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文档简介

1 分类号 密级 U D C 编号 硕士学位论文 RNA 沉默 CXCR4基因表达及对共培养Jurkat 细胞生物学行为的影响 研 究 生 姓 名 : 王 艳 指导教师姓名、职称: 殷小成 副教授 学科、专业名称: 儿科学 研究方向: 小儿 血液病学 2013 年 4 月 2 南华大学学位论文原创性声明 本人声明,所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了论文中特别加以标注和致 谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得南华大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 作者签名: 年 月 日 南华大学学位论文版权使用授权书 本学位论文是本人在南华大学攻读 (博 /硕)士学位期间在导师指导下完成的学位论文。本论文的研究成果归南华大学所有,本论文的研究内容不得以其它单 位的名义发表。本人同意南华大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有权保留学位论文,允许学位论文被查阅和借阅;学校可以公布学位论文的全部或部分内容,可以采用复印、缩印或其它手段保留学位论文;学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。同意学校将论文加入中国优秀博硕士学位论文全文数据库,并按中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程规定享受相关权益。同意授权中国科学信息技术研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库,并通过网络向社会公众提供信息服务。对于涉密的学位论文,解密后适用该授权。 作者签名: 导师签名: 年 月 日 年 月 日 3 目 录 英文 缩写一览表 1 中文摘要 2 英文摘要 4 正文 前言 6 第一部分: 小干扰 RNA 对 Jurkat 细胞 CXCR4 基因表达的影响 9 材料和方法 9 结果 15 讨论 16 第二部分: RNA 干扰沉默 CXCR4 基因对 Jurkat 细胞周期和凋亡的影响 材料和方法 19 结果 20 讨论 22 全文小结 26 参考文献 前言参考文献 27 第一部分参考文献 29 第二部分参考文献 30 综述 32 研究生学习期间完成的论文 39 致谢 40 1 英文缩写一览表 缩写 英文全称 中文全称 ALL acute lymphoblastic leukemia 急性淋巴细胞白血病 AML Acute myeloid leukemia 急性髓性白血病 bp base pair 碱基对 cDNA complementary DNA 互补 DNA dNTP deoynucleoside triphosphate 脱氧三磷酸核苷酸 BMSCs bone marrow stromal cells 骨髓基质细胞 SDF-1 stromal cell derived factor-1 基质细胞衍生因子一 1 RNAi RNA interference RNA 干扰 PTGS post-transcriptional gene silencing 转录后基因沉默 dsRNA double-stranded RNA 双链 RNA siRNA short-interfering RNA 小干扰 RNA CXCR4 CXC chemakine recepter-4 CXC 亚家族趋化因子受体一 4 BCL-2 B-cell lymphoma-leukemia-2 gene B 细胞淋巴瘤白血病基因 2 DMSO dimathyl sulfoxide 二甲亚 砜 PI propidium iodide 碘化丙锭 RT-PCR reverse transcriptase-polymerase chain reaction 逆转录多聚酶链反应 FACS fluorescein-activated cell sorter 流式细胞术 2 RNA 沉默 CXCR4基因表达及对共培养 Jurkat 细胞 生物学行为的影响 摘要 目的 : 急性淋巴性白血病( Acute lymphoblastic leukemia ,ALL)是儿 童 最常见的恶性肿瘤之一,白血病细胞可广泛浸润骨骼及肝、脾、淋巴结等髓外器官,髓外白血病易导致骨髓复发, 是 治疗失败的主要原因,因而髓外白血病的防治是 ALL 患儿获得长期生存的关键之一。趋化因子 CXCR4 是基质细胞衍生因子( stromal cell derived factor,SDF-1) 受 体, SDF-1 是主要由骨髓基质细胞产生的趋化因子,两者特异地结合,在造血调节中起重要作用。 SDF-1 CXCR4 不仅参与维持正常造血细胞的存活和增殖,同时与恶性细胞增殖以及在血液、骨髓、淋巴结的浸润密切相关 。 RNA 干扰( RNAi)作为一种新的基因阻断技术,具有特异的、有效的基因沉默效应,能够简单、高效阻抑特定基因表达,已广泛用于抗肿瘤的基因治疗。 Jurkat 细胞系淋巴系起源的白血病细胞株,运用 RNAi 技术,设计针对 CXCR4 特异性的 siRNA 转染 Jurkat 细胞,采用 RT-PCR观察 RNAi 抑制 CXCR4 基因表达 , 流式细胞术检测 Jurkat 细胞周期 和 细胞凋亡率。 RNAi诱导 Jurkat 细胞发生凋亡和细胞周期阻滞,从而抑制细胞的增殖。用以探索 ALL 防治的新方法 ,为 ALL 治疗提供理论依据。 方法 : 根据 CXCR4cDNA 符合特征的靶序列,设计并化学合成相关的 siRNA。实验分三组:空白对照组 A 组: Control(不加入 CXCR4-siRNA, Non-silencing dsRNA 和DMRIE-C), B 组:阴性对照组 Non-silencing dsRNA (加入 Non-silencing dsRNA 和DMRIE-C), C 组:目的组 CXCR4-siRNA(加入 CXCR4-siRNA 和 DMRIE-C)。配成 80nM 的 siRNA 溶液。通过脂质体 DMRIE-C 介导 siRNA 转染 Jurkat 细胞 , 48h 后 RT-PCR 检测 CXCR4 基因表达 水平, 运用流式细胞术检测细胞周期分布和细胞的凋亡情况。 结果 : 两对照组间比较差异无统计学意义( P0.05),目的组与两对照组比较,差异均有统计学意义( P0.01)。与空白对照组相比,转染 CXCR4-siRNA 的 Jurkat 细胞的 CXCR4mRNA 表达水平明显下降( 56.9% 1. 4%vs68.3% 2.4%) ,G0/G1 期细胞比例增加( 35.9% 2.0%vs18.1% 1.3%), G2/M 期和 S 期细胞比例相应下降( 20.1%1.1%vs27.7% 1.5%;44.4% 3.0%vs54.2% 2.6%) , 凋亡细胞明显增加 (20.7% 1.7%vs2.98% 0.3%)。 3 结论: 1、利用 RNAi 技术能够特异性抑制 Jurkat 细胞的 CXCR4 基因 的表 达 。 2、 CXCR4 基因 沉默后,能 抑制 Jurkat 细胞 增殖、促进 凋亡 。 关键词: 小干扰 RNA; Jurkat 细胞; 趋化因子 CXCR4; 基因 表达 ; 逆转录 多聚酶链反应 4 Effects of Biological Behaviour of RNA Silencing of CXCR4 Expression on Cocultured Jurkat Cell Abstract Objective: Acute lymphoblastic leukemia ( ALL) is one of the most frequent malignant tumour of paediatrics.Leukemia cell can generally infiltrate skeleton, liver, spleen, lymphaden and so on.A critical thing to affect children with ALL on obtaining long term survival is prevention and cure on heper-marrow leukemia.Chemotatic factor CXCR4 is ligand of stromal cell derived factor(SDF-1), which the combition of two factors can play an import part in the regulation of hematopoisis systema .SDF-1 CXCR4 axis can not only retain survival and proliferation on normal hematopoietic cell,but also on malignant cell proliferation and infiltrate blood,bone marrow,lemphaden.RNA interference (RNAi),an original technique on gene-interruption,can silmply and affectively depress definite gene expression as a specific and ultility silencing effect,aready generally used on antineoplastic gene therapy. Jurkat cell line is a kind of leukemia cell line originating from genetic of lymphatic system.The specific siRNA of CXCR4 plasmid vector was constructed and then transfected into the cultured Jurkat cell line by using RNAi technique .Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)was used to detect the expression of CXCR4 mRNA respectively.Cell cycle distribution and cell apoptosis were determined by flow cytometry.CXCR4 silence by siRNA can inhibit the growth of Jurkat cells through inducing apoposis and cell cycle arrest.In short,it offers a new approach to prevention and cure of ALL. Methods:.The specific siRNA was designed and chemically synthesized evidence with characteristic target sequence of CXCR4 cDNA.The Jurkat cell line were divided three groups:Group A:blank group(not adding CXCR4-siRNA , Non-silencing dsRNA and DMRIE-C),Group B:negative control group(adding Non-silencing dsRNA and DMRIE-C), Group C:purpose group(CXCR4-siRNA and DMRIE-C).The solution was diluted into concentration of 80nM. The siRNA of CXCR4 was transfected into the cultructed Jurkat cell line with DMRIE-C.After 48 hours,reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) 5 were used to detect the expression of CXCR4mRNA respectively.Cell cycle distribution and cell apoptosis were determined by flow cytometry. Results:The blank group and negative control group of comparison difference was not statistically significant,which purpose group comparison with was statistically significant.In comparison with those in purpose and blank group,the levers of CXCR4 mRNA were decreased highly(56.9% 1.4%vs68.3% 2.4%).The percentage of apoptosis cells in CXCR4 group was significantly higher than that in negative control group(20.7% 1.7%vs2.98% 0.3%)and the cell percentage were increased at G0/G1 (35.9% 2.0%vs18.1% 1.3%),but decreased at G2/M phase and S phase(20.1% 1.1%vs27.7% 1.5%;44.4%3.0%vs54.2% 2.6%). Conclusions:1.RNAi technique was found to have obvious inhibitory effect on CXCR4 gene of Jurkat cell and the levers of CXCR4 mRNA of Jurkat cell was found to reduce utility. 2. CXCR4 silence by the specific siRNA can inhibit the growth of Jurkat cells through inducing apoposis and cell cycle arrest. Key Words: short-interfering RNA ; Jurkat cell;CXC chemakine recepter-4;Gene expression; Reverse transcription-polymerase chain reaction Postgraduate: Wang Yan (pediatrics) Directed by: Professor Yin Xiao-cheng 6 前 言 急性淋巴细胞白血病( Acute lymphoblastic leukemia, ALL)是儿 童 最常见的恶性肿瘤之一,发病率高达 4 5/10 万,每年全国新增患者 15,000 20,000 人。给我国人民生活和健康造成巨大的威胁,给社会和家庭带来巨大压力。 白血病细胞可广泛浸润骨骼及肝、脾、淋巴结等髓 外器官,髓外白血病易导致骨髓复发,是治疗失败的主要原因,因而 髓外 白血病的防治是 ALL 患儿获得长期生存的关键之一。因此通过研究白血病 髓 外浸润的基本生物特征,建立有效的诊断及阻遏手段 具有重大的 临床 实用价值。 Muller 及其同事 首先 报道 了 在一个小鼠模型中趋化因子及其受体与人类乳腺癌细胞淋巴结转移的关系 1, 近年来,趋化因子及其受体在恶性肿瘤器官特异性转移中的作用已引起越来越多的研究人员的重视,成为研究热点之一。 趋化因子是由不同类型细胞分泌的能使细胞发生趋化运动的低分子量( 8-12KD)的细胞因子 , 在正常和 非正常生理情

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