Duchenne型肌营养不良的遗传学、血清生化学及病理学的探讨

遵义医学院硕士研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。学位论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在学位论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：唧手臻闻 签字日期：加侈年歹月；日遵义医学院学位论文版权使用授权书本人完全了解遵义医学院有关保留、使用学位论文的规定，即：遵义医学院有权保留并向有关部门或机构送交学位论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权遵义医学院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存学位论文，即：遵义医学院具有学位论文的数字化制品复制权，信息网络传播权和汇编权。保密的学位论文在解密后适用本授权书。学位论文作者签名：砰壤润签字日期：州弓年厂月7日新繇或拗导师签名：多彰秒溯签字日期：硼严9月力秒日遵义医学院硕士学位论文缩略词K呱ASTBMDCKCOX染色DABDMDDysCDvsNDysRHE染色MGT染色MLPANADHTR染色NBTORO染色PAS染色SDH染色SNP英文缩略词表Il英文全称alanine arninotransferase 丙氨酸氨基转移酶aspartate aminotransferase 天门冬氨酸氨基转移酶Becker muscular dystrophy 贝克型肌营养不良Creatine Kinase 肌酸激酶cytochrome C oxidase 细胞色素C氧化酶染色3，3-diaminobenzidine 3,3二氨基联苯胺盐酸盐Ducherme Muscular Dystrophy 杜氏型肌营养不良Dystrophin Cterminus mouse 鼠抗入抗肌萎缩蛋白单克monoclonal antibody 隆抗体C端Dystrophin Nterminus mouse 鼠抗人抗肌萎缩蛋白单克monoclonal antibody 隆抗体N端Dystrophin R-terminus mouse 鼠抗人抗肌萎缩蛋白单克monoclonal antibody 隆抗体R端hematoxylineosin 苏木精伊红染色modified Gomori trichrome 改良三色Gomori染色mukiplex ligationdependent probe 多重连接依赖性探针扩增amplification 技术13-nicotinamideadenine dinucleotide 还原型辅酶I四氮唑还原tetrazolium reductase 酶染色Nitro blue tetrazolium 硝基四唑蓝oil red O 油红O染色periodic acid Schiff 糖原染色succinate dehydrogenase 琥珀酸脱氢酶染色single nucleotide polymorphism 单核苷酸多态性遵义医学院硕士学位论文 目录目 录1、 论文O 0 0 0 0 0 0 0 0 0 D O O D D一1中文摘要1英文摘要3前言“一一5胃U吾“”“一”“”一0材料与方法7结果13讨论27结论32参考文献332、 综述：一383、 致谢504、 作者简介51遵义医学院硕士学位论文 中文摘要Duchenne型肌营养不良的遗传学、血清生化学及病理学的探讨中文摘要目的：观察杜氏型肌营养不良(DMD)基因突变分布情况，了解儿童DMD基因突变特点。探讨DMD患儿血清肌酸激酶(CK)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)的变化规律及CK与AST、ALT之间的相关性。分析DMD肌肉病理改变，及其与年龄的关系。方法：收集DMD的男性患儿。采用多重连接依赖性探针扩增技术(MLPA)检测患儿DMD基因的突变情况。采用酶联免疫荧光法和速率法分别测定不同年龄段患儿的血清CK和蝴、AST活性。冰冻切片，肌肉标本经常规组织化学染色及免疫组织化学染色，观察DMD患儿肌肉病理改变及抗肌萎缩蛋白表达情况。结果：共收集DMD患儿177名。(1)进行DMD基因检测的患儿共163例。MLPA法检测DMD外显子缺失7117(116163)，外显子重复1043(17163)，外显子未见异常1840(30163)。30例外显子未见异常的患儿中，有10名患儿运用第2代高通量测序技术进行了DMD基因测序，均发现DMD基因点突变。存在2个缺失“热区”：主缺失热区位于第45-53外显子，占缺失总数的3430：次缺失热区位于第5-19外显子，占缺失总数的2623。缺失片段以第49-52外显子最多，单个外显子缺失主要分布在第45外显子。重复突变主要位于DMD基因的N端和棒状区。(2)进行血清酶学检测的患儿共165例，共采血318次。婴儿期DMD患儿的CK、AST、岍活性即明显升高，分别达到正常值的10、7、5倍以上，并均维持至8岁，以后随着年龄的增长逐渐回落。血清CK分别与AST(厂=O817，p001)、岍(严O669，PO01)呈正相关。(3)进行肌肉活检的患儿共124例。DMD临床表现进行性加重，婴幼儿期已存在病理变化，主要表现为肌纤维的萎缩及肥大，可见肌纤维变性及坏死、炎细胞浸润；病程后期主要病理改变为少数肌纤维残存，脂肪结缔组织增生，年龄越大病变越严重。DysC、DysN、DysR免疫组织化学染色均为0l级表达，与患儿年龄及临床症状严重程度无特定关系。结论：(1)DMD以基因缺失突变为主，突变位点非均匀分布于整个基因，存在突变热遵义医学院硕士学位论文 中文摘要U,；i HI il I|曼曼舅舅舅喜曼蔓皇皇曼舅曼曼量邑曼曼量量邑量邑|量量目曼蔓曼量舅|皇|l区。(2)DMD患儿血清CK、AST、刖-一T活性反映DMD的发生、发展过程，血清AST、6岍与CK之间有显著相关性，可为早期诊断、减少误诊提供重要依据。(3)DMD患者临床病情和病理改变的严重程度主要与病程和活检年龄相关，与是否保留少数dys仃ophm蛋白阳性纤维无明显相关。(4)突变基因位点及长度与DMD临床症状之间无明显相关关系关键词：杜氏型肌营养不良；肌酸激酶；天门冬氨酸氨基转移酶：丙氨酸氨基转移酶：肌肉活检；基因突变2遵义医学院硕士学位论文 英文摘要A Investigation on Genetics，Serum Biochemistry and Pathology inDuchenne Muscular DystrophyAbstractObjective：To observe the mutation of DMD gene in childrenTo investigate the dynamicof serum CK and transaminase and the correlation between the two enzymes of DMDTOanalyz muscle pathology of DMD，and the correlation with the ageMethods：The mutation of DMD gene was detect in DMD boys by using multiplexligationdependent probe amplification(MLPA)Using enzymelinked immunosorbentfluorescence method and rate method，serum CK，ALT and AST levels were measuredThemuscle pathological changes and expression of dystrophin in muscle fibers from 1 22 DMDboys were observed by using frozen section， conventional staining andimmunohistochemical stainingResults：177 boys with DMD were prospectively studied(1)163 boys had DMD genedetectionBy MLPA assay,the deletion mutation was account for 7 11 7(1 1 61 63)ofDMD and the duplication mutations was account for 1 043(1 7163)，no gene mutationshad been detected in 1840(30163)Of 30 children whose gene mutations was not beenfound，1 0 were found DMD gene point mutations with next-generation sequencingtechnologyThere were two deletion hot spot：the main deletion hot spot located at exon 45t0 53，accounting for 3430of the total number of deletion mutation；the other oneheated at 5terminal exon 5 to 1 9，accounting for 2623of the total number of deletionmutationThe highest frequency deletion fragment among them was exon 49 to 52Thehi曲est frequency deletion among them was exon 45The main duplication mutationslocated at Nterminal and rod domain(2)We reported 3 1 8 enzyme data set from 1 65patients with DMDThe CK,AST,ALT activity in infants with DMD were significantlyincreased more than the normal 1 0，7，5 times respectively,and were maintained until theage of 8，then gradually declined with age increasingEnzymes showed a linear correlationbetween CK andAST(r=0817，PO01)or CK andALT(r=0669，P001)levels(3)124patients谢th DMD have muscle biopsyAt the infant period of DMD，there werepathological changes，mainly as atrophy and hypertrophy of muscle fibersThere were alsodegenerations and necrosis，inflammatory cell infiltrationAt the late stage，there was littlenumber of muscle fibers，fatty connective tissue proliferationThe elder the more气遵义医学院硕士学位论文 英文摘要E皇。im I,_II I!|一seriousDys-C the DysN，the DysR immunohistochemical staining expression were 0 toI，with the age of the child and the severity of the clinical symptoms were not significantlyrelatedConclusion：(1)The deletion mutation of DMD gene is the main type of gene mutationThe mutation point difusedly locates in the entire gene，but has mutation hot spot(2)Serum CK，AST,ALT level carl reflect the DMD occurance and progreess，and provide a11important basis for the early diagnosis of DMD(3)The severity of clinical illness andpathological changes is associated with the course of the disease and the age of musclebiopsy,and has no significant correlation with whether to retain a small number ofdystrophin positive fibers of DMD(4)There is no obvious correlation between mutationlocation，the length and the clinical symptomsKey Wo rds：Duchenne Muscular Dystrophy,Creatine Kinase，Alanine Transaminase，Aspartate Transaminase，Muscle biopsy,Genetic mutation4遵义医学院硕士学位论文 前言-I一翮 吾杜氏型肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是以肌纤维变性、坏死、再生以及结缔组织增生为主要病理特点，以进行性、对称性肌无力，肌萎缩或假性肌肥大为临床特征的原发于肌纤维的X连锁隐性遗传性疾病，发病率为13500活产男婴【l】。患儿的肌肉损害多在出生时即已存在，常在婴幼儿期有运动发育迟缓的现象，但其异常表现多未能引起家长的重视【2】。临床症状多在患儿36岁左右开始明显，并进行性加重。肌无力首先表现在髋部和四肢近端，且下肢症状重于上肢。约90病例有腓肠肌假性肥大13J。10A一12岁之后无法行走，18-20岁死于心脏或呼吸功能衰竭。贝克型肌营养不良(Becker muscular dystrophy，BMD)又称良性假肥大型肌营养不良症，为DMD的等位基因疾病，其发病率为X连锁的肌营养不良的110，临床表现与DMD类似，但进展缓慢，病情较轻，存活期长，接近正常人寿命。 DMD基因定位于Xp21。1-3，有79个外显子及78个内含子【4J，具有较高频率的新突变和异位断裂点，突变率为110000，约有13患者系新突变【5J。基因突变类型种类较多【61，不同文献报道的比例略有不同【71。基因缺失为主要突变类型，分布于整个DMD基因，存在2个缺失“热区：主缺失热区位于棒状区的第45-53外显子，次缺失热区位于5端的第1219外显子【8】。重复突变最常发生于第2-一20外显子。基因突变和疾病的临床表现并不呈简单的相关关系们。国内针对此类的研究较少。DMD以持续性血清肌酸激酶(Creatine Kinase，CK)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)和丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，创)升高为生化特点。由于CK、AST、。岍分别是心脏、肝脏损伤的重要生化指标，且婴幼儿期DMD患儿运动发育不完善、皮下脂肪多，缺乏肌无力、肌萎缩等DMD的典型临床表现，因此临床上容易被误诊为心肌炎或者肝炎1118】。糖皮质激素是治疗DMD的唯一有效药物，长期规律用药可延缓DMD病情进展，延长患者步行能力25年，提高患者生活质量，延长患者寿命f19-24。多数学者主张到骨骼肌发育的平台期(46岁)以后使用糖皮质激素【2l】。最近，Merlini等口51做的一项研究，表明5遵义医学院硕士学位论文 前言早期使用激素效果明显好于平台期以后使用。关于CK在骨骼肌疾病中变化的研究甚多【26彻，但却很少见到有关DMD的CK变化以及CK与转氨酶之间的相关性研究，近年McMillan等【28】用统计学方法和数学建模工具分析了55例患者的血CK、AST、。岍的关系，指出CK分别与AST和ALT呈正相关。