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Duchenne型肌营养不良的遗传学、血清生化学及病理学的探讨Duchenne型肌营养不良的遗传学、血清生化学及病理学的探讨 -- 260 元

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遵义医学院硕士研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。学位论文中除了特别加以标注和致谢的地方外,不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在学位论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名唧手臻闻签字日期加侈年歹月日遵义医学院学位论文版权使用授权书本人完全了解遵义医学院有关保留、使用学位论文的规定,即遵义医学院有权保留并向有关部门或机构送交学位论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。本人授权遵义医学院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以公布学位论文的全部或部分内容,可以采用影印、缩印或其它复制手段保存学位论文,即遵义医学院具有学位论文的数字化制品复制权,信息网络传播权和汇编权。保密的学位论文在解密后适用本授权书。学位论文作者签名砰壤润签字日期州弓年厂月7/日新繇或拗导师签名多%彰秒溯签字日期硼严9月力秒日遵义医学院硕士学位论文缩略词K呱ASTBMDCKCOX染色DABDMDDysCDvs.NDysRHE染色MGT染色MLPANADH.TR染色NBTORO染色PAS染色SDH染色SNP英文缩略词表Il英文全称alaninearninotransferase丙氨酸氨基转移酶aspartateaminotransferase天门冬氨酸氨基转移酶Beckermusculardystrophy贝克型肌营养不良CreatineKinase肌酸激酶cytochromeCoxidase细胞色素C氧化酶染色3,3diaminobenzidine3,3.二氨基联苯胺盐酸盐DuchermeMuscularDystrophy杜氏型肌营养不良DystrophinCterminusmouse鼠抗入抗肌萎缩蛋白单克monoclonalantibody隆抗体C端DystrophinNterminusmouse鼠抗人抗肌萎缩蛋白单克monoclonalantibody隆抗体N端DystrophinRterminusmouse鼠抗人抗肌萎缩蛋白单克monoclonalantibody隆抗体R端hematoxylin.eosin苏木精.伊红染色modifiedGomoritrichrome改良三色Gomori染色mukiplexligation.dependentprobe多重连接依赖性探针扩增amplification技术13nicotinamide.adeninedinucleotide.还原型辅酶I.四氮唑还原tetrazoliumreductase酶染色Nitrobluetetrazolium硝基四唑蓝oilredO油红O染色periodicacidSchiff糖原染色succinatedehydrogenase琥珀酸脱氢酶染色singlenucleotidepolymorphism单核苷酸多态性遵义医学院硕士学位论文目录目录1、论文O000000000DOODD..一1中文摘要1英文摘要3前言一一5胃U吾一一0材料与方法7结果13讨论27结论32参考文献332、综述一383、致谢504、作者简介51遵义医学院硕士学位论文中文摘要Duchenne型肌营养不良的遗传学、血清生化学及病理学的探讨中文摘要目的观察杜氏型肌营养不良DMD基因突变分布情况,了解儿童DMD基因突变特点。探讨DMD患儿血清肌酸激酶CK、天门冬氨酸氨基转移酶AST、丙氨酸氨基转移酶ALT的变化规律及CK与AST、ALT之间的相关性。分析DMD肌肉病理改变,及其与年龄的关系。方法收集DMD的男性患儿。采用多重连接依赖性探针扩增技术MLPA检测患儿DMD基因的突变情况。采用酶联免疫荧光法和速率法分别测定不同年龄段患儿的血清CK和蝴、AST活性。冰冻切片,肌肉标本经常规组织化学染色及免疫组织化学染色,观察DMD患儿肌肉病理改变及抗肌萎缩蛋白表达情况。结果共收集DMD患儿177名。1进行DMD基因检测的患儿共163例。MLPA法检测DMD外显子缺失71.17%116/163,外显子重复10.43%17/163,外显子未见异常18.40%30/163。30例外显子未见异常的患儿中,有10名患儿运用第2代高通量测序技术进行了DMD基因测序,均发现DMD基因点突变。存在2个缺失热区主缺失热区位于第4553外显子,占缺失总数的34.30%次缺失热区位于第519外显子,占缺失总数的26.23%。缺失片段以第4952外显子最多,单个外显子缺失主要分布在第45外显子。重复突变主要位于DMD基因的N端和棒状区。2进行血清酶学检测的患儿共165例,共采血318次。婴儿期DMD患儿的CK、AST、岍活性即明显升高,分别达到正常值的10、7、5倍以上,并均维持至8岁,以后随着年龄的增长逐渐回落。血清CK分别与AST厂O.817,p0.01、√岍严O.669,PO.01呈正相关。3进行肌肉活检的患儿共124例。DMD临床表现进行性加重,婴幼儿期已存在病理变化,主要表现为肌纤维的萎缩及肥大,可见肌纤维变性及坏死、炎细胞浸润病程后期主要病理改变为少数肌纤维残存,脂肪结缔组织增生,年龄越大病变越严重。Dys.C、Dys.N、Dys.R免疫组织化学染色均为0~l级表达,与患儿年龄及临床症状严重程度无特定关系。结论1DMD以基因缺失突变为主,突变位点非均匀分布于整个基因,存在突变热遵义医学院硕士学位论文中文摘要U,.iHIilI■|曼曼舅舅舅喜曼蔓皇皇曼舅曼曼量邑曼曼量量■邑■量邑|量■量■目■曼蔓曼量舅||■皇■■■■■|■●●l区。2DMD患儿血清CK、AST、刖一T活性反映DMD的发生、发展过程,血清AST、6岍与CK之间有显著相关性,可为早期诊断、减少误诊提供重要依据。3DMD患者临床病情和病理改变的严重程度主要与病程和活检年龄相关,与是否保留少数dys仃ophm蛋白阳性纤维无明显相关。4突变基因位点及长度与DMD临床症状之间无明显相关关系关键词杜氏型肌营养不良肌酸激酶天门冬氨酸氨基转移酶丙氨酸氨基转移酶肌肉活检基因突变2遵义医学院硕士学位论文英文摘要AInvestigationonGenetics,SerumBiochemistryandPathologyinDuchenneMuscularDystrophyAbstractObjectiveToobservethemutationofDMDgeneinchildren.ToinvestigatethedynamicofserumCKandtransaminaseandthecorrelationbetweenthetwoenzymesofDMD.TOanalyzmusclepathologyofDMD,andthecorrelationwiththeage.MethodsThemutationofDMDgenewasdetectinDMDboysbyusingmultiplexligationdependentprobeamplificationMLPA.Usingenzymelinkedimmunosorbentfluorescencemethodandratemethod,serumCK,ALTandASTlevelsweremeasured.Themusclepathologicalchangesandexpressionofdystrophininmusclefibersfrom122DMDboyswereobservedbyusingfrozensection,conventionalstainingandimmunohistochemicalstaining.Results177boyswithDMDwereprospectivelystudied.1163boyshadDMDgenedetection.ByMLPAassay,thedeletionmutationwasaccountfor71.17%116/163ofDMDandtheduplicationmutationswasaccountfor10.43%17/163,nogenemutationshadbeendetectedin18.40%30/163.Of30childrenwhosegenemutationswasnotbeenfound,10werefoundDMDgenepointmutationswithnextgenerationsequencingtechnology.Thereweretwodeletionhotspotthemaindeletionhotspotlocatedatexon45t053,accountingfor34.30%ofthetotalnumberofdeletionmutationtheotheroneheatedat5terminalexon5to19,accountingfor26.23%ofthetotalnumberofdeletionmutation.Thehighestfrequencydeletionfragmentamongthemwasexon49to52.Thehi曲estfrequencydeletionamongthemwasexon45.ThemainduplicationmutationslocatedatNterminalandroddomain.2Wereported318enzymedatasetfrom165patientswithDMD.TheCK,AST,ALTactivityininfantswithDMDweresignificantlyincreasedmorethanthenormal10,7,5timesrespectively,andweremaintaineduntiltheageof8,thengraduallydeclinedwithageincreasing.EnzymesshowedalinearcorrelationbetweenCKandASTr0.817,PO.01orCKandALTr0.669,P0.01levels.3124patients谢thDMDhavemusclebiopsy.AttheinfantperiodofDMD,therewerepathologicalchanges,mainlyasatrophyandhypertrophyofmusclefibers.Therewerealsodegenerationsandnecrosis,inflammatorycellinfiltration.Atthelatestage,therewaslittlenumberofmusclefibers,fattyconnectivetissueproliferation.Theelderthemore气遵义医学院硕士学位论文英文摘要■E皇。imI,_III■■|■■一serious.DysCtheDysN,theDysRimmunohistochemicalstainingexpressionwere0toI,withtheageofthechildandtheseverityoftheclinicalsymptomswerenotsignificantlyrelated.Conclusion1ThedeletionmutationofDMDgeneisthemaintypeofgenemutation.Themutationpointdifusedlylocatesintheentiregene,buthasmutationhotspot2SerumCK,AST,ALTlevelcarlreflecttheDMDoccuranceandprogreess,andprovidea11importantbasisfortheearlydiagnosisofDMD.3Theseverityofclinicalillnessandpathologicalchangesisassociatedwiththecourseofthediseaseandtheageofmusclebiopsy,andhasnosignificantcorrelationwithwhethertoretainasmallnumberofdystrophinpositivefibersofDMD.4Thereisnoobviouscorrelationbetweenmutationlocation,thelengthandtheclinicalsymptoms.KeyWordsDuchenneMuscularDystrophy,CreatineKinase,AlanineTransaminase,AspartateTransaminase,Musclebiopsy,Geneticmutation4遵义医学院硕士学位论文前言I●一翮吾杜氏型肌营养不良Duchennemusculardystrophy,DMD是以肌纤维变性、坏死、再生以及结缔组织增生为主要病理特点,以进行性、对称性肌无力,肌萎缩或假性肌肥大为临床特征的原发于肌纤维的X.连锁隐性遗传性疾病,发病率为1/3500活产男婴【l】。患儿的肌肉损害多在出生时即已存在,常在婴幼儿期有运动发育迟缓的现象,但其异常表现多未能引起家长的重视【2】。临床症状多在患儿3~6岁左右开始明显,并进行性加重。肌无力首先表现在髋部和四肢近端,且下肢症状重于上肢。约90%病例有腓肠肌假性肥大13J。10A一12岁之后无法行走,1820岁死于心脏或呼吸功能衰竭。贝克型肌营养不良Beckermusculardystrophy,BMD又称良性假肥大型肌营养不良症,为DMD的等位基因疾病,其发病率为X.连锁的肌营养不良的1/10,临床表现与DMD类似,但进展缓慢,病情较轻,存活期长,接近正常人寿命。DMD基因定位于Xp21。13,有79个外显子及78个内含子【4J,具有较高频率的新突变和异位断裂点,突变率为1/10000,约有1/3患者系新突变【5J。基因突变类型种类较多【61,不同文献报道的比例略有不同【71。基因缺失为主要突变类型,分布于整个DMD基因,存在2个缺失热区主缺失热区位于棒状区的第45~53外显子,次缺失热区位于5端的第12~19外显子【8】。重复突变最常发生于第2一20外显子。基因突变和疾病的临床表现并不呈简单的相关关系㈨们。国内针对此类的研究较少。DMD以持续性血清肌酸激酶CreatineKinase,CK、天门冬氨酸氨基转移酶aspartateaminotransferase,AST和丙氨酸氨基转移酶alanineaminotransferase,创』升高为生化特点。由于CK、AST、。岍分别是心脏、肝脏损伤的重要生化指标,且婴幼儿期DMD患儿运动发育不完善、皮下脂肪多,缺乏肌无力、肌萎缩等DMD的典型临床表现,因此临床上容易被误诊为心肌炎或者肝炎1118】。糖皮质激素是治疗DMD的唯一有效药物,长期规律用药可延缓DMD病情进展,延长患者步行能力2~5年,提高患者生活质量,延长患者寿命f1924。多数学者主张到骨骼肌发育的平台期4.6岁以后使用糖皮质激素【2l】。最近,Merlini等口51做的一项研究,表明5遵义医学院硕士学位论文前言早期使用激素效果明显好于平台期以后使用。关于CK在骨骼肌疾病中变化的研究甚多【26彻,但却很少见到有关DMD的CK变化以及CK与转氨酶之间的相关性研究,近年McMillan等【28】用统计学方法和数学建模工具分析了55例患者的血CK、AST、。岍的关系,指出CK分别与AST和ALT呈正相关。但这一结果并没有引起足够重视,且没有应用于临床诊断,因此很多患儿错过了应用糖皮质激素的最佳时期。DMD患儿的血清CK、AST、坝之前的关系是值得研究的问题,这对于早期诊断DMD有重要意义。。DMD最有特征性的表现是在病理学方面,且肌肉组织病变程度与年龄有一定关系,年龄越大病变越重【3】。HE染色可见不同程度的圆形萎缩、肥大、变性、坏死及部分再生、断裂肌纤维,肌核增多、内移,肌纤维间隙不同程度增宽,有炎细胞浸润,脂肪结缔组织不同程度增生【291。Dystrophin蛋白由DMD基因编码,是细胞骨架蛋白,具有维持细胞形态及功能的作用。DMD基因突变可导致dystrophin蛋白表达完全缺失或部分缺失,通过肌肉活检,应用免疫组织化学染色可以明确DMD的诊断及分型,并与其他肌肉疾病相鉴别。但肌肉活检为一种有创性检查,且需要有经验的神经专科医师指导,故目前的研究国内外主要采用mdx小鼠进行。Mdx小鼠为DMD的模型动物,与DMD患者一样拥有DMD基因突变,但该模型只呈现出较轻的表型,肌肉病理改变缓慢进展,不形成广泛的肌肉萎缩及纤维结缔组织增生,亦不丧失行走能力,只表现为寿命的缩短【291,国内此类研究较少见,且国内以人为对象的研究病例数较少3,3033】。本研究采用多重连接依赖性探针扩增技术multiplexligationdependentprobeamplification,MLPA测定DMD基因外显子突变情况采用酶联免疫荧光法和速率法分别测定不同年龄段患儿的血清CK和ALT、AST活性,分析其变化规律及它们之间的关系采用免疫组织化学染色测定dystrophin蛋白表达程度,分析其与DMD基因突变和临床表现之间的关系,强调免疫组织化学染色检测dystrophin蛋白表达程度对DMD的诊断价值,探讨早期诊断、减少误诊DMD的可能性。6
编号:201403192117530445    大小:6.10MB    格式:PDF    上传时间:2014-03-19
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vyyolyg827上传于2014-03-19

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