B细胞型非霍奇金淋巴瘤CHFR基因mRNA表达与启动子区甲基化相关性研究

B细胞型非霍奇金淋巴瘤CHFR基因mRNA表达与启动子区甲基化相关性研究摘要目的检测B细胞型非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)组织中CHFR基因mRNA表达水平及其与启动子区甲基化的关系，同时探讨CHFR表达及甲基化水平与B细胞型非霍奇金淋巴瘤临床病理特征的关系。方法采用荧光定量PCR方法检测8l例B细胞型非霍奇金淋巴瘤组织和38例淋巴结反应性增生组织(RH)中CHFR mRNA的表达水平；采用甲基化特异性PCR方法检测B-NHL组织及RH组织中CHFR基因甲基化水平。结果81例B-NHL组织中不同程度低水平表达CHFR mRNA，其中2例表达缺失，而在淋巴结反应性增生组中该基因全部表达，B-NHL组CHFR mRNA相对表达量为021012，对照组CHFR mRNA相对表达量为027013，B-NHL组明显低于对照组(P：-O013)。81例B-NHL患者中21例患者出现CHFR基因启动子区甲基化，38例RH组织中未发现CHFR基因甲基化，差异有统计学意义(P：-O001)。B-NHL组织样本中甲基化组CHFR mRNA的相对表达量为013005，非甲基化组CHFR mRNA的相对表达量为023012，前者明显低于后者(尺001)，CHFR mRNA表达水平降低和启动子区甲基化负相关(r=0269，P：-O015)。B-NHL患者中III+IV期CHFRmRNA相对表达量为0170。09，I+II期患者的相对表达量为023013，前者明显低于后者，差异有统计学意义(P：-O024)；B-NHL按IPI评分分01分组和25分组，高评分组CHFR mRNA相对表达量为017009，低评分组相对表达量为023013，前者明显低于后者，差异具有统计学意义(P：-O042)。CHFR mRNA相对表达量与患者发病时年龄、有无全身症状、LDH水平、EC06评分及性别无差异性(P均005)。发生甲基化的2l例B-NHL患者中III+IV期甲基化率为417， I+II期患者甲基化率为133，前者明显高于后者，二者差异具有统计学意义(x 2=836，P：-O004)；发生甲基化的21例患者中IPI评分0-1分组8例(20)，25分组13例(65)，二者CHFR甲基化表达存在差异(X 2=526，P：-O022)。CHFR甲基化在患者发病时年龄、有无全身症状、LDH水平、ECOG评分及性别方面的差异无统计学意义(尸均005)。结论非霍奇金淋巴瘤组织中CHFR基因mRNA表达水平降低或缺失，CHFR基因启动子区异常甲基化在非霍奇金淋巴瘤中是频发事件，提示CHFR mRNA异常表达及启动子区甲基化参与了淋巴瘤的发生；CHFR基因mRNA表达水平降低与其启动子区发生甲基化负相关，提示在非霍奇金淋巴瘤的发生过程中，CHFR启动子区甲基化可能导致了该基因mRNA表达下调或缺失，使CHFR基因对细胞有丝分裂的调控功能失活，从而导致淋巴瘤的发生；CHAR基因表达下调及启动子区甲基化在B-NHL患者的临床分期及IPI评分方面具有差异，提示CHFR基因可能与肿瘤的发生及进展相关，mRNA表达下调及启动子去甲基化是预后不良的因素。硕士研究生：高艳华(儿科学)指导老师：宋爱琴副教授关键词：B细胞型非霍奇金淋巴瘤；CHFR基因；甲基化；实时荧光定量PCR；MSPStudy of mRNA expression level and hypermethylaion of CHFRpromoter Bcell NonHodgkinS lymphomaAbstractobjective To investigate the relationship between the CHFR expression level andaberrant methylation in non-Hodgldn lymphoma(NHL)，and analyzed the correlationbetween CHFR aberrant expression and clinicpathological characteristicsMethods The expression of CHFR mRNA were detected by Realtimefluorescence quantitative PCR as well as 3 8 reactive hyperplasia of lymph node(RH)samplesThe methylationspecific polymerase chain reaction(MSP)was used toexamine the methylation status of CHFR gene promoter in 8 1 NHL patients and 38 RHtissuesResults QCHFR mRNA was shown in the RH group，but the level of mRNAexpression was significantly lower in 8 1 B-NHL examples，and the mRNA was lossexpression in2 patientsThe relative expression level ofCHFRmRNAwas(021士012)in B-NHL，which was lower than CHFR mRNA in RH group(0274-01 3)Aberrantpromoter methylation of the CHFR gene was detected in 2 1 of 8 1 B-NHLsamples(259)，which no methylation Was detected in RH tissues，the discrepancy hadstatistical significance(P=0001)The CHFR mRNA expression level was(0134-005)in the aberrant methylation patients， which was significantly lower than that inunmethylation patients(0234-01 2)The expression of mRNA was associated with themethylation，the correlation coefficient was舻0296，P=001 5)The CHFR mRNAexpression level Was 01 74-009 at III+IV stage，which Was 0234-01 3 at I+II stage ofB-NHL，the discrepancy had statistical significance(尸=0024)，B-NHL divided into01 group and 2-5 group according to IPI score，the hi曲score group expression levelbelow the low score group(P=0042)However，the expression level of CHFR mRNAwas no correlated谢tll clinical character，such as age，gendeL B symptoms，serum LDHand ECOGThe aberrant methylation ofCHFR Was observed in 6(133)ofthe patientsat the stage I+II ofNHL，in 15(41。7)ofthe patients at the stage III+IVThere wassignificant difference between the stage of lymphoma and the aberrant methylation ofCHFR(=836，P=0004)Another difference was observed in IPI score，high IPI scoreNHL is more丘equently methylated than low IPI score(贮=526，P=0022)The aberrantmethylation of CHFR gene in B-NHL had no correlation with other clinicpathologicalcharacteristics，such as age，gender，B symptoms，serum LDH and ECOGConclusion OThe CHFR mRNA expression was downregulation or 10ss inB二NHL，and berrant methylation of CHFR was a丘equent event in BjNHL，which maycontribute to the occurrence of BNHLThe CHFR methylation was associated withthe expression of mRNA，indicated that the down-regulation and loss of mRNA causedby methylationTlliS made CHFR lOSS of function to mitosis and lead to the occurrenceof lymphomaAs CHFR mRNA expression tevel and promoter aberrant methylationwas associated with tumor stage and IPI score，it may indicate the malignancy andprogress of B_NHL and CHFR may become a diagnostic and therapeutic marker gene inthe futurePostgraduate student：Gao Yanhua(Pediatrics)Directed by ProfSong AiqinKey Word：Bcell non-HodgkinS lymphoma；CHFR gene；methylation；Real-timefluorescence quantitative PCR；MSP目录引言1第1章材料211研究对象212主要仪器213主要试剂3第2章方法421 B-NHL组织CHFR基因mRNA表达水平的检测421：l引物的设计与合成4212 B-NHL及RH石蜡标本组织RNA提取4213逆转录反应521。4实时荧光定量PCR。622 MSP检测B-NHL中CHFR基因甲基化状态6221 B-NHL及RH石蜡标本组织DNA的提取6222亚硫酸氢钠修饰基因组DNA7223 DNA纯化过柱回收7224甲基化特异性PCR阳性对照8225甲基化特异性PCR扩增(MSP)8226 DHPLC检测MSP扩增产物923统计学处理10第3章结果1l31 B-NHL组织中CHFR基因表达情况1l311 B-NHL组织中CHFR基因mRNA表达情况11312 B-NHL组织中CHFR基因甲基化情况1232 B-NHL组织中CHFR基因甲基化与mRNA表达水平相关性1233 B-NHL组织中CHFR基因与临床病理特征的关系13331 B-NHL中CHFR基因mRNA表达与临床病理特征的关系13332 B-NHL中CHFR基因甲基化与临床病理特征的关系15第4章讨论1741B-NHL患者中CHFR基因的表达水平及启动子区甲基化1742 CHFR表达及启动子区甲基化与B-NHL临床病理特征1843展望19结论21参考文献22综述27参考文献34攻读学位期间研究成果40附录41致谢43学位论文独创性声明学位论文知识产权权属声明44青岛大学硕士学位论文引言非霍奇金淋巴瘤(nonHodgkin lymphoma，NHL)是组起源于淋巴结和(或)结外器官的恶性肿瘤，易发生骨髓浸润，是最常见的恶性肿瘤之一n1。NHL可分为T细胞及B细胞两种细胞来源，其中B-NHL占901。B-NHL可发生于各个年龄组，发病率与年龄成正相关。随着放化疗以及免疫治疗的综合开展，患者的预后有很大改善，但因淋巴瘤病理类型及临床特征各有特点，造成患者对治疗反应的极大不同，从而呈现出高度的肿瘤异质性，导致个体预后的极大差异。随着对肿瘤发病机制研究的逐渐深入，肿瘤的研究热点逐渐从癌基因转移到抑癌基因，并发现后者在肿瘤发生发展中起着更重要的作用。大量研究证实，抑癌基因启动子区的异常高甲基化对肿瘤的发生及发展有着重要作用，多种肿瘤组织中的多种基因可检测到异常高甲基化口4儿5|。DNA甲基化是一种共价化学修饰，属于表观遗传学研究的主要内容之一。DNA甲基化可调控基因的表达，其可通过抑制RNA聚合酶活性、与特异性结合蛋白结合、改变染色质结构及阻碍转录因子与DNA结合等方式抑制基因的表达，引起转录后基因沉默。CHFR(checkpoint with FHA and ring finger)是Scolnick哺等于2000年发现的抑癌基因，定位于12q2433，是一个新的有丝分裂前期检查点基因，其编码产物为664个氨基酸的蛋白质，是一种能够控制细胞有丝分裂及检测正常细胞有丝分裂周期的功能蛋白。当细胞遭遇有丝分裂应激时，CHFR通过抑制染色体的聚集及中心体的分离阻滞细胞于有丝分裂G2M期1。研究发现CHFR泛素化表达于人体正常组织，但在食管癌、肺癌、结肠癌等多种恶性肿瘤中该基因低表达甚至缺失口吲，提示该基因的变异可能与肿瘤的发生有着密切的关系。随着表观遗传学研究的发展，抑癌基因启动子区CpG岛的高甲基化已被当作引起转录沉默的普遍机制n 0I。启动子区CpG岛甲基化导致CHFR表达下调或缺失在人类肿瘤细胞中被证实，包括食管癌、结肠癌、胆囊癌、口腔鳞状细胞癌、肺癌、头颈部鳞状细胞癌及皮肤T细胞淋巴瘤uH7 3等。但有关CHFR基因甲基化在淋巴瘤发病中所起的作用却少见报道。本研究通过检测B-NHL患者组织标本中CHFR基因mRAN的表达及甲基化水平，分析其与B-NHL临床特征之间的关系，以期为阐明B-NHL的发病机制及基因靶向治疗提供新的线索。材料第1章材料11研究对象收集2009年1月至2012年3月在青岛大学医学院附属医院确诊的B细胞非霍奇金淋巴瘤(BNHL)石蜡标本81例，男52例，女29例；年龄3-86岁，平均年龄48691989岁；淋巴结反应性增生(RH)组织石蜡标本38例作为对照组。所有病例均由2位病理医生按照WH02008年淋巴造血组织分类新标准重新阅片分类，弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)34例，介于弥漫大B细胞性淋巴瘤和伯基特淋巴瘤之间不能分类的B细胞淋巴瘤(DLBCLBL)6例，滤泡性淋巴瘤(FL)7例，结外粘膜相关淋巴组织边缘带淋巴瘤(MALT淋巴瘤)12例，伯基特淋巴瘤(BL)8例，套细胞性淋巴瘤(MCL)6例，淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL)3例，小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)3例，B细胞淋巴母细胞性淋巴瘤(LBL)2例。同时整理患者的临床病理资料如B症状(盗汗、发热及体重减轻)、LDH(245UL为正常)、ECOG评分及IPI评分(包括年龄、一般状况、血LDH、结外受累部位及临床分期)，所有患者均按照AnnArbor分期系统标准进行分期，其中早期(工期+II期)45例，晚期(III期+IV期)36例。所有患者术前均未接受糖皮质激素及其它免疫抑制剂、化疗以及放疗等治疗。12主要仪器超净工作台(型号SwCJ一1FD)：购自苏州安泰空气技术有限公司制冰机(型号SIMF140)：购自日本SANYO公司紫外分光光度计(型号22331)：购自