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硕士 专业 学位论文 论文题目 TLR2和 TLR4表达及其信号转导在新生儿 感染 控制 中的作用 研究生姓名 刘华献 指导教师姓名 汪 健 教授 专 业 名 称 儿科学 研 究 方 向 普外科 论文提交日期 2013年 4月 TLR2 和 TLR4 表达及其信号转导在新生儿感染控制中的作用 中文摘要 I TLR2和 TLR4表达及其信号转导在新生儿 感染 控制 中的作用 中文摘要 目的: 新生儿对 细菌、病毒和真菌等引起的感染高度易感,感染性疾病也是导致新生儿死亡的主要病因之一。单核细胞是固有免疫系统中主要的效应细胞,在识别、抗原呈递以及吞噬清除病原体方面发挥着至关 重要的作用。 TLRs( Toll-like receptors)是单核细胞上表达的一类主要的模式识别受体,单核细胞依赖 TLRs 及其下游信号网络参与到抗感染免疫应答中。 TLR2 和 TLR4 不但可识别外源的病原体,还可识别内源性物质及降解物 (如细菌脂多糖、肽聚糖以及 热休克蛋白 等),是 TLRs 中较为重要的两种。因此,我们将以 TLR2 和 TLR4 为切入点,研究新生儿单核细胞上 TLR2、TLR4 的表达情况及其下游信号转导的特点,为免疫治疗新生儿感染提供新思路。 方法: 收集 29 例新生儿( 37 周 -42 周)的脐血以及 24 例健康成 人外周血,采用流式细胞术分析单核细胞表面 TLR2 和 TLR4 的表达水平;取新生儿脐血及健康成人外周血各 50l,分别给予 PGN( 1g/ml)或 LPS( 10ng/ml)刺激 10min,以流式细胞术分析单核细胞中 p38以及 p65的活化水平;另取新生儿脐血和成人外周血各 50l,分别用 450l 含 PGN(1g/ml )或 LPS(10ng/ml)的 RPMI1640 培养基刺激 4h,收集培养上清,采用 CBA 法( Cytometric Beads Array)检测其中细胞因子 IL-1、 IL-6 的表达水平。 结果: 1. 新 生儿单核细胞表面 TLR2 的平均荧光强度( 3.45 0.14)与成人( 3.860.19)相比,未见明显统计学差异( P=0.08);而新生儿单核细胞表面 TLR4的平均荧光强度( 1.36 0.07)与成人 ( 1.89 0.12)相比,差异具有统计学意义( P0.01)。同样,新生儿单核细胞 TLR2 阳性细胞百分比( 85.47 1.93)与成人( 85.86 1.46)相比,亦未见明显统计学差异( P=0.88);新生儿单核细胞表面 TLR4 阳性细胞百分比( 43.98 2.00)与成人( 53.82 2.47)相比,差异具有 统计学意义( P0.01)。2. PGN( 1g/ml)刺激后,新生儿 p38 活化水平为 2.80 0.32,明显低于成人( 5.72中文摘要 TLR2 和 TLR4 表达及其信号转导在新生儿感染控制中的作用 II 0.23),差异具有统计学意义( P0.01);新生儿 p65 活化水平为 1.10 0.02,与成人( 1.13 0.02)相比,未见明显统计学差异。 LPS( 10ng/ml)刺激后,新生儿 p38活化水平为 2.43 0.14,明显低于成人( 3.82 0.24),差异具有统计学意义( P0.05);经 LPS 刺激后,新生儿 p65 活化水平为 1.25 0.02,明显低于成人 1.56 0.04,差 异具有统计学意义 ( P0.01) 。 3. PGN( 1g/ml)刺激后,新生儿细胞因子 IL-1 的释放水平为 243.74 15.65pg/ml,较成人组 ( 344.30 26.53pg/ml)明显降低,差异具有统计学意义( P0.05); PGN 刺激后,新生儿 IL-6 的释放水平为 1791.82 341.71pg/ml,成人 IL-6 的释放水平为 1698.66 265.00pg/ml,两者相比,无明显统计学差异( P=0.83)。 LPS 刺激后,新生儿细胞因子 IL-1 的释放水平为 46.56 2.23pg/ml,与成人 组 (73.24 7.90pg/ml)相比,同样具有显著统计学差异( P0.05); LPS 刺激后,新生儿 IL-6 的释放水平为 847.51 34.88pg/ml,成人 IL-6 的释放水平为 947.4570.64pg/ml,两者相比,未见明显统计学差异( P=0.31)。 结论: 与成人相比,新生儿单核细胞表面 TLRs的表达水平较低,而且 TLRs下游信号通路发育也不成熟,共同导致 TLRs配体不能充分诱导新生儿单核细胞活化,释放细胞因子不足,最终使得单核细胞介导的固有免疫应答不充分,不能及时、有效的发现和杀伤病原体,加 重感染病情进展。 关键词: TLR2; TLR4;新生儿感染;单核细胞 作 者 :刘华献 指导老师 :汪 健 The Role of TLR2/TLR4 Expression and Signal Transduction in Neonatal Infection Control Abstract III The Role of TLR2/TLR4 Expression and Signal Transduction in Neonatal Infection Control Abstract Objective: Newborns are highly susceptible to infections caused by bacteria, viruses and fungi. Infectious diseases are still the most common diseases in childrens early life, which is also the main cause of death in children. Monocytes, expressing TLRs (Toll-like receptors) on its surface, play an important role in pathogen recognition, phagocytosis, antigen presentation and clearance. The activation of TLRs and its downstream signaling networks play a major role in the first line of defense against infection. TLR2 and TLR4, which are the major members of TLR family, could identify not only exogenous pathogens, but also endogenous substances and degradation products (such as bacterial lipopolysaccharide, peptidoglycan, as well as heat shock protein, etc.). Therefore, monocytes from neonatal cord blood were collected in this study, and the expression and signal transduction of TLR2/TLR4 were measured, which would provide valuable clues to clinic treatment of neonatal infection. Methods: Flow cytometry was adopted to measure the TLR2 and TLR4 expression levels of the peripheral blood samples from 29 neonates and 24 healthy adults. 50l blood sample from each group was stimulated with either PGN( 1g/ml) or LPS( 10ng/ml) for 10min at 37 . After stimulation, signaling pathways in monocytes were investigated using phosphospecific antibodies directed against p38 and p65. Another 50l blood sample from each group were treated with 450l RPMI 1640 containing PGN( 1g/ml) or LPS( 10ng/ml) respectively. 4 hours later, supernatants were harvested and investigated by CBA method to detecting the levels of IL-1 and IL-6. Results: 1. The TLR2 levels did not differ between age groups. In contrast, TLR4 expression were substantially lower (P0.01) in newborns than in adults. 2. After stimulation with LPS, activation of p38 and p65 were impaired in newborn group (P0.05). 3. Accordingly, the levels of IL-1 were striking lower in newborns than in adults after the stimulation with TLR2 and TLR4 specific ligands(P0.05), but the levels of IL-6 did not differ between age groups. Conclusions: Compared with adults, the reduced expression of TLRs, impaired underline signaling transduction and cytokines production in newborn appears to be part of the functional immaturity of the neonatal immune system, which predispose newborns to bacterial infection. Key words : TLR2, TLR4, neonatal infection, monocytes Written by: Liu Huaxian Supervised by: Wang Jian 目 录 前 言 . 1 资料与方法 . 4 结 果 . 8 讨 论 . 14 结 论 . 18 参考文献 . 19 综 述 . 21 缩略词表 . 30 致 谢 . 31 TLR2 和 TLR4 表达及其信号转导在新生儿感染控制中的作用 前 言 1 前 言 新生儿对细菌、病毒和真菌引起的感染高度易感,如今感染性疾病仍然是儿童早期生活中最常见的疾病,也是最主要的致死原因。据报道,全世界每年约有 160 万新生儿死于感染 1, 我国流行病学调查显示: 2005 年 43289 名住院新生儿中,肺炎占46%,败血症占 5%,颅内感染占 0.8%2。新生儿对感染易感性的增加,除了母体因素以及产科因素外,最主要的原因是新生儿免疫功能的不成熟。新生儿 尚未 充分 接触子宫外环境的各种病原 体,缺乏特异抗原的刺激,而且自身合成特异性抗体的能力不足,导致针对病原体的特异性免疫应答低下。近年来,不断有研究表明,固有免疫系统功能缺陷同样也是造成新生儿易发感染性疾病的重要原因 34。固有免疫是机体在长期种系发育与进化过程中逐渐形成的一种免疫防御功能,是机体免 疫系统的第一道屏障,这些由物理屏障、生物化学屏障、固有免疫细胞和细胞因子所组成的免疫系统,面对各种不同的感染性因素,能起到迅速、广泛的应答作用。而且,固有免疫的应答反应还是特异性免疫应答的基础,可以进一步激活特异性免疫。因此,对于新生儿固有免疫系统的研究,无疑具有十分重要的临床意义。 在固有免疫系统中,参与免疫作用的细胞主要包括上皮细胞、吞噬细胞、 NK 细胞以及 T 细胞、 B-1B 细胞。其中吞噬细胞不仅可以通过其表面的分子识别病原体,起到吸附、吞噬杀灭病原体的作用,而且能够分泌细胞因子以及其它炎性介质,如TNF-, IL-1, IL-6, IL-8, IL-12,前列腺素、白三烯等,进一步提高机体对病原体清除的作用,并能促进其它免疫细胞的活化,如 B 细胞、 NK 细胞的活化等。此外,吞噬细胞尚能对抗原进行加工呈递,启动特异性免疫应答过程。单核细胞是吞噬细胞系统中十分关键的一类免疫细胞,其在外周血中占白细胞总数的 1%-3%,而且可进一步移行至全身组织器官,发育成巨噬细胞,在固有免疫系统中发挥着举足轻重的作用。因此研究新生儿单核细胞介导抗感染作用的规律及其分子生物学机制,可以进一步了解新生儿固有免疫系统的特点,为临床诊断、预防 和治疗新生儿以及婴幼儿的感染性疾病提供新思路。 在人类了解微生物的致病概念以后,一直以来就在寻找体内可以识别病原微生物前 言 TLR2 和 TLR4 表达及其信号转导在新生儿感染控制中的作用 2 的特有分子。最初,人们在研究果蝇胚胎背腹侧的发育过程发现一种蛋白,命名为Toll 蛋白 5, 1996 年 Hoffman 及其同事发现 Toll 突变的果蝇对真菌高度易感 6,从此揭开了 Toll 受体在固有免疫中所扮演的重要作用。近年来,随着对 Toll 蛋白的研究,人们发现在哺乳动物中也同样存在一类与果蝇 Toll 蛋白相似的跨膜蛋白,同时将其命名为 Toll 样受体 7,之后,多个关于哺乳动物膜蛋白中的 TLRs 被发现,迄今为止,在人类中发现有 10 个家族成员 8910,小鼠中发现 13 个家族成员 11。 TLRs 结构为 I 型跨膜蛋白,分胞外区,跨膜区以及胞内区。胞外区均有 1925个富含亮氨酸的重复结构( Leucine-rich repeat, LRR),每个 LRR 由 24 29 个氨基酸组成,为 折叠 -环 -螺旋的结构,整个 LRR 结构域形成一个马蹄形的结构,可参与对各种病原体的识别。 TLRs 的胞内区含有 Toll/IL-1 受体同源区( Toll/IL-1 receptor homologous region, TIR) ,该区是其信号转导的功能域,能特异性地将刺激信号传递到细胞核,从而调节基因的表达。 TLRs 的配体按来源可分为外源性和内源性配体。外源性配体主要来自于病原微生物进化过程中的保守成分,如细菌的脂多糖、胞壁酸、肽聚糖以及细菌和病毒的核酸等。内源性配体来自机体合成的内源性物质(如热休克蛋白)或细胞外基质的降解成分等。当细胞外病原体相关分子模式配体( Pathogen associated molecular pattern , PAMP)与 TLRS 结合后,配体信号经 TLRs 的跨膜区转 导进入胞内,通过胞浆区内的 TIR 吸引并结合下游的不同分子调节器( MyD88 或非 MyD88),经过 MyD88 依赖途径或 MyD88 非依赖途径,激活下游的信号转导链121314。在 MyD88 依赖途径中, TLRs 与 MyD88 的结合后,通过招募白介素受体相关激酶( interleukin receptor associated kinase, IRAKs,包括 IRAK1、 IRAK2、 IRAK4) ,使 IRAK 激活后,再与 肿瘤坏死因子受体相关因子 ( tumor necrosis factor receptor associated factors, TRAFs)相互作用,再激活 IKK( inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase) 复合体和 MAPK( mitogen-activated protein kinase)家族两条下游途径,之后再分别活化转录因子 NF-B 和 AP-1( activator protein-a),激活相关基因的表达。MAPK 是 真核生物信号传递网络中的重要 通路 之一,在 基因表达调控 和细胞功能活动中发挥关键作 用,其中 p38 MAPK 信号转导通路 与在炎症、细胞生长分化和程序性死亡过程中都起着十分重要的调控作用 15。 P38 在受到各种刺激的作用下被激活发生磷酸化,磷酸化后的 p38移入核内,进一步磷酸化下游的蛋白激酶和转录因子 1617, 启动相关基因的表达。 NF-B 作为 TLRs 信号通路中的另外一个关键转录调节因子,TLR2 和 TLR4 表达及其信号转导在新生儿感染控制中的作用 前 言 3 共有 5 个家族成员,分别 c-RelNF-、 Bl(p50 p105)、 NF-B2(p52 p100)、 RelA(p65)、RelB。正常状态下 其与 IB 结合可维持 NF-B 的非活化状态,在受到细胞因子、 LPS、病毒感染等的刺激下, IB 激酶活化使 IB 解离

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