Bax抑制肽对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤神经细胞保护作用

Bax一抑制肽对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤神经细胞保护作用摘 要目的通过检测应用gax一抑制肽对新生鼠缺血缺氧性脑损伤后神经细胞凋亡的疗效，探讨Bax一抑制肽对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的神经保护作用。方法选取200只7日龄新生wjster大鼠为研究对象，随机分为以下三组：假手术组；对照组；实验组(bax一抑制肽)。对照组与实验组分别通过结扎左侧颈总动脉以及置于8的氮氧混合气中2小时建立新生鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)模型，假手术组仅游离左侧颈总动脉，不结扎，不低氧处理。实验组于建立模型后0h、6h、12h、24h、48h、3d不同时问点侧脑室注射bax-抑制肽5ug(5u1)，其余两组予相同剂量生理盐水于相同时间点侧脑室注射。对照组和假手术组于HIBD模型建立后第12h、24h、2d、3d、7d及实验组HIBD后第7d每组取2只甲醛灌注后断头取脑海马组织病理检测，另取6只新鲜脑组织进行蛋白免疫印迹法(Weston blot)检测活性Caspase一3蛋白、逆转录PCR(RTPCR)测定Caspase-3mRNA的表达。结果l、HE染色组织显示：在患侧海马区，实验组及对照组oh、6h、12h、24h、48h各亚组均有病理性损伤，实验组病理损伤程度低于对照组，在72h亚组实验组与对照组病理损伤无明显差异。2、Western blot检测Caspase一3蛋白及RTPCR检测Caspase一3mRNA：对照组与假手术组比较，对照组在HIBD后oh、6h、12h、24h海马区Caspase一3及mRNA依次增多，24h达高峰，48h开始下降，7d时达到基础水平。3、HIBD后7d Western blot检测Caspase-3：实验组与对照组在0h、6h、12h、24h、48h各亚组比较，海马区Caspase一3明显减少，差异有统计学意义；在72h亚组比较差异无统计学意义。实验组各亚组间比较，HIBD后越早注射bax一抑制肽，Caspase一3越少，差异有统计学意义。4、HIBD后7d RTPeR检测Caspase一3mRNA：实验组和对照组在0h、6h、12h、24h、48h各亚组比较，患侧海马区活性Caspase一3明显减少，差异有统计学意义；在72h亚组比较差异无统计学意义。实验组各亚组间比较，HIBD后越早注射bax一抑制肽，Caspase一3mRNA量越少，差异有统计学意义。结论：1、新生大鼠缺氧缺血脑组织Caspase一3及mRNA表达增多，神经细胞凋亡增加，24小时达高峰，48小时后逐渐下降。2、HIBD后2天内侧脑室注射bax一抑制肽可减少Caspase一3及mRNA的表达，减轻神经细胞凋亡。3、在HIBD后越早给予bax-抑制剂治疗，神经保护作用越明显，缺氧缺血后2天内为有效治疗时间窗。硕士研究生张辉 (儿科学专业)指导教师 姜红 教授关键词：bax-抑制肽；缺氧缺血；脑；新生儿； Caspase一3NeuroprotectiVe Effect of BaxInhibiting Peptide on NewbronRats with Neonatal Hypoxic Ischemic DamageAbstractobjective：To investigate the effects of Baxinhibitory peptide on improving neuronalapoptosis in newborn rats with hypoxiaischemic brain damage(HIBD)Method：Two hundred 7-dayold newborn wister rats were randomly divided into threegroups：Sham operation group，control group，experiment groupHIE model wasestablished by ligation of the left carotid artery along with 2h 8oxygen exposure inneonatal rats of the control and experiment groupsThe sham operation group was notsubjected to hypoxiaischemia111e experiment group received an intracerebroventricularinjection ofbaxinhibitory peptide with dose of 5ug(5u1)respectively in oh，6h，12h，24h，48h and 3d after HIBD，while the other two groups received normal saline at thesame timeEach group of mice were sacrificed，on the 1 2h，24h，48h，3d and 7d afterHIBD，take two mice in each subgroup after perfusion with formaldehyde and brainswere removed for hippocampal pathology detection by HE staining，while take six micein each sub-group the brains were removed for caspase-3 detection by Western blot andmRNA detection by reverse transcription PCRResult：1By HE staining，the experimental and control group were pathological lesion，the degree of damage of the experiment group decreased compared with the controlgroup in Oh、6h、12h、24h and 48h sub-groups，and there was no various difference inpathological damage between the experiment group and the control group2Theexpression of caspase-3 protein by Westem blot and Caspase-3mRNA by reversetranscription PCR detection after HIBD：the control group compared witll the shamgroupcaspase-3 and mRNA expression gradually increased in oh，6h，12h，24h afterHIBD，reached a peak of 24 hours，48 hours decreased，basic level reached in 7d3Theexpression of caspase一3 protein by Western blot detection 7d after HIBD：there wassignificant difference between the experimental group and control group the at each timepoint(0h，6h，1 2h，24h，48 h after HtBD)；The differences between the various subgroupsof the experimental group was statistically significant(0h，6h，1 2h，24 h，48h，72h afterHIBD)4The expression of caspase一3 mRNA by reverse transcription PCR detection 7dafter HIBD：There was significant difference between the experimental group andcontrol group the at each time point(0h，6h，1 2h，24h，48h after HIBD)；The differencesbetween the various subgroups of the experimental group was statisticallysignificant(0h，6h，1 2h，24h，48h，72h after HIBD)Conclusion：1Active caspase一3 and mRNA expression increased after HIBDreached apeak of 24 hours，48 hours decreased2The intracerebroventricular injectionbaxinhibitory peptide reduces the expression of active caspase一3 and mRNA，alleviated neuronal apoptosis3Baxinhibitor therapy sooner they are given，the better,and two days after HIBD as a valid therapeutic windowPostgraduate student：ZHANG Hui(Pediatrics)Directied by ProL JIANG HongKey words：Bax inhibitor peptide；Hypoxia-ischemie；Brain；Newbron；Caspase一3；目录引言1第i章材料与方法311 材料3i11 实验动物3112 实验药品和试剂31i3 主要实验仪器及设备3i2 方法4121 实验动物的分组与处理4122 标本采集5123 制备脑组织切片及HE染色一5124 Western blot检测Caspase一3蛋白6125 RTPCR检测Caspase一3mRNA一7第2章数据采集及处理921 数据采集922 统计学处理9第3章 结果l 031 HIBD模型的建立1032 新生大鼠脑组织病理1033 Western blot检测Caspase一3表达1034 RTPCR检测Caspase一3mRNA表达ll第4章讨论l 3第5章结论I 8附图表1 9参考文献22综述26攻读学位期间的研究成果35致谢36学位论文独创性声明、学位论文知识产权权属声青岛大学硕士学位论文引言新生儿缺氧缺血性脑损伤(Hypoxicischemic brain damage，HIBD)是由于围产期缺氧窒息等因素，导致新生儿脑组织的缺氧缺血性损害，包括一系列神经性的病理生理改变以及临床上出现一系列脑病的表现。脑缺氧后发生一系列病理生理过程“瀑布式”发生，多种发病机制交互作用，逐渐导致不可逆性脑损伤。线粒体功能障碍在缺氧缺血性脑损伤发生过程中起关键性的作用，线粒体是氧化磷酸化生成能量的重要部位，对缺氧非常敏感。缺氧缺血可能通过各种途径影响线粒体膜通透性转运孔的功能，引起线粒体通透性转变，导致细胞坏死和(或)凋亡。IIIBD过程中神经细胞损伤主要表现为坏死和凋亡，而凋亡引起的损伤更严重、更持久，且在HIBD的发病机制中占主导地位n。脑缺氧缺血引发了一些有害的活动：兴奋性氨基酸释放，细胞内钙增加，一氧化氮等活性氧的积累，失去营养因子的支持，并诱导的cJun蛋白激酶口1。在一定的阈值水平，这些上游的“压力”打乱了Bcl一2家族促凋亡与抗凋亡因子的的平衡，导致线粒体外膜的通透性增加H3。线粒体通透性增加，细胞色素C(细胞色素C)和凋亡诱导因子(apoptosisinducingfactor，AIF)被释放，从而激活半胱天冬酶(caspase)依赖性和半胱天冬酶非依赖性的细胞凋亡阻3。凋亡发生是一个由caspase家族成员介导的蛋白酶级联“瀑布反应”过程，一旦效应caspase被激活，便大范围的水解细胞内的靶物质，从而降解细胞内蛋白，最终使细胞不可逆的走向死亡。在多种因子的刺激下，线粒体释放细胞色素C，Apaf-I与细胞色素C构成复合体，激活caspase-9，引起级联“瀑布式”反应，进一步激活下游的caspase-3，6，7等，最终导致细胞凋亡拍1研究事实证明，通过结合抑制AIF和半胱天冬酶，能够明显减轻脑损伤，从而推断，如果能在脑缺氧缺血后改善线粒体通透性，可能会提供一条保护未成熟脑新途径哺1。目前的研究认为至少有两条通路可导致线粒体通透性增加：一种是存在于线粒体内膜的渗透性转换孔的开放(PIP)，依赖亲环素D调节，可被亲环素D1约配体环孢素A所阻遏。第二条是Bax通道，它位于线粒体外膜上，线粒体外膜通道通透性的选择性增加具有更重要意义。根据Wang X。“的实验推断抑制线粒体PTP通道在未成熟脑中不能起到脑保护的作用。Bax在未成熟脑中呈高表达隋1，在线粒体通透性调节中起关键作用，而随着大脑发育在成熟脑中Bax表达水平降低。未成熟脑缺氧缺血后Bax从细胞质转位到线粒体，使线粒体膜腔隙中的促凋亡蛋白释放，而Bax基因敲除小鼠对缺氧缺血后脑损伤有保护作用一1。因此，我们的假设是药物抑制Bax转位或者激活可能是保护未成熟脑的一条有效策略。Caspase家族是细胞凋亡过程中一类关键的同源半胱氨酸蛋白酶，能特异性的在天冬氨酸残基后裂解靶蛋白，其中caspase一3属于效应亚类的caspase。正常生引言理情况下，caspase家族在细胞中以无活性的酶原形式存在。当细胞发生缺氧缺血性损伤时，多种因子均可激活caspase家族，之后发生与细胞凋亡有关的瀑布式级联反应，最终都通过caspase一3的活化执行凋亡过程，caspase一3被认为是细胞凋亡的最终执行者“01，其变化在神经细胞凋亡过程中发挥重要作用“。发生细胞凋亡时，激活32KD的caspase一3裂解为12KD和17KD的活性片段，再特异性切割其相对应的底物，最终导致细胞凋亡n”。在新生鼠HIBD模型的试验中，侧脑室给予caspase抑制剂可减轻细胞凋亡“1所以caspase一3可作为细胞凋亡的重要检测指标。本研究以新生大鼠缺氧缺血性脑损伤为模型，通过抑制线粒体膜通透性转变(MPT)激活的第二条途一Bax途径在新生大鼠于侧脑室给予Bax一抑制肽后不同时间点对脑组织病理、神经细胞凋亡及Caspase一3蛋白和mRNA进行检测，及脑损伤后神经功能、行为学检测评价脑损伤。通过进一步进行统计学分析，以评价Bax抑制肽线粒体保护作用防治新生大鼠缺氧缺血性脑损伤神经细胞凋亡的疗效，有望为新生儿缺氧缺血性脑病的临床治疗提供一种新的药物途径。2材料与方法第一章材料与方法11材料111实验动物新生7日龄Wister大鼠SCXK(鲁)20090007，雌雄不限，体质量12-169，共200只，由青岛市实验动物和动物实验中心提供。112实验药品和试剂1 活化半胱胺酸蛋白酶蛋白一3抗体产品编号：BS一0081R英文名称：AntiCaspase-3(Active)生产商名：北京博奥森生物技术有限公司2Bax-抑制肽英文名称：BaxInhibiting Peptide，V5产品批号：196810生产商名：德国默克医药公司产品规格：5 mgmL3高灵敏度化学发光检测试剂盒产品货号：CW0049生产商名：北京康为世纪生物科技有限公司4RTPCR试剂盒(RNA提取、逆转录、扩增)产品名称：TRIzol试剂，逆转录试剂盒，TaqDNA聚合酶，dNTP生产商名：美国MBI公司5自备试剂及用品手术器械载玻片及盖玻片防脱片用多聚赖氨酸02molL磷酸氢二钠储存液：500ml蒸馏水加Na。HPO。12H。0 35819O2molL磷酸二氢钠储存液：500ml蒸馏水加NaH。P0。2H：0 1560902molL磷酸缓冲液(pH 76)4中性缓冲多聚甲醛固定液：40甲醛与001M PBS之比为l：9配制1 0水合氯醛溶液8氮氧混合气体：青岛华瑞气体科技有限公司113主要实验仪器及设备1 显微镜及显微成像系统 OLYMPUS BX412 微量注射器(10u1) 上海医用仪器厂3青岛大学硕士学位论文3脑组织切片机Leika22354蛋白电泳系统 BioRad MiniPR。TE州rretra II5 蛋白转膜系统 北京六一DYY一7C型6 化学发光成像系统 Fusion X7型7 常压缺氧舱装置 自制(图1)8PCR热循环仪：美国PE公司，GeneAmpPCRsystem2400型。9 紫外分光光度计：美国Beckman公司。10凝胶成像系统(Image Master VDS)：美国PharmaciaBiotech公司。12方法121实验动物的分组与处理1 动物分组新生7日龄Wister大鼠，雌雄不限，体质量12169(图2)，随机分为三组，分别为假手术组；对照组(生理盐水组)；实验组(bax一抑制肽组)。假手术组和对照组根据解剖时间分为12h、24h、48h、48h、3d、7d五个亚组。实验治疗组根据bax一注射时间的不同分为HIBD后即可、6h、12h、24h、48h、3d六个亚组。模型制作过程、侧脑室穿刺过程及后期喂养过程中共死亡15只，按随机原则以经过相同处理的动物补充。2新生大鼠HIBD模型制作参照Rice法【”】制作HIBD模型：选择新生7日龄Wi ster大鼠按体质量给予10水合氯醛3mlkg腹腔注射麻醉后，仰卧位，四肢和头部固定于手术板上；用安尔碘局部消毒颈部皮肤。于颈部正中作一长约06 cm切口，暴露于气管平行的胸骨舌骨肌及肩胛舌骨肌和胸锁乳突肌：将胸骨舌骨肌和肩胛舌骨肌分离，沿胸骨舌骨肌做分离，暴露并游离左侧颈总动脉(图3)。双线结扎左侧颈总动脉，一次性4-0号缝合线缝合切口(手术时间小于10分钟)。术后放回母鼠身边恢复2小时；待术后苏醒将新生鼠放入3000ml透明密闭容器，以2Lmin的速度向透明密闭容器内输入经由湿化处理8氮氧混合气体，密闭容器置于37。C恒温水浴箱中；缺氧2小时后，取出大鼠放回母鼠身边喂养，避免强光和噪音刺激。建立新生鼠缺血缺氧性脑损伤模型成功的指标有：新生鼠术后感觉神经功能障碍、体重增长缓慢、病变侧脑组织与正常脑组织比较，在形态上以及组织病理上有明显差异。新生鼠在缺氧20分钟左右出现烦躁、紫绀、呼吸急促；30分钟左右出现站立不稳、抽搐；l小时左右出现嗜睡、昏迷等状态。缺血缺氧性脑损伤可以导致大脑皮层下运动中枢损害，本实验约有65的新生鼠于模型建立后出现自发左旋4材料与方法或夹尾左旋，是缺血缺氧性脑损伤模型制备成功的行为学特征，进一步证实实验模型建立成功。3 实验动物的干预处理各组动物处理