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RNA沉默CXCR4基因表达及对共培养Jurkat细胞生物学行为的影响RNA沉默CXCR4基因表达及对共培养Jurkat细胞生物学行为的影响 -- 260 元

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1分类号密级UDC编号硕士学位论文RNA沉默CXCR4基因表达及对共培养Jurkat细胞生物学行为的影响研究生姓名王艳指导教师姓名、职称殷小成副教授学科、专业名称儿科学研究方向小儿血液病学2013年4月2南华大学学位论文原创性声明本人声明,所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了论文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得南华大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名年月日南华大学学位论文版权使用授权书本学位论文是本人在南华大学攻读(博/硕)士学位期间在导师指导下完成的学位论文。本论文的研究成果归南华大学所有,本论文的研究内容不得以其它单位的名义发表。本人同意南华大学有关保留、使用学位论文的规定,即学校有权保留学位论文,允许学位论文被查阅和借阅学校可以公布学位论文的全部或部分内容,可以采用复印、缩印或其它手段保留学位论文学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。同意学校将论文加入中国优秀博硕士学位论文全文数据库,并按中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程规定享受相关权益。同意授权中国科学信息技术研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库,并通过网络向社会公众提供信息服务。对于涉密的学位论文,解密后适用该授权。作者签名导师签名年月日年月日3目录英文缩写一览表„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„1中文摘要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„2英文摘要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„4正文前言„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„6第一部分小干扰RNA对Jurkat细胞CXCR4基因表达的影响„„„9材料和方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„9结果„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„15讨论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„16第二部分RNA干扰沉默CXCR4基因对Jurkat细胞周期和凋亡的影响材料和方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„19结果„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„20讨论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„22全文小结„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„26参考文献前言参考文献„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„27第一部分参考文献„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„29第二部分参考文献„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„30综述„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„32研究生学习期间完成的论文„„„„„„„„„„„„„„„„„„„39致谢„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„401英文缩写一览表缩写英文全称中文全称ALLacutelymphoblasticleukemia急性淋巴细胞白血病AMLAcutemyeloidleukemia急性髓性白血病bpbasepair碱基对cDNAcomplementaryDNA互补DNAdNTPdeoynucleosidetriphosphate脱氧三磷酸核苷酸BMSCsbonemarrowstromalcells骨髓基质细胞SDF1stromalcellderivedfactor1基质细胞衍生因子一1RNAiRNAinterferenceRNA干扰PTGSposttranscriptionalgenesilencing转录后基因沉默dsRNAdoublestrandedRNA双链RNAsiRNAshortinterferingRNA小干扰RNACXCR4CXCchemakinerecepter4CXC亚家族趋化因子受体一4BCL2Bcelllymphomaleukemia2geneB细胞淋巴瘤白血病基因2DMSOdimathylsulfoxide二甲亚砜PIpropidiumiodide碘化丙锭RTPCRreversetranscriptasepolymerasechainreaction逆转录多聚酶链反应FACSfluoresceinactivatedcellsorter流式细胞术2RNA沉默CXCR4基因表达及对共培养Jurkat细胞生物学行为的影响摘要目的急性淋巴性白血病(Acutelymphoblasticleukemia,ALL)是儿童最常见的恶性肿瘤之一,白血病细胞可广泛浸润骨骼及肝、脾、淋巴结等髓外器官,髓外白血病易导致骨髓复发,是治疗失败的主要原因,因而髓外白血病的防治是ALL患儿获得长期生存的关键之一。趋化因子CXCR4是基质细胞衍生因子(stromalcellderivedfactor,SDF1)受体,SDF1是主要由骨髓基质细胞产生的趋化因子,两者特异地结合,在造血调节中起重要作用。SDF1/CXCR4不仅参与维持正常造血细胞的存活和增殖,同时与恶性细胞增殖以及在血液、骨髓、淋巴结的浸润密切相关。RNA干扰(RNAi)作为一种新的基因阻断技术,具有特异的、有效的基因沉默效应,能够简单、高效阻抑特定基因表达,已广泛用于抗肿瘤的基因治疗。Jurkat细胞系淋巴系起源的白血病细胞株,运用RNAi技术,设计针对CXCR4特异性的siRNA转染Jurkat细胞,采用RTPCR观察RNAi抑制CXCR4基因表达,流式细胞术检测Jurkat细胞周期和细胞凋亡率。RNAi诱导Jurkat细胞发生凋亡和细胞周期阻滞,从而抑制细胞的增殖。用以探索ALL防治的新方法,为ALL治疗提供理论依据。方法根据CXCR4cDNA符合特征的靶序列,设计并化学合成相关的siRNA。实验分三组空白对照组A组Control(不加入CXCR4siRNA,NonsilencingdsRNA和DMRIEC),B组阴性对照组NonsilencingdsRNA(加入NonsilencingdsRNA和DMRIEC),C组目的组CXCR4siRNA(加入CXCR4siRNA和DMRIEC)。配成80nM的siRNA溶液。通过脂质体DMRIEC介导siRNA转染Jurkat细胞,48h后RTPCR检测CXCR4基因表达水平,运用流式细胞术检测细胞周期分布和细胞的凋亡情况。结果两对照组间比较差异无统计学意义(P0.05),目的组与两对照组比较,差异均有统计学意义(P0.01)。与空白对照组相比,转染CXCR4siRNA的Jurkat细胞的CXCR4mRNA表达水平明显下降(56.9±1.4vs68.3±2.4),G0/G1期细胞比例增加(35.9±2.0vs18.1±1.3),G2/M期和S期细胞比例相应下降(20.1±1.1vs27.7±1.544.4±3.0vs54.2±2.6),凋亡细胞明显增加20.7±1.7vs2.98±0.3。3结论1、利用RNAi技术能够特异性抑制Jurkat细胞的CXCR4基因的表达。2、CXCR4基因沉默后,能抑制Jurkat细胞增殖、促进凋亡。关键词小干扰RNAJurkat细胞趋化因子CXCR4基因表达逆转录多聚酶链反应4EffectsofBiologicalBehaviourofRNASilencingofCXCR4ExpressiononCoculturedJurkatCellAbstractObjectiveAcutelymphoblasticleukemia(ALL)isoneofthemostfrequentmalignanttumourofpaediatrics.Leukemiacellcangenerallyinfiltrateskeleton,liver,spleen,lymphadenandsoon.AcriticalthingtoaffectchildrenwithALLonobtaininglongtermsurvivalispreventionandcureonhepermarrowleukemia.ChemotaticfactorCXCR4isligandofstromalcellderivedfactorSDF1,whichthecombitionoftwofactorscanplayanimportpartintheregulationofhematopoisissystema.SDF1/CXCR4axiscannotonlyretainsurvivalandproliferationonnormalhematopoieticcell,butalsoonmalignantcellproliferationandinfiltrateblood,bonemarrow,lemphaden.RNAinterferenceRNAi,anoriginaltechniqueongeneinterruption,cansilmplyandaffectivelydepressdefinitegeneexpressionasaspecificandultilitysilencingeffect,areadygenerallyusedonantineoplasticgenetherapy.Jurkatcelllineisakindofleukemiacelllineoriginatingfromgeneticoflymphaticsystem.ThespecificsiRNAofCXCR4plasmidvectorwasconstructedandthentransfectedintotheculturedJurkatcelllinebyusingRNAitechnique.ReversetranscriptionpolymerasechainreactionRTPCRwasusedtodetecttheexpressionofCXCR4mRNArespectively.Cellcycledistributionandcellapoptosisweredeterminedbyflowcytometry.CXCR4silencebysiRNAcaninhibitthegrowthofJurkatcellsthroughinducingapoposisandcellcyclearrest.Inshort,itoffersanewapproachtopreventionandcureofALL.Methods.ThespecificsiRNAwasdesignedandchemicallysynthesizedevidencewithcharacteristictargetsequenceofCXCR4cDNA.TheJurkatcelllineweredividedthreegroupsGroupAblankgroupnotaddingCXCR4siRNA,NonsilencingdsRNAandDMRIEC,GroupBnegativecontrolgroupaddingNonsilencingdsRNAandDMRIEC,GroupCpurposegroupCXCR4siRNAandDMRIEC.Thesolutionwasdilutedintoconcentrationof80nM.ThesiRNAofCXCR4wastransfectedintothecultructedJurkatcelllinewithDMRIEC.After48hours,reversetranscriptionpolymerasechainreactionRTPCR5wereusedtodetecttheexpressionofCXCR4mRNArespectively.Cellcycledistributionandcellapoptosisweredeterminedbyflowcytometry.ResultsTheblankgroupandnegativecontrolgroupofcomparisondifferencewasnotstatisticallysignificant,whichpurposegroupcomparisonwithwasstatisticallysignificant.Incomparisonwiththoseinpurposeandblankgroup,theleversofCXCR4mRNAweredecreasedhighly56.9±1.4vs68.3±2.4.ThepercentageofapoptosiscellsinCXCR4groupwassignificantlyhigherthanthatinnegativecontrolgroup20.7±1.7vs2.98±0.3andthecellpercentagewereincreasedatG0/G135.9±2.0vs18.1±1.3,butdecreasedatG2/MphaseandSphase20.1±1.1vs27.7±1.544.4±3.0vs54.2±2.6.Conclusions1.RNAitechniquewasfoundtohaveobviousinhibitoryeffectonCXCR4geneofJurkatcellandtheleversofCXCR4mRNAofJurkatcellwasfoundtoreduceutility.2.CXCR4silencebythespecificsiRNAcaninhibitthegrowthofJurkatcellsthroughinducingapoposisandcellcyclearrest.KeyWordsshortinterferingRNAJurkatcellCXCchemakinerecepter4GeneexpressionReversetranscriptionpolymerasechainreactionPostgraduateWangYanpediatricsDirectedbyProfessorYinXiaocheng6前言急性淋巴细胞白血病(Acutelymphoblasticleukemia,ALL)是儿童最常见的恶性肿瘤之一,发病率高达4~5/10万,每年全国新增患者15,000~20,000人。给我国人民生活和健康造成巨大的威胁,给社会和家庭带来巨大压力。白血病细胞可广泛浸润骨骼及肝、脾、淋巴结等髓外器官,髓外白血病易导致骨髓复发,是治疗失败的主要原因,因而髓外白血病的防治是ALL患儿获得长期生存的关键之一。因此通过研究白血病髓外浸润的基本生物特征,建立有效的诊断及阻遏手段具有重大的临床实用价值。Muller及其同事首先报道了在一个小鼠模型中趋化因子及其受体与人类乳腺癌细胞淋巴结转移的关系1,近年来,趋化因子及其受体在恶性肿瘤器官特异性转移中的作用已引起越来越多的研究人员的重视,成为研究热点之一。趋化因子是由不同类型细胞分泌的能使细胞发生趋化运动的低分子量(812KD)的细胞因子,在正常和非正常生理情况下都发挥其重要作用。而趋化因子受体属七次跨膜G蛋白偶联受体超家族,趋化因子通过与G蛋白的级联活化信号,引起靶细胞支架重构,牢固地粘附于内皮细胞和定向迁移,决定靶细胞的移动及方向。在肿瘤趋化因子发挥各种作用,包括控制白细胞浸润至肿瘤,调节肿瘤相关的血管生成,激活宿主对肿瘤的特异性免疫应答,以自分泌或旁分泌方式刺激肿瘤细胞增殖,控制肿瘤细胞运动等2。目前对于趋化因子及其受体和肿瘤转移的关系研究较多的是CXCR4/SDF1,基质细胞衍生因子1(stromalcellderibedfactor1是骨髓基质细胞产生的CXC类趋化蛋白,系统命名为CXCL12CXCchemskineligand12,是已知唯一能与受体CXCR4结合并能激活的天然趋化因子。无论其配体存在与否,CXCR4都以二聚体的形式稳定存在于完整的细胞膜上,趋化因子SDF1CXCL12编码它的基因位于人类染色体10q11.1。CXCR4是趋化因子SDF1/CXCL12唯一受体,是一个具有7次跨膜受体的G蛋白偶联受体,具有类似于IL4受体的结构,因其顺序与其它CXC趋化因子受体基因类似,故称其为CXCR4。编码CXCR4的基因定位于人类染色体2q21,是HIV1的主要协同受体35。SDF1首先在小鼠骨髓基质细胞分泌的细胞因子中发现,因其氨基酸序列含有4个保守的半胱氨酸及N端含有2个半胱氨酸,将其归为趋化因子CXC亚家族,命名为CXCL126。SDF1和CXCR4广泛表达于各种细胞和组织中,包括免疫细胞、脑、心脏、肾、肺、脾,在免疫系统、循环系统及中枢神经系统的发育中起着至关重要的作用。
编号:201403192117410462    大小:1.88MB    格式:PDF    上传时间:2014-03-19
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rna 沉默 默然 cxcr4 基因 表达 对于 培养 培育 jurkat 细胞生物学 行为 行动 影响
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vyyolyg827上传于2014-03-19

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