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文档简介

硕士学位论文 论文题目 NF- B 圈套策略对神经母细胞瘤细胞 增殖及凋亡的影响 研究生姓名 黄思红 指导教师姓名 周 云 教授 专 业 名 称 儿科学 研 究 方 向 泌尿外科 论文提交日期 2013 年 3 月 NF- B 圈套策略对神经母细胞瘤细胞增殖及凋亡的影响 中文摘要 I 苏州大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人郑重声明 :所提交的 学位论文是本人在导师指导下 ,独立 进行研究工作 所 取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外,本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果 ,也不含为获得苏州大学或其 他教育机构的学位证书而使用过的材料 。对本文的研究做出贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明引起的 法律责任 。 学位论文作者签名: 黄思红 日期: 2013-05-27 中文摘要 NF- B圈套策略对神经母细胞瘤细胞增殖及凋亡的影响 II 学位论文使用授权声明 本 人 完全了解 苏州大学 有关 收集 、 保存和 使用学位论文的规定,即:学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学 有权向 国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研究所(含万方数据电子出版社)、中 国学术期刊(光盘版)电子杂志社 送交 本学位 论文的复印件和电子 文档 ,允许论文被查阅和借阅 ,可以 采用影印、缩印或 其他 复制手段保存和汇编学位论文 ,可以将 学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。 涉密文件 本论文属于 在 年 月 解密后适用本规定。 非涉密文件 (请在以上方框内打 “”) 论文作者签名: 黄思红 日期: 2013-05-27 指导老师签名: 周云 日期: 2013-05-27 NF- B 圈套策略对神经母细胞瘤细胞增殖及凋亡的影响 中文摘要 III NF- B圈套 策略对神经母细胞瘤细胞增殖及 凋亡的 影响 中文摘要 目的 : 本 实 验 研 究 环 状 哑 铃 形 圈 套 寡 核 苷 酸 ( Circular dumbbell oligodeoxynucleotides, CD-ODN) 转染对 核因子 -B ( Nuclear factor kappa B, NF-B)活性和神经母细胞瘤 SK-N-SH 细胞增殖及 细胞 凋亡的影响, 进一步检测凋亡抑制蛋白 Survivin 的表达情况, 探索神经母细胞瘤基因治疗的新 靶点 。 方法 : 电 穿孔 法将 CD-ODN 转 染神经母细胞瘤 SK-N-SH 细胞 系 ,以未转染 基因 的SK-N-SH 细胞为空白对照 。本实验大致分三个部分: 1、转染 CD-ODN 后 NF-B 活性的变化: 免疫 激光共聚焦显微镜下观察细胞内 NF-B 核转位情况变化; 酶联免疫分析法( Enzyme-linked immunoassay, ELISA)检测 细胞内 NF-B p65 表达的 变化 。2、转染 CD-ODN 后 SK-N-SH 细胞生物活性的变化: 四甲基偶氮唑蓝比色法 (methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)检测 转染 CD-ODN 后 SK-N-SH 细胞体外增殖活性的变化;流式细胞仪 技术 ( Flow cytometry, FCM) 检测 转染 CD-ODN 对 SK-N-SH 细胞凋亡的影响。 3、 NF-B 活性抑制后凋亡抑制蛋白 Survivin 的表达变化: 蛋白免疫印迹法( Western blotting) 检测 NF-B活性抑制后凋亡抑制蛋白 Survivin 的表达 情况,初步研究 NF-B与 Survivin 的关系 。 每个实验重复三次。 采用统计学方法分析实验数据。 结果 : 免疫激光共聚焦显微镜观察 显示 转染 CD-ODN 组 SK-N-SH 细胞 细胞核 荧光较 空白 对照组 明显减 弱; NF-B p65 ELISA 结果 显示转染 24、 48、 72h 后 转染 CD-ODN组 SK-N-SH 细胞吸光度 值 A 明显低于 空白 对照组( p0.05) ,表明转染 CD-ODN 后SK-N-SH 细胞 NF-B p65 蛋白表达下降, NF-B活性受到抑制 。 MTT 检测细胞增殖力,结果 发现, 转染 CD-ODN 组 细胞 MTT 曲线幅度更小, 以正常 SK-N-SH 细胞为对照, 转染后 24、 48、 72h 的细胞生长抑制率分别为 12%、 29%、 42%( p0.05);流式细胞仪 Annexin V/PI 双染色法检测 结果 发现 转染 CD-ODN 48h 后, 转染 CD-ODN中文摘要 NF- B圈套策略对神经母细胞瘤细胞增殖及凋亡的影响 IV 细胞组 和 空白对照组 的细胞凋亡率分别为 ( 23.010.71) %和 (15.840.36)%( p 0.05),转染 CD-ODN 后细胞 早期凋亡率 增加 。 Western blotting 结果发现 与正常对照组比较,转染 CD-ODN 组 SK-N-SH 细胞凋亡抑制蛋白生存素( Survivin)的表达明显下降。 结 论 : CD-ODN 能 抑制 神经母细胞瘤 SK-N-SH 细胞内 NF-B活性 ,抑制 肿瘤 细胞增殖 ,诱导 神经母细胞瘤肿瘤 细胞早期 凋亡 ,并且下调凋亡抑制蛋白 Survivin 的基因表达 。这 些 实验结果 表 明 , CD-ODN 可能通过阻断 NF-B 信号 传 导通路来诱导神经母细胞瘤细胞凋亡,为以 NF-B为靶点的 神经母细胞瘤 基因治疗提供 理论依据 。 关键词 : 核因子 B;神经母细胞瘤;圈套 寡核苷酸 ; 生存素 作 者 :黄思红 指导老师 :周 云 教授 Effect of nuclear factor-kappa B “decoy strategy” on proliferation and apoptosis of neuroblastoma cell Abstract V Effect of nuclear factor-kappa B “ decoy strategy” on proliferation and apoptosis of neuroblastoma cell Abstract Object To study the effect of nuclear factor kappaB (NF-B) circular dumbbell decoy oligodeoxynucleotides (CD-ODN) transfection on the activation of NF-B and proliferation and apoptosis of human neuroblastoma cell line SK-N-SH, and to explore potential targets for neuroblastoma gene therapy. Methods CD-ODN was transfected into human neuroblastoma cell line SK-N-SH by electrotransformation, and blank SK-N-SH cells were used as control groups. NF-B nuclear translocation was studied with laser confocal microsopy. Enzyme-linked immunoassay (ELISA) were used to detect NF-B DNA binding activity. Cell proliferation ability was measured by MTT. Flow cytometry( FCM) was applied to analyze the apoptosis of SK-N-SH. Survivin expression was detected by western blotting. All tests were repeated for three times. The data were analyzed by statistics. Results It was confirmed by laser confocal microsopy that the phenomenon of NF-B nuclear translocation was less obvious in SK-N-SH transfected CD-ODN. Enzyme-linked immunoassay (ELISA) showed the obsorbane of SK-N-SH transfected CD-ODN significantly decreased , compared with those of control groups,at 24th, 48th, and 72th hours( p0.05) .Cell proliferation was determined with MTT assay,and lower rates of MTT reduction was observed in SK-N-SH transfected CD-ODN groups than control groups, and the cell growth inhibition rate was 12%, 29% and 42%, respectively (p 0.05) at 24th, 48th, and 72th hours.Flow cytometry Annexin V/PI double-staining assay showed apoptosis rates of SK-N-SH transfected CD-ODN and control groups were (23.10.71)% and (15.840.36)% (p0.05), respectively. Early apoptosis rate was increased in transfected CD-ODN groups. Western blotting analysis showed that survivin expression was decreased in SK-N-SH cells treated with CD-ODN compared with the control groups. Abstract Effect of nuclear factor-kappa B “decoy strategy” on proliferation and apoptosis of neuroblastoma cell VI Conclusion Our results showed NF-B circular dumbbell decoy oligodeoxynucleotides (CD-ODN) can efficiently suppress DNA binding activity of NF-B, inhibit proliferation ability of human neuroblastoma cells and may induce apoptosis of human neuroblastoma cells.These experimental results indicate the CD-ODN may inhibit the occurrence and development of tumor by blocking the NF-B signaling pathway, which may be provide theoretical basis for the neuroblastoma gene therapy. Key words nuclear factor-kappaB (NF-B); neuroblastoma; decoy oligodeoxynucleotides; Survivin Written by Huang SH Supervised by Prof. Zhou Y 目 录 引 言 . 1 材料和方法 . 3 结 果 . 12 讨 论 . 16 结 论 . 20 参考文献 . 21 综 述 . 24 缩略词汇一览表 . 37 攻读学位期间公开发表的论文 . 39 致 谢 . 40 NF- B 圈套策略对神经母细胞瘤细胞增殖及凋亡的影响 引 言 1 引 言 神经母细胞瘤( Neuroblastoma, NB)是儿童最常见的颅外实体性恶性肿瘤,多见于婴幼儿,中位月龄 为 17月 1。根据流行病学统计, NB的年发病率约为 0.3/10万5.5/10万 2。 NB的治疗手段主要是以外科手术结合 放、化疗的综合治疗。但该病临床表现多种多样,早期症状不典型,易发生误诊,多数患儿诊断时多已发展为 III、IV 期,治疗效果及预后均较差,五年生存率 40%3。外科手术对早期实体瘤的患者较为有效 ,对晚期或出现远处转移灶的患者则达不到治疗目的,放疗和化疗对 晚期患者有一定的效果,但在过去的二十年,通过研究大量放化疗方案,其五年生存率仅维持在 30%左右 4,而且放化疗副作用 极大,对患儿生理及心理发育有一定影响 。因此,针对神经母细胞瘤的 基因 靶向治疗成为 了近几年来研究热点。 基因靶向治疗是指在细胞分子水平上,针对已经明确或可疑的致癌位点 (瘤细胞内部的蛋白分子或基因片段 )设计相应的治疗药物,药

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