生和调控机制中最重要的组成部分。缺氧缺血等因素可使线粒体膜通透性增加,线粒体受破坏,释放细胞色素C和其他死亡因子如青岛大学硕士学位论文凋亡诱导因子AIF到胞浆中,胞浆内细胞色素C与凋亡蛋白活性因子工apoptoticproteaseactivatingfactor一1,Apaf一1结合使之活化,后Apaf一1者可导致caspase9的自身剪切与活化,活化的caspase9可激活caspase3,进而导致细胞凋亡u2。1。Bax抑制肽BIPs是一种从Ku70一种核蛋白提取的细胞通透性多肽,能够通过血脑屏障,通过Bax蛋白结合域与促凋亡蛋白Bax相互作用,阻止其构象发生改变和线粒体移动,从而保护细胞免受Bax介导的凋亡的影响,可以有效地阻断Caspase依赖的细胞凋亡n引。目前已有研究发现Bax抑制性肽可以降低未成熟脑缺氧缺血后线粒体膜腔隙中的促凋亡蛋白的释放以及Caspase级联反应的激活减轻脑损伤u71。国外已有相关体外实验研究发现,Bax一抑制肽具有良好的细胞膜穿透能力,其氨基酸序列与bax的结合结构域相对应,可与胞浆中的内Bax蛋白相结合,抑制Bax结构的改变及向线粒体的移位,进而抑制线粒体膜上bax通道开放,阻止线粒体膜通透性下降,抑制细胞色素C从线粒体中释放,阻断capase蛋白酶系列级联反应,从而保护神经细胞对抗细胞凋亡H引。目前尚缺乏Bax抑制肽在体内阻止线粒体膜通透性下降,抑制细胞色素C从线粒体中释放,与Caspase一3等蛋白酶结合发生级联反应的相关报道,因此本研究在选用新生7日龄Wistar大鼠制备围产期缺氧缺血脑损伤HIBD模型的基础上,通过抑制线粒体膜通透性转变MPT激活的第二条途Bax途径,在新生大鼠HIBD后不同时间点予侧脑室注射Bax一抑制肽,利用HE、TUNEL、免疫组织化学染色、WesternBlot技术定量分析Bax抑制肽对细胞色素C和促凋亡蛋白半胱氨酸蛋白酶caspase一3在新生大鼠HIBD后大脑皮质海马区的改变,以评价Bax抑制肽的线粒体保护作用,防治新生大鼠缺氧缺血性脑损伤神经细胞凋亡的疗效,为临床应用神经类营养药物提供实验及理论依据。2材料与方法第一章材料与方法1.1材料1.1.1实验动物新生7日龄Wistar大鼠SCXK鲁20090007,雌雄不限,体质量12169,共182只,由青岛市实验动物和动物实验中心提供。1。1.2实验药品和试剂1细胞色素C抗体产品编号BS0013R英文名称AntiCytochromeC生产商名北京博奥森生物技术有限公司2活化半胱胺酸蛋白酶蛋白一3抗体产品编号BS0081R英文名称AntiCaspase一3Active生产商名北京博奥森生物技术有限公司4Bax一抑制肽英文名称BaxInhibitingPeptide,V5产品批号196810生产商名德国默克医药公司产品规格5mg/mL5高灵敏度化学发光检测试剂盒产品货号CW0049生产商名北京康为世纪生物科技有限公司6细胞凋亡试剂盒英文名称RocheTunel试剂盒产品货号11684817生产商名上海罗氏公司7自各试剂及用品手术器械载玻片及盖玻片防脱片用多聚赖氨酸0.2mol/L磷酸氢二钠储存液500ml蒸馏水加Na2HP0412H2035.8190.2mol/L磷酸二氢钠储存液500ml蒸馏水加NaH2P042H2015.6090.2mol/L磷酸缓冲液pH7.61青岛大学硕士学位论文4%中性缓冲多聚甲醛固定液40%甲醛与0.01MPBS之比为l9配制10%水合氯醛溶液8%氮氧混合气体青岛华瑞气体科技有限公司1.1.3主要实验仪器及设备1显微镜及显微成像系统2微量注射器10u13脑/组织切片机4蛋白电泳系统5蛋白转膜系统6化学发光成像系统7常压缺氧舱装置1.2方法OLYMPUSBX41上海医用仪器厂Leika2235BioRadMiniPROTEANTetraII北京六一DYY一7C型FusionX7型自制见照片31.2.1实验动物的分组与处理1动物分组新生7日龄Wistar大鼠,雌雄不限,体质量12169,共182只,随机分为假手术组n14只、对照组n84只、干预组n84只,干预组和对照组根据侧脑室注射Bax抑制肽和生理盐水的时间点不同分为0h、6h、i2h、24h、48h、72h六个亚组。模型制作过程、侧脑室穿刺过程及后期喂养过程中共死亡12只,按随机原则以经过相同处理的动物补充。2新生大鼠HIBD模型制作①HIBD模型制作参照Rice法n81制作HIBD模型,选择新生7目龄Wistar大鼠根据体质量腹腔注射10%水合氯醛3ml/kg进行麻醉,仰卧位,头部和四肢固定在手术板上,局部消毒颈部皮肤。于颈部作一O.6cm正中切口,暴露与气管平行的胸骨舌骨肌、肩胛舌骨肌和胸锁乳突肌将胸骨舌骨肌和肩胛舌骨肌分离,沿胸骨舌骨肌做分离,暴露并游离出左侧颈总动脉图1,并予双线结扎,用40号线缝合切口手术时间在lO分钟之内。术后将新生鼠放回母鼠笼内恢复2小时将苏醒大的鼠放入透明密闭容器缺氧处理,向容器内输入经湿化处理的8%氮氧混合气体速度为2L/min,密闭容器置于37。C恒温水浴箱中缺氧2小时后,取出大鼠放回母鼠身边喂养,避免强光和噪音刺激。②建立HIBD模型成功的指标新生鼠术后出现感觉及运动功能障碍、体重增长迟缓、与正常的脑组织相比较,病变侧脑组织在形态上及组织病理上存在明显差异。新生鼠于缺氧20分钟左右时出现烦躁、紫绀、呼吸急促30分钟左右时出现站立不稳、抽搐l小时左右开始出现嗜睡、昏迷等状态。缺血缺氧性脑损伤可以导致4材料与方法大脑皮层下运动中枢损害,本实验约有64%的新生鼠在模型建立后可出现自发或夹尾左旋,符合HIBD模型制备成功的行为学特征,进一步证实本实验模型建立成功。③侧脑室注射注射参照YuCheng法n93在预实验中予美兰示踪,反复解剖观察后确定方法可行,将经缺氧缺血处理后新生大鼠以俯卧位固定于手术板上,剪开头部皮肤,将人字缝尖暴露,以圆规直尺定位于人字缝尖向嘴侧2.Omm,左侧1.5mm,以lOul微量进样器自颅骨表面垂直进针2.Omm于各时间点分别注入BAX抑制肽5ul,对照组注射等量生理盐水,时间约为1分钟,注射完毕后留针30秒缓缓退出,缝合头皮后,用青霉素棉球消毒皮肤。将动物放回母鼠身边继续母乳喂养。3实验动物的干预处理①各组动物处理假手术组随机选取14只新生鼠仅分离左侧颈总动脉,不予结扎及缺氧处理。干预组随机选取84只新生鼠分别于缺氧缺血HI即刻、6h、12h、24h、72h左侧脑室注射Bax抑制肽5ug即5u1,分为各时间点干预组亚组每亚组8只新生鼠对照组同时点左侧脑室注射等量生理盐水,分为各时间点对照组亚组。对照组与实验组相同时间点左侧脑室注射等量生理盐水,分为各时间点对照组亚组。②将以上各组均于模型建立后第7天予断头取脑组织。1.2.2标本采集假手术组及对照组、干预组大鼠于HIBD术后7d随机取8只2只用于组织切片,予10%水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉后,固定在手术板上。剪断胸骨,将心脏暴露。用5ml注射器刺入左心室,穿刺针进入主动脉后,用丝线结扎固定。缓慢推注4%多聚甲醛,同时剪开右心房,可见血液自右心房内流出,直至心房内流出清亮液体及眼球、口腔黏膜、四肢末端苍白、全身僵硬后停止灌注。断头后逐层剥离皮肤组织并暴露颅骨,沿颅骨缝除去骨片,暴露完整脑组织。脑组织外观成形完整,脑皮质无血色提示灌注良好。剥离完整脑组织,置于4%多聚甲醛溶液中固定。1.2.3制备脑组织切片1新鲜标本于10%福尔马林液固定24小时后,取约12cm2大小,厚0.2一O.3crll的组织块,流水冲洗12小时。2组织脱水与包埋将固定好的组织块经70%、80%、90%、95%、100%I、100%II梯度酒精脱水,二甲苯透明,浸蜡,65C熔点石蜡包埋并冷却。3切片和贴片将包埋好的蜡块夹在切片机中,厚度调至4微米,摇动手柄切下含组织的蜡片,气
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