IL17F基因多态性与儿童肠道病毒71型脑炎的相关性研究

l L_1 7F基因多态性与儿童肠道病毒71型脑炎的相关性研究中文摘要目的：研究IL17F基因多态性与儿童肠道病毒71型脑炎的关系，探讨EV71脑炎的遗传易感性。方法：收集2011年7月份-2012年6月份手足口病患儿病例。运用RT-PCR方法检测患儿大便或脑脊液标本EV71RNA阳性者185例，按临床表现分为单纯HFMD组127例，HFMD并脑炎组58例，提取外周血DNA，用iMLDRTM多重SNP分型技术检测IL17F7488TC位点的基因多态性。结果：(1)EV71脑炎组患儿IL17F7488位点基因型CT+CC的分布频率显著低于单纯HFMD组(1 03，276，P=0008)，C等位基因分布频率显著低于单纯HFMD组(15，OR=0310，95CI=01270756，P=O006)。(2)EV71感染后IL17F7488位点TT基因型携带者的CRP、自细胞、中性粒细胞比率较其他基因型携带者显著升高。结论：IL17F参与了EV71脑炎的病理生理过程，IL17F7488TC位点TC的基因变异减弱了EV71感染后的炎症反应，降低了EV71脑炎的患病风险，C等位基因是保护基因，而TT基因型、T等位基因是EV71脑炎的遗传易感因素。硕士研究生韩伟平指导教师 陈宗波教授关键词： 肠道病毒71型；病毒性脑炎；IL-17F；多态性Association of Interleukin一17F Gene Polymorphism with Enterovirus 71Encephalitis in Patients with Hand，foot,and Mouth DiseaseABSIRAC。IObjective：To investigate the relationship between Intedeukin-17F Gene polymorphismand the susceptibility of enterovirus 71 infection in Chinese childrenMethods：127 CS。SeS of HFMD without encephalitis and 58 cases of encephalitis wereinvestigated at the Affiliated Hospital of Qingdao Univerity Medical School andChildrenS Hospital of Qingdao，ChinaAll of them were detected EV7 l infection byreverse transcription polymerase chain rection(RT-PCR)Using the method of thetechnologic of iMLDRMultiplex SNP genotypingrhe nterleukin-1 7F,7488TC genepolymorphism were detectedResult：(1)The frequency of IL一17F 7488TC+CC genotypes was significantly lower among thepatients with Ev7 1 encephalitis(1 03)as compared to that of the patients withEV71-related HFMD without complications(276，p=o008)The patients with EV71enc砷halitis had a significantly lower fiequency of the IL1 7F 7488C alleles(52)ascompared to that of the patients with EV71-HFMD without complications(15，OR=03 1 0，95CI=01 270756，p=0006)(2)Homozygotes with the T allele had significantly higher levels of C-reactive protein,white blood cell count,and neutrophil count as tom-pared to the patients、析m CC+CTgenotypes(p=0004，0001，and 0000，respectively)Conclusion：(1)This study suggested that the IL一17F 7488TIC polymorphism were involved in theinflammatory process of EV71 infection(2)The IL-1 7F 7488C allele could be significantly associated with protection againstencephalitis in Chinese patients with EV7 1-related HFMDPostgraduate student：Han Weiping(peadiatries)Directed by ProfChen Zong-BoKey words：Enterovirus 71；clinical characteristic；Intedeukin一18；Polymorphism；目录jjl言1第一章材料与方法211材料212方法。4第二章结果921一般临床资料 922 IL17F7488TC位点多态性分析9第三章讨论12第四章结论14参考文献1 5综j述1 8综述参考文献25攻读学位期间的研究成果29致谢30学位论文独创性声明、学位论文知识产权权属声明31英文缩写Ev7lHFMDEEGMRJCSFILSNP缩略词索引表英文全称enterovirus 71hand,foot and mouse diseaselectroencephalogramMagnatic Resonance Imagingeerebrospinal fluidTumor Necrosis FactorSingle Nucleotide Polymorphism中文译名肠道病毒7l型手足口病脑电图头颅核磁脑脊液白细胞介素单核苷酸多态性引言引言手足口病是儿童常见传染性病之一，近年来在全球范围内广泛流行【I】。手足口病可由多种病原引起，包括肠道病毒71型(enterovirus 71)，科萨奇病毒(coxsackievirus)A16、A4、A5、A8、A10、B3、B7A等，其中以肠道病毒71型和科萨奇16最常见12J。大部分手足口病患儿仅表现为发热，手、足、口、臀等部位皮疹或疱疹，病程呈自限性，对症处理后可自愈。但少数EV71感染患儿可并发病毒性脑炎、脑膜炎、脑干脑炎、脊髓灰质炎样麻痹、神经源性肺水肿等【31，其死亡率与致残率较高。自1997年以来，我国先后有数千例EV71感染引起的死亡病例报道，主要死于脑干脑炎和神经源性肺水肿4-71。但目前关于EV71引起手足口病或脑炎的发病机制、遗传易感因素等尚未完全明确。EV71感染后机体释放大量炎症因子，这些炎症因子在EV71脑炎的病理生理过程中有举足轻重的作用隅-9。在研究EV7l脑干脑炎时，发现淋巴细胞表面的糖蛋白1(CDl62)可与肠道病毒71型相互作用诱导大量炎症因子的释放。这些因子不仅介导了机体的固有免疫和获得性免疫发挥抗病毒作用，同时也可对机体的器官和组织造成一定程度的损害【lo】。有研究显示，EV71脑炎组血浆中炎症因子和趋化因子的水平明显高于单纯手足口病组患jI,t11d2J。同时在动物实验中发现n31，EV71感染的老鼠模型持续高水平的炎症因子造成了器官和组织的损害。近来大量研究发现，IL17和11117细胞参与了EV71感染的病理生理过程【141。IL17F是IL17家族中的一种，其也参与EV7l的感染过程【l 51。IL17F能够促进其他炎症因子及趋化因子(也6，CXCLlO)的释放，使炎症反应进一步扩大。据报道uoJ，IL17F7488TC(瑙763780)位点的基因TC的改变可导致IL17F激活促炎细胞因子及趋化因子的能力下降能对抗野生型IL17F的促炎反应，但对于IL-17F，7488TC位点基因多态性与EV71感染相关性研究尚未见报道。本研究利用iMLDRTM多重SNP分型技术，对185例EV71感染患儿IL17F7488TC位点单核苷酸的多态性进行分析，探讨其IL17F7488TC位点基因多态性与EV71脑炎患病风险的关系。青岛大学硕士学位论文11材料111研究对象第一章材料和方法2011年7月2012年6月期间诊断为手足口病的患儿185例，男116例，女73例，年龄2146岁，其中单纯HFMDl27人，HFMD并脑炎58人。其诊断标准符合HFMD控制指南(2010版)，且经RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)方法对粪便或脑脊液检测EV71核酸RNA均为阳性。所有患儿收集急性期大便标本(入院5天内)经处理后保存于7012冰箱内。同时收集静脉血2ml(入院24小时)于乙二胺四醋酸(EDTA)抗凝管中20保存。两组患儿无血缘关系，在年龄和性别上无显著差异。112主要试剂异硫氰酸胍9一硫基乙醇十二烷肌氨基酸柠檬酸钠无水乙醇异丙醇DEPC血液基因组DNA提取试剂盒普通PCR扩增试剂盒10 X loading buffer限制性内切酶NlalllDNA Marker琼脂糖电泳上样缓冲液TAE核酸染料GELVIEW上海生工FlukaAmercoca北京鼎国宝泰克宝泰克宝泰克TIANGEN公司产品TaKaRaTaKaRaNEBTaKaRaPromega宝泰克宝泰克2美国美国美国中国中国中国中国中国日本日本美国日本美国中国中国第一章材料和方法113主要仪器电子天平 Sarroriou公司加样枪 Eppendorf公司凝胶图像分析系统 PALL公司超净工作台 北京西城区半导体设备厂水浴箱 东莞市创瑞工业试验设备有限公司PCR扩增仪 Eppendorf公司紫外分光光度仪DUR640BECKMAN公司普通冰箱 青岛海尔超低温冰箱TOKA高速台式离心机TGL-16B超速低温离心机 HERAEVS微波炉 格兰仕制冰机 AFIO ScotsmanABl3130XL测序仪 赛维亚(天津)科技发展有限公司114常用试剂配制美国美国美国中国中国美国美国中国日本中国德国中国英国中国平衡盐容液：1449Na2HP04，89NaCl，029KCl，0249KH2P04。溶于800ml ddU20中，用HCI调pH值至74，定容到1L，1034105Pa灭菌20min。病毒RNA裂解液：终浓度为异硫氰酸胍4M，十二烷基肌氨酸钠05，柠檬酸钠25retoolL，糖原20ug，B巯基乙醇01mmolL，。1TAE：Tris碱4849，硼酸1142ml，EDTA(05molI)20ml，加水稀释成1000ml配成10TAE。50ml 10TAE加水稀释至500ml配成l匹溶液。2琼脂糖凝胶：琼脂糖粉O49，加入20ml配制的1 XTAE微波炉中加热煮沸并摇匀3次，加入2ul核酸染料GELVIEW,摇匀冷却后倒入制胶板中。12实验方法121引物设计根据肠道病毒序列，在肠道病毒5端非编码区设计一对通用引物【忉。根据Ev71病毒VPl基因段设计特异性引物1s-19。见表11，以上均由由上海天昊遗传分析中心完成。青岛大学硕士学位论文表11 EV71通用引物和特异引物122标本的处理(1)手足口病患儿入院后取血、新鲜大便，合并脑炎患儿经家属同意后行腰椎穿刺术取脑脊液。标本70(2保存。(2)脑脊液可直接用于病毒RNA的提取。(3)粪便的处理：取49的粪便加16mlHanks平衡盐容液中制成悬液：强烈振荡30min；以1000rmin4C离心30min；弃沉淀取上清液，再次50000rrain离心30mlm弃上清，将沉淀重新悬浮于培养液后再重复步骤；用450rim的微孔滤膜过滤；加入青链复合抗生素，使浓度为100Uml，412过夜；将病毒液20u1分装于EP管中，70(2冰箱保存。123病毒RNA的提取采用改良的酸性胍酚氯仿一步法(AGPC)提取病毒RNA。异丙醇、75乙醇放入20(2冰箱中预冷。取100ul大便稀液，加入150ul裂解液。充分混匀，室温静止lO分钟，使其充分裂解。加入250u已预冷的异丙醇，静置5分钟沉淀RNA。室温下12000rrain离心10 rain。4第一章材料和方法弃去上清，已预冷75乙醇漂洗一次。室温下12000rrain离心10 rain。真空泵抽戏或室温晾干，沉淀物加入10ul超纯水溶解备用。纯度及含量：提取后用紫外线分光光度计测吸光度为260和280的值，计算A260与4280的比值均在约18左右，并计算RNA的含量。计算RNA含量，公式：260nmOD值稀释倍数401000=鼢渔含量(ugu1)提取的RNA立即逆转录或70冰箱保存。124病毒RNA的逆转录及PCR扩增(1)使用Qiagen公司的onestep试剂盒，操作过程按照说明书进行。为保证反应的准确性，每次临床