Bax抑制肽对缺氧缺血脑损伤新生鼠抑制神经细胞凋亡的作用

Bax抑制肽对缺氧缺血脑损伤新生鼠抑制神经细胞凋亡的作用摘要目的；通过检测脑组织内凋亡阳性神经细胞数目及caspase-3蛋白量，探讨Bax抑制肽对缺氧缺血脑损伤新生鼠抑制神经细胞凋亡的作用及有效治疗时问窗。方法：选取7日龄Wister新生大鼠182只做为研究对象，随机分为假手术组(n=14)、对照组(n-84)和实验组(n：84)。对照组与实验组通过结扎左侧颈总动脉以及置于8的氮氧混合气中2小时建立缺氧缺血性脑损伤(hypoxiaischemicbrain damage，HIBD)模型，假手术组仅游离左侧颈总动脉，不结扎不低氧处理。实验组和对照组分别经左侧侧脑室注射5ug Bax一抑制肽(5u1)和生理盐水(5u1)。根据HIBD模型建立后注射Bax抑制肽和生理盐水的时间不同，将实验组和对照组分为Oh、6h、12h、24h、48h、72h六个亚组(n=14)。假手术组不注射任何药物。所有实验动物均于HIBD模型建立后7天处死，进行脑组织病理检测、TUNEL法检测凋亡阳性神经细胞数目、蛋白免疫印迹法检测Caspase-3蛋白含量。结果：左侧海马区脑组织HE染色：与假手术组比较，实验组和对照组脑组织病理损伤明显。实验组与对照组在0h、6h、12h、24h、48h亚组比较，病理损伤程度较轻，在72h亚组比较无明显差异。TUNEL染色左侧海马区脑组织凋亡阳性神经细胞数目：实验组与对照组在Oh、6h、12h、24h、48h各亚组比较，凋亡阳性神经细胞数目明显减少，差异有统计学意义：在72h亚组比较无统计学差异。实验组的各亚组之间依次比较，ttBD模型后越早注射Bax抑制肽，凋亡阳性神经细胞数日越少，且差异有统计学意义。蛋白免疫印迹法检测左侧海马区脑组织caspase3蛋白含量：实验组和对照组在0h、6h、12h、24h、48h各亚组比较，caspase一3含量明显减少，差异有统计学意义；在72h亚组比较无统计学差异。实验组各亚组之间依次比较，HIBD模型后越早注射Bax抑制肽，脑组织内caspase一3含量越少，差异有统计学意义。结论；新生鼠缺氧缺血脑损伤后海马区脑组织内凋亡阳性神经细胞数目和caspase-3蛋白含量均明显增加；Bax-抑制肽可明显减少缺氧缺血脑损伤新生鼠脑组织凋亡阳性神经细胞数目和降低caspase一3蛋白含量，可掷制缺氧缺血后脑组织神经细胞凋亡；缺氧缺血后48小时内是Bax抑制肽治疗缺氧缺血脑损伤的有效治疗时问窗，且越早应用治疗效果越好。硕士研究生崔凯洁 (儿科学专业)指导教师 姜红 教授I帆舯4棚哪眦帅11111lII哪Y2338664关键词：缺氧缺血，脑；Bax抑制肽；抑制凋亡；新生鼠The Effect of Bax inhibitor on antiapoptosis in neural cells of neonatalrats with hypoxiaischemia brain inj uryAbstractObjective：To explore the effect and effective treatment time window of Baxinhibitor onantiapoptosis in neural cells of neonatal rats with hypoxia-ischemia brain injury bydetecting the apoptosis cell number and the caspase一3 content of brain tissueMethod：1 82 7-day-old newborn SD rats were randomly divided into three groups：Shamoperation group(n214),control group(n=84)and experiment group(n284)HIBD modelswere established by ligation of the left carotid artery along with 8oxygen exposure for2-hour in neonatal rats of the controland experiment groupsThe sham operation groupwas not subjected to hypoxiaischemiaThe newbom rats of experiment and controlgroups were separately injected baxinhibitor(5 ug)and normal saline(5 u1)through theleft laeral ventricular,Both experiment and control groups were divided into sixsub-groups such嬲Oh，6 h，12 h，24 h，48 h and 72 h sub-groups(n=14)according to thetime when Baxinhibitor WaS given after the establishment of HIBD modelThe shamoperation group was given no drugsAll newborn rats in this study were executed at 7days after HIBD model establishment111e brain tissue was used to detect pathological byHE staining，apoptosis neural cell number by TUNEL method and caspase一3 by Westemblot detectionResult：1By HE staining，the degree of damage in the hippocampal region of theexperiment group decreased compared with the control group in Oh、6h、12h、24h and 48hsub-groups，apoptotic and necrotic cells Can be seen，and there was no obvious differencein pathological damage in 72h subgroup between the experiment group and the controlgroup2TUNEL staining positive cells number：The differerces of the positive cellnumber between the experimental group and control group had statistically significance at0 h，6 h，12 k 24 h，48 h after H1BDThe difference in 72h subgroup betweenexperimental group and control group had no statistically significanceThe differencesamong Oh，6 ll，1 2 h，24 h and 48 h in the experimental group were statisticallysignificantThere were no statistically significant differences among each subgroup in thecontrol group3Content of caspase protein by Western blot detection There WaSsignificant difference between the experimental group and control group the at each timepoint(Oh，6 11,1 2 k 24 h，48 h after HIBD)；The differences between the varioussubgroups of the experimental group WaS statistically significant(0h,6 h，1 2 h，24 h，48h，72h after HlBD)；there was no statistically significant difference compare between eachpoint time in the control groupConclusion：1The number of apoptosis cells and the content of caspase3 were increasedsignificantly after HIBD models2The intracerebroventricular injection baxinhibitorypeptide reduces the expression of active caspase-3 and alleviate neuronal apoptosis 3Theeffective treatment time window of Baxinhibitor in hypoxia ischemia time is within 48hafter HIBDThe sooner the Baxinhibitor is given，the better the Baxinhibitor cure thehypoxic ischemic brain injury of newborn mousePostgraduate student：CUI Kaijie(Pediatrics)Directied by ProfJIANG HongKey words：Hypoxia-ischemic，brain；Bax inhibitor peptide；Antiapoptosis；Neonatal rats目录弓I言1第1章材料与方法311 材料3111 实验动物3112 实验药品和试剂3l-13 主要实验仪器及设备：412 方法4121 实验动物的分组与处理4122 标本采集5123 制备脑组织切片：5124 11E染色6125 TUNEL染色6126 Western blot检测7第2章2122数据采集及处理一一m一一一8数据采集一8统计学处理8第3章结果mm一931 新生鼠缺血缺氧性脑损伤(H1BD)模型建立932 新生大鼠脑组织HE染色病理改变933 TUNEL染色检测凋亡阳性神经细胞数目934 Western blot检测Caspase-3蛋白量lO第4章 讨论一m1 2第5章结论一16附图表一m一1 7参考文献一m-20综杰楚”-。”23攻读学位期间的研究成果一m一23致谢一34学位论文独创性声明、学位论文知识产权权属声明引言引言新生几缺氧缺血性脑病(HypoxicIschemic EHcephalopathy，HIE)是新生儿时期的严重疾病之一，是新生儿死亡、继发脑瘫和智力障碍的重要原因。在我国，新生)LHIE的发生率约为活产儿的3一6，其中15一20在新生儿期死亡，存活者中25一30可能留有不同类型和程度的远期后遗症，重度HIE患儿预后不良率高达7316，成为危害我国儿童生活质量的重要疾病之一n1。目前临床上采用的治疗新生)LHIE的方法有多种。例如，从整体出发重视全局观念的“三对症三支持”治疗、高压氧治疗、亚低温治疗、各种神经营养因子等。但这些治疗方法疗效并不理想，由于新生)LHIE高的发病率及神经致残率，寻找一个安全有效的方法对于新生)LHE的治疗显的尤为重要和迫切，也是围生期工作者一直以来努力的方向。在循证医学大当其道的今天的现代医学，了解疾病的发病机制，根据其发病机制来寻找相应的治疗措施无疑是科学有效的方法之一。因此，了解新生儿缺氧缺血后神经细胞死亡的发生机制是寻我有特异疗效的治疗新生儿缺氧缺血性脑病的可行方法之一。一直以来，有关缺氧缺血后神经细胞死亡机制的研究曾未间断，研究者们对缺氧缺血后神经细胞死亡机制的认识，从最早期的以细胞坏死为主陪引，随后的以细胞凋亡为主巧1，直至现在开始出现在文献当中的“细胞凋亡一坏死连续体”蚓。新生儿缺氧缺血后神经细胞死亡机制研究的逐渐深入，也开始让更多的学者们将眼光投向如何早期中断神经细胞死亡的研究。因此，早期中断神经细胞死亡，减轻脑损伤及后遗症的发生，是近年来新生儿HIE的研究热点。缺氧缺血后新生儿脑损伤的发生机制非常复杂的，远比我们在动物实验中所发现的要复杂的多。缺氧缺血后继发的能量代谢障碍触发了许多病理生理反应，但是这些病理生理反应在线粒体水平有一个共同的交集。许多研究表明线粒体损伤可能是神经细胞缺氧损伤的中心环节，其中，线粒体膜通透性的改变是线粒体相关的凋亡诱导途径的关键步骤。线粒体膜通透性改变后，存在于内外膜间隙内的细胞色素C释放至胞浆中，激活caspase蛋白家族成员介导蛋白酶级联反应。目前认为，细胞中caspase一经活化，凋亡即不可避免口1。至目前为止，caspases已发现14种，其中caspase-3被认为是caspase级联反应中最关键的效应蛋白酶，其靶蛋白包括许多维持细胞内环境稳定的必需结构、代谢和修复的蛋白。caspase一3受到该家族成员以及其他蛋白酶激活后酶解切割其特异性底物，使底物结构改变或影响特定的信号分子而参与细胞凋亡的实施过程。无论任何途径激活的细胞凋亡最终都需要通过caspase-3完成，可以说caspase-3是细胞凋亡蛋白酶级联反应的最终通路。线粒体膜通透性转变可被多种因素激活，其中研究比较透彻的主要有两个途径阳州：1线粒体膜通透性转移孔道(膜间孔，PT孔道)的开放环孢菌素A依赖途青岛大学硕jb学位论文径，也被称为PT孔道途径。线粒体膜通透性孔道能被多种病理因素激活，激活后导致线粒体膜间隙蛋白因子释放入胞质中引起细胞凋亡。2促凋亡蛋白一一Bax途径，如Bax等蛋白可直接与线粒体外膜上的电位依赖性阴离子孔道(VDAC)结合。Bax在未成熟脑中呈高表达，在线粒体通透性调节中起关键作用，而随着大脑发育在成熟脑中Bax表达水平很低。未成熟脑缺氧缺血后Bax从细胞质转位到线粒体，使线粒体膜腔隙中的促凋亡蛋白释放，而Bax基因敲除小鼠对缺氧缺血后脑损伤有保护作用【10Bax抑制肽最初是作为一种bax途径诱导凋亡的抑制剂而被发现的。研究已证实，bax抑制肽在许多方面抑制凋亡的发生，例如活性氧的生产、胞质酸化和钙水平以及内质网应激信号转导通路n“。目前已有研究发现Bax抑制性多肽可以降低未成熟脑缺氧缺血后线粒体膜腔隙中的促凋亡蛋白的释放以及Caspase级联反应的激活减轻脑损伤。本研究采用制备新生鼠缺氧缺血性脑损伤模型，在模型建立后的不同时间点经左侧侧脑室穿刺注射5ug的Bax抑制肽。所有新生鼠均在模型建立后7天处死，对左侧海马区脑组织进行病理检查，TUNEL法检测凋亡阳性神经细胞数目及Westing-blot检测caspase-3含量；探讨Bax抑制肽对缺氧缺血脑损伤新生鼠神经细胞的抗凋亡作用以及有效治疗时间窗。第一章材料与方法第一章材料与方法11材料111实验动物新生7日龄Wister大鼠SCXK(鲁)20090007，雌雄不限，体质量12-169，共182只，由青岛市实验动物和动物实验中心提供。112实验药品和试剂1细胞色素C抗体产品编号：BS-0013R英文名称：Anti-Cytochrome C生产商名：北京博奥森生物技术有限公司2 活化半胱胺酸蛋白酶蛋白一3抗体产品编号：BS-008IR英文名称：Anti-Caspase一3(Active) 生产商名：北京博奥森生物技术有限公司3 Bax一抑制肷英文名称：BaxInhibiting Peptide，V5产品批号：196810生产商名：德国默克医药公司产品规格：5 mgmL4 高灵敏度化学发光检测试剂盒产品货号：CW0049生产商名：北京康为世纪生物科技有限公司5 细胞凋亡试剂盒英文名称：(Roche)Tunel试剂盒产品货号：11684817生产商名：上海罗氏公司6 自备试剂及用品手术器械载玻片及盖玻片防脱片用多聚赖氨酸02molL磷酸氢二钠储存液：500ml蒸馏水加Na2ttP0412H20 3581902molL磷酸二氢钠储存液：500ml蒸馏水加NaH2P042H20 1560902molL磷酸缓冲液(pH 76)4中性缓冲多聚甲醛固定液：40甲醛与001M PBS之比为l：9配制3青岛人学硕士学位论文10水合氯醛溶液8氮氧混合气体：青岛华瑞气体科技有限公司11-3主要实验仪器及设备1显微镜及显微成像系统2微量注射器(10u1)3脑组织切片机4蛋白电泳系统5 蛋白转膜系统6化学发光成像系统7 常压缺氧舱装置12方法121实验动物的分组与处理1 动物分组OLYMPUS BX4 1