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miRNA708在儿童普通急性淋巴细胞性白血病中的表达及调控机制的研究miRNA708在儿童普通急性淋巴细胞性白血病中的表达及调控机制的研究 -- 260 元

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分类号R725.5密级公开单位代码10422学号201013243⑧∥篓办誊硕士学位论文论文题目miRNA.708在儿童普通急性淋巴细胞性白血病中的表达及调控机制的研究TheExpressionandRegulatoryMechanismofmiRNA708inChildhoodCommonprecursorBcellAcuteLymphoblasticLeukemia合作导师2013年5月1日原创性声明IIIIIIIIIIIIIIIIIUIIIY2328633本人郑重声明所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名扭日期少f多年j闫J旧关于学位论文使用授权的声明本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。保密论文在解密后应遵守此规定论文作者签名鹰望导师签名兰堡竺日期竺竺圭±1、丫.,l、目录中文摘要1Abstract..3符号说明5引言7第一部分儿童普N2,性淋巴细胞性白血病中miRNAs的差异性表达.91.1材料与方法..91.2结果111.3讨论..12第二部分miRNA.708直接调控靶基因的预测及验证152.1材料与方法152.2结果222.3讨论..23第三部分miRNA.708与靶基因CNTFR结合位点的验证263.1材料与方法263.2结果283.3讨论..28结{仑30附图表..32参考文献..40综j苤45综述的参考文献..50致谢..53在学期间发表文章..54CONTENTABSTRACTfChinese.......................1ABSTRACT.3SymbolicDescription.......................5Introduction.............................7Part1TheexpressionofmiRNAsinpediatriccommonprecursorBcellacutelymphoblasticleukemia...................91.1MaterialsandMethods.......................91.2Results............................111.3Discussion.12Part2ThepredictionandverificationoftargetgenesbindingtomiRNA一708..152.1MaterialsandMethodsl52.2Results.12.3Discussion.23Part3RepressionofCNTFRbymiR.708viaaconservedbindingsiteinthe37UTRofCNTFRmRNA..263.1MaterialsandMethods263.2Results.283.3Discussion.28Conclusion.30FiguresandTables.32References..40Review....45Referencesinreview.50Acknowledgments..53Publication.542山东大学硕士学位论文miRNA.708在儿童普通急性淋巴细胞性白血病中的表达及调控机制的研究研究生李雪导师鞠秀丽教授专业儿科学中文摘要背景急性淋巴细胞性白血病ALL是最常见的儿童恶性血液肿瘤,约占儿童急性白血病的75%~80%。多数ALL患者通过规范治疗可以达到长期无病生存,然而仍有一部分ALL患儿,特别是高危型患儿,复发或难以达到缓解。微小RNAmiRNA与白血病的发生、发展、临床表现和预后有密切联系,在其发生中起促癌或抑癌的作用,在靶向分子治疗和预后评价方面具有良好的应用前旦尿。目的检测儿童普通急性淋巴细胞性白血病common.ALL中miRNA的差异性表达,进一步研究差异性表达的miRNA.708调控的靶基因。方法研究对象为34例普通急性淋巴细胞性白血病患儿及5例行骨骼矫正手术并排除肿瘤和血液系统疾病患儿的骨髓样本,采用中国儿童血液病研究组2008CCLG.2008方案对其进行治疗及临床危险度分型。1.应用miRNA微阵列基因芯片技术筛选common.ALL患儿样本中miRNA的差异性表达,应用茎环实时定量聚合酶链反应stem.100pRTPCR技术验证差异性表达的miRNA。2.应用生物信息学方法预测miRNA.708调控的靶基因,利用双报告基因检测技术鉴定miRNA.708调控的靶基因,通过实时定量聚合酶链反应ImPCR和蛋白质印迹Westernblot等方法在淋巴细胞和白血病细胞中进一步验证miRNA.708是否调控靶基因的表达。1山东大学硕士学位论文3.利用基因点突变和双报告基因检测技术验证miRNA.708与CNTFR的结合位点。结果1.miRNA微阵列芯片结果示同正常对照组相比,在儿童普通急性淋巴细胞性白血病样本中检测的2006个miRNA中,miR一708、miR.210、miR.181b、miR.345、miR.324.5p、miR.125b、miR一324.3p和miR一106b表达显著上调miR。23、miR.27a和miR.23b表达显著下调。茎环实时定量PCR进一步验证示,miR.708、miR.210和miR.181b表达量为16.886±16.854、5.710±4.652及9.789±1.178,与正常对照组1.872±0.339、1.276±0.531及1.005±0.080相比表达均上调,差异均有统计学意义P0.05。miR一27a和miR.345表达量为0.524±0.085及O.675±0.086,与正常对照组1.123±0.066及1.204±O.143相比均下调,差异均有统计学意义P0.05。miR.708和miR.181b在高危组中表达水平为44.990±6.379和12.980_1.889,高于中危组和标危组PO.05。2.通过生物信息学技术预测miR.708的靶基因,筛选出CNTFR、NNAT和GNGl2三个预测靶基因进行验证。双报告基因检测结果示转染miR.708模拟物miR.708mimics的人胚胎肾239细胞中CNTFR、NNAT和GNGl2的表达水平均下降,而转染miR.708抑制剂其表达升高。在普通急性淋巴细胞白血病样本中,CNTFR、NNAT的mRNA表达水平较对照组相比显著下降,差异具有统计学意义PO.05。在Jurkat细胞中,同阴性对照组相比,转染miR.708mimics组CNTFR、NNAT和GNGl2蛋白水平均有不同程度的下降,而转染miR.708抑制剂miR.708inhibitor组CNTFR、NNAT和GNGl2蛋白水平表达有不同程度的升高。3.通过点突变技术和双报告基因检测验证结合位点,结果示miR.708与CNTFR的结合区域位于CNTFRmRNA3UTR端394400bp。结论miRNAs的差异性表达在儿童普通型急性淋巴细胞性白血病发生发展过程中及其不同的临床分型的发生机制中存在重要的作用,其中miRNA一708是高危型common.ALL重要的调控因子。miRNA.708在白血病细胞中通过结合靶基因CNTFR、NNAT和GNGl2的3UTR端,降低靶基因的表达水平。关键词白血病,淋巴细胞,急性微小RNA微阵列分析靶基因山东大学硕士学位论文TheExpressionandRegulatoryMechanismofmiRNA708inChildhoodAcuteLymphoblasticLeukemiaPostgraduateLiXueSupervisorProf.JuXiuliMajorPediatricHematologyABSTRACTBackgroundThecriticalfunctionofmiRNAsinthepathogenesisandprognosisofhematopoieticcancerhasbecomeincreasinglyapparent.However,onlyafewmiRNAshavebeenreportedtobealteredinacutelymphocyticleukemiaALL.Bonemarrowsamplesn34wereobtainedfromchildrennewlydiagnosedwithcommonprecursorBcellALL.Thepatientswerediagnosedusingmorphological,immunological,cytogenetic,andmolecularstandards,andtreatedaccordingtotheChineseChildrenSLeukemiaGroup2008CCLG2008protoc01.Ascontrols,bonemarrowwasobtainedfromconsentingindividualsn25whohadsurgeryforskeletondeformitywithouttumororantecedentprimaryhematologicabnormalities.1.TodiscoveraberrantlyexpressedmiRNAsinpediatricBcellALL,ourstudyemployedgenomewidemiRNAmicroarrayanalysisandstemloopRTPCRtoexaminecommonprecursorBcellALLsamples.2.ThetargetgenesofmiRNA708werethenidentifiedandverifiedbybioinformaticssoftware,dualluciferasereporterassay,RTPCR,andWestemblot.3.PointmutationanddualluciferasereporterassaywereperformedtoverifiedthebindingsitebetweenmiR708andCNTFR.Results山东大学硕士学位论文1.SignificantupregulationofmiR708,miR210,andmiR181b,anddownregulationofmiR345andmiR27awereobservedincommonprecursorBcellALLcommonALLsamplespO.05.Inaddition,elevatedexpressionofmiR708andmiR181bwerefoundinhighriskcommonALLcomparedtostandardandintermediateones.2.miR708inhibitedluciferasereporteractivitybybindingtothe3translatedregions3UTRsofCNTFR,NNAT,andGNG12mRNAinHEK293celllineandsuppressedtheproteinlevelsofCNTFR,NNAT,andGNG12inJurkatcells.Inaddition,mRNAlevelsofCNTFRandNNAT,butnotofGNG12,werefoundtobedownregulatedinhighriskcommonALLsamples.3.MutationalanalysisrevealedthatmiR708bindstothe394bpto400bpsequenceregionofthe3UTRofCNTFRmRNA.specificmiRNAexpreesionplayanimportantroleinthepmhogenesisanddevelopingofc11ildhoodcommonprecursorBcellALL.TheexpressionlevelofmiR708reflectsdifferencesamongtheclinicaltypesofcommonprecursorBcellALL,andregulatesthepathogenesisandprogressionofcommonprecursorBcellALLbytargetingCNTFR,NNAT,andGNGl2.KeywordsLeukemia,lymphoblastic,acutemiRNAsmicroarryanalysisTargetgene4符号英文全称ALLmiRNA,miRcommon.ALLCCLG山东大学硕士学位论文符号说明中文全称acutelymphoblasticleukemia急性淋巴细胞性白血病miRNA微小核糖核酸commonprecusurBcellacute普通急性淋巴细胞性白血lymphocyticleukemia病ChineseChildrenSLeukimia中国儿童血液病研究组GroupstemloopRTPCRstemlooprealtimeWTHEK293细胞3.UTRCNTFRPBSFBSRISCLIFmiRNANCWTceRNAsAML茎环实时荧光定量聚合酶quantitativepolymerasechain链反应reaction阮stemblot蛋白质印迹humanembryonickidney293人胚胎肾293细胞cells3untranscriptionalregion37端非转录区域ciliaryneurotrophicfactor抗睫状神经营养因子受体receptorphosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液fetalbovineserum胎牛血清RNA.inducedsilencingRNA诱导的沉默复合体complexleukemiainhibitoryfactor白血病抑制因子miRNA.negativecontrol微小RNA阴性对照Widetype野生型CompetitiveendogenousRNAs竞争性内源性RNAacutemyeloblasticleukemia急性粒细胞白血病5
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vyyolyg827上传于2014-03-19

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