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硕士学位论文 论文题目 S100A8/A9 在新生大鼠脓毒症中的表达变化 及意义 研究生姓名 高沙沙 指导教师姓名 俞生林 专 业 名 称 儿科学 研 究 方 向 新生儿学 论文提交日期 2013年 3月 S100A8/A9 在新生大鼠脓毒症中的表达变化及意义 中文摘要 I S100A8/A9 在新生大鼠脓毒症中的 表达变化及 意义 中文摘要 目的: 新生儿对病原微生物高度易感,脓毒症发病率及病死率高。固有免疫是机体抵御病原体感染的第一道防线,固有免疫细胞通过模式识别受体( PRRs)不仅能够识别外源性病原菌相关分子模式 (PAMPs),而且能够识别内源性损 伤相关分子模式( DAMPs),从而启动机体免疫应答; S100A8 A9蛋白分子是由 S100A8和 S100A9构成的异二聚体,选择性表达于中性粒细胞、单核巨噬细胞等固有免疫细胞 ,目前发现其在感染性疾病中有着复杂的生物学功能。本课题通过建立新生大鼠脓毒症模型来分析 S100A8 A9在肺、肝组织中的表达以及炎症因子 TNF-、 IL-6水平的变化,探讨S100A8 A9在新生大鼠脓毒症发病机制中的作用,从而为脓毒症免疫干预提供新思路。 方法 : 采用 Sprague-Dawley(SD)7 日龄大鼠 36 只腹腔注射脂多糖( LPS) 300ug/Kg建立脓毒症模型实验组;同样 Sprague-Dawley(SD)7 日龄大鼠 36 只腹腔注射等量生理盐水建立对照组。两组新生大鼠按照随机原则分别于注射后 2、 4、 8、 12、 24、 48 h 收集肺脏、肝脏并保存,每个时间点均为 6 只 SD 大鼠。用 Real-time PCR 方法检测肺脏和肝脏 S100A8、 S100A9、 TNF-、 IL-6 的 mRNA 水平,免疫组织化学分析的方法检测肺组织、肝组织 S100A8 A9 蛋白分子的表达。 结果: 1. Real-time PCR结果显示,与对照组相比,脓毒症组新生大 鼠肝组织和肺组织中 S100A8、 S100A9、 TNF-的 mRNA水平均明显升高,且变化趋势类似。 S100A8于 2小时开始增加 (P0.01),至 8小时左右达高峰,一直维持较高水平至 48小时; S100A9于 2小时开始升高 (P0.01), 12于小时左右达高峰,至 48小时有所下降,但仍高于对照组; TNF-于 2小时开始升高 (P0.01),并逐步增高至 12小时, 48小时仍维持较高水平;2、 Real-time PCR结果显示,与对照组相比,脓毒症组肺脏组织 IL-6于 4小时表达明显升高 (P0.01), 8小时出现 高峰, 48小时表达仍高于对照组;肝脏组织 IL-6于 4小时表达明显升高 (P0.01), 12小时出现高峰, 48小时表达仍维持较高表达水平。 3、免疫组化结果显示,在脓毒症组肝肺组织中 S100A8 A9异二聚体 2小时表达明显增多(P0.01), 24小时左右达高峰, 48小时仍维持高表达水平。 中文摘要 S100A8/A9 在新生大鼠脓毒症中的表达变化及意义 II 结论: 1、新生大鼠脓毒症发病过程中,随着病情进展,肺、肝组织炎症损伤明显加重,促炎因子 TNF-、 IL-6的表达增加,证明炎症损伤是新生儿脓毒症发病早期的主要特征。 2、脓毒症新生大鼠肝、肺组织中表达 S100A8 A9,并随疾 病进展,呈时间依赖性的升高,提示 S100A8 A9参与新生儿脓毒症病理生理学过程。 3、脓毒症新生大鼠肝、肺组织中促炎因子 TNF-、 IL-6的表达与 S100A8 A9表达呈正相关,提示 S100A8 A9可能与炎症因子产生协同作用,共同加剧新生儿脓毒症的脏器损伤。 关键词: S100A8 A9; TNF-、 IL-6;脂多糖;新生儿脓毒症 作 者: 高沙沙 指导教师: 俞生林 The significance of S100A8/A9 in neonatal rats sepsis Abstract III The significance of S100A8/A9 in neonatal rats sepsis Abstract Objective: Neonates are susceptible to bacterial infection, which lead to high morbidity and mortality from sepsis.The innate immune system represents the first line of defense against invading pathogens and other external harmful agents.The pattern recognition receptors(PRRs) of innate immune cells not just can recognize pathogen-associated molecular patterns(PAMPs),but recognize Damage-associated molecular patterns(DAMPs).Then, immune system initiates responses.S100A8/A9,a heterodimeric complex has been identified as important DAMPs released by activated phagocytes. S100A8/A9 plays important roles in inflammation.In this study, we establish the model of neonatal rats sepsis to analyse the variation of S100A8/A9 heterodimer and cytokine TNF-、 IL-6.The all is in order to investigate the role of S100A8/A9 in the pathogenesis of sepsis of neonatal rats,and try to develop a new idea of immunomodulation and intervention in neonatal sepsis. Methods: Choosing randomly 36 7-day-old Sprague-Dawley(SD) rats with Special Pathogen Free(SPF), the animals received an intraperitoneal injection of LPS to establish the sepsis group.Other 36 rats received an intraperitoneal injection of the same amount of NS to establish the control group.Then, the two groups rats were randomly assigned to different time points,including 2,4,8,12,24,48hours.And there were 6 neonatal rats in each time point.At each target time point,we got the the lungs and livers for analysis. Real-time PCR was chosen to analyze the mRNA expression of S100A8、 S100A9、 TNF- and IL-6.Immunohistochemistry was chosen to analyze the expression of S100A8/A9 in the lungs and livers. Results: 1. The results of Real-time PCR indicate the variation trend of the S100A8mRNA、 S100A9mRNA、 TNF-mRNA in the lungs and livers of sepsis group was basically similar. Compared to the control group,in the lungs and livers of the sepsis group,S100A8mRNA presented higher level at the second hour(P0.01),and reached a peak about 8 hours, to 48 hours has been at a high level;S100A9mRNA presented higher Abstract The significance of S100A8/A9 in neonatal rats sepsis IV level at the second hour(P0.01),and reached a peak about 12 hours, to 48 hours of the experiment kept at higher level.TNF-mRNA presented higher level at the second hour(P0.01),and reached a peak about 12 hours, to 48 hours kept at a high level; 2. In the lungs of sepsis group,IL-6mRNA presented higher level at the fourth hour,reached a peak about 8 hours, to 48 hours has been at a high level;In the livers of sepsis group,IL-6mRNA presented higher level at the fourth hour(P0.01),and stepped up gradually to 12 hours,and kept at a high level to 48 hours.3.The results of immunohistochemistry indicate that S100A8/A9 heterodimer expression in the lungs and livers of the sepsis group presented higher level at the second hour(P0.01),then stepped up gradually to 24 hours,and kept at higher level to 48 hours. Conclusion: 1.With the progress of the experiment,the damage of lungs and livers of neonatal sepsis rats got more and more serious,and the expression level of cytokine TNF-、 IL-6 increased,which indicated inflammatory damage was the main feature of neonatal sepsis in early phase.2.The expression level of S100A8/A9 heterodimer in the inflammatory rats increased with time-dependent in the progress of sepsis,indicated S100A8/A9 involve in inflammatory response of neonatal sepsis.3. There was a positive correlation between the expression level of S100A8/A9 heterodimer and cytokine TNF-、IL-6 in the inflammatory rats,which indicated the synergies between S100A8/A9 and cytokine in organ damage of neonatal sepsis. Keywords: S100A8/A9; TNF-;IL-6;LPS;neonatal sepsis Written by Gao Sha-sha Supervised by Yu Sheng-lin 目 录 前 言 . 1 实验器材和方法 . 3 结 果 . 10 讨 论 . 22 结 论 . 25 参考文献 . 26 综 述 . 28 中英文对照缩略词表 . 36 攻读学位期间情况说明 . 38 致 谢 . 39 S100A8/A9 在新生大鼠脓毒症中的表达变化及意义 前 言 1 前 言 脓毒症是指感染导致的全身炎症反应,并可引起组织器官继发性损伤的临床症候群。新生儿时期免疫系统发育不成熟,对病原菌高度易感,并在感染后较短时间导致严重脓毒症 ,引起多器官功能衰竭( MODS)、脓毒性休克,死亡率高。 新生儿时期脓毒症表现不典型,特别是在感染早期,可能仅出现少吃、少动等非特异性表现,临床早期诊断较困难,感染极易进一步加重,迅速出现弥散性血管内凝血 (DIC)、多功能脏器衰竭、感染性休克等情况。研究表明,在脓毒症早期及时做出诊断并予以干预可以有效降低新生儿脓毒症的死亡率。因此,探索能够反映新生儿感染的特异性指标,并在错综复杂的炎症反应中寻找潜在的干预靶标,是围产医学亟需解决的问题。 固有免疫是机体抵御病原体感染的第一道防线,固有免疫细胞通过其模式识别 受体 (pattern recognition receptors, PRRs),特异地识别病原微生物的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs),从而有效地监测病原微生物的入侵以及诱导机体免疫应答反应 1.2;其中 Toll样受体 (Toll-like receptor,TLR)是目前研究最深入的一种特异的 I-型跨膜受体及病原模式识别受体,在急性炎症反应、细胞信号转导和细胞凋亡中起重要作用,是连接天然免疫和适应性免疫应答的桥梁 3;其中 TLR4是哺乳动物脂多糖( LPS)的受体和信号转导分子,在介导 LPS的病理生理效应中具有重要作用; TLR4不但能识别外源性的 PAMPs如细菌的脂多糖,还可识别内源性物质及其降解产物,如机体应激或是组织损伤时释放的热休克蛋白、透明质酸和硫酸乙酷肝素组成的低聚糖等 1.2,这些物质被称为损伤相关分子模式( Damage-associated molecular patterns,DAMPs)。进人血液的内毒素激活机体免疫细胞,诱导过度的固有及适应性免疫反应在脓毒症发病中占有重要地位 4。免疫细胞释放大量的炎症分子,引 起体内的抗炎因子如 IL-4、 IL-10、转化生长因子 -( TGF-)等与促炎介质如 IL-1、IL-6及肿瘤坏死因子 -( TNF-)等失去平衡 5.6.7.8,打破机体免疫稳态,最终导致各器官的损伤。因此,免疫细胞功能状态及炎症因子间的表达水平直接影响到脓毒症病情进展及预后。 前 言 S100A8/A9 在新生大鼠脓毒症中的表达变化及意义 2 1965年 Moore等人从牛脑组织中提取到一种能够溶解于 100硫酸铵溶液的蛋白混合物,称之为 S100蛋白 9,迄今发现有二十二名 S100蛋白家族成员,它们由小分子量蛋白组成,能够和钙离子、锌离子等结合, S100A8和 S100A9与 S100蛋白其他成员一样,两端分别为氨基末端 EF-1和羧基末端 EF-2手型结构,中间为铰链区,两侧为疏水区 10。因铰链区和羧基末端的氨基酸序列不同, S100蛋白家族各个成员从而具有不同的生物学活性 11。四种 S100蛋白家族成员 (S100A8、 S100A9、 S100A12、 S100A6)主要表达在髓系细胞,其中 S100A8、 S100A9、 S100A12被认为与炎性疾病有关 12。其中 S100A8又称髓细胞相关蛋白 -8( MRP-8) ,S100A9又称髓细胞相关蛋白 -14( MRP-14),两者在 Ca2+依赖方式下形成 S100A8 A9异源二聚体,即钙卫蛋白(calprotectin),而发挥生物学功能。正常生理状态下, S100A8/A9具有严格的表达特异性,无活性,而在炎性状态下,能被激活的单核巨噬细胞分泌 13.14.15,并产生相应活性。 目前,对 S100A8/A9的研究主要集中于自身免疫性疾病、肿瘤、心血管疾病等方面领域,在非感染性炎症如炎性肠病、慢性支气管炎、囊性纤维化等疾病中也发现有较高表达水平;然而,在感染性炎症特别是急性感染方面对 S100A8/A9的研究较少;近来有研究表明 14.15.16,在炎症的急性期中性粒细胞、巨噬细胞等吞噬细胞在炎症因子刺激下能分泌大量 S100A8 A9,作为内源性 DAMP参与 TLR4信号传导通路 17,促进更多炎症因子的释放,从而形成正反馈效应,导致过度炎症反应及炎症损伤。尽管S100A8/A9加剧炎症反应的作用及其分子机制已被证实,但新生儿脓毒症发病早期是否伴随 S100A8/A9参与还没有报道, S100A8/A9是否能加剧新生儿感染引起的炎症损伤也不清楚。 鉴此,本课题将在既往研究的基础上,通过腹腔注射 LPS来构建新

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