单核苷酸多态性与先天性室间隔缺损相关性的初步研究

硕士学位论文 论文题目 单核苷酸多态性与先天性室间隔缺损 相关性的初步研究 研究生姓名 王 波 指导教师姓名 严文华 专 业 名 称 儿科学 研 究 方 向 心血管 论文提交日期 2013年 3月 单核苷酸多态性与先天性室间隔缺损相关性的初步研究 中文摘要 I 单核苷酸多态性 与先天性室间隔缺损相关性 的初步研究 中文摘要 目的 ：本实验以 先天性室间隔缺损（ Ventricular septal defect， VSD）患者 为研究对象，以正常儿童为对照， 从基因遗传和环境因素两方面着手 探讨 先天性心脏病(Congenital Heart Disease, CHD)致病因素，为 CHD 的病因研究及预防提供参考。 方法 ： 运用 PCR-DNA测序技术对 43 例 VSD 患者及 188 例正常儿童 进行 NKX2-5外显子 1 的测序， 运用 SNaPshot 基因分型技术 分别检测 43 例 VSD 患者及 188 例正常儿童 叶酸代谢 通路上 11 个酶基因的 13 个 单核苷酸 多态位点 （ single nucleotide polymorphisms， SNP） ，同时对 CHD 患者和正常儿童的父母进行访谈式的关于 CHD相关危险因素的问卷调查，共完成 116 例患 者 和 161 例正常对照的有效问卷，并对 结果 进行统计分析。 结果 ： 1 对 43 个 VSD 样本和 188 个正常样本进行 NKX2-5 外显子 1 测序 ，结果 未发现任何基因突变， 找到 1 个 已报道的 SNP 位点， c.63A G，其两组间基因型分布 及等位基因频率 无统计学差异， P 0.05。 2 在 43 个 VSD 样本和 188 个正常样本中， MTHFD-G878A 仅检测到野生型，未检测到突变。 CBS-C699T 仅 检 测到野生型 (-/-)和杂合突变型 (-/+)。 其余 11 个位点皆检测到三种基因型：野生型 (-/-)、杂合突变型 (-/+)和纯合突变型 (+/+)。 VSD 组和对照组比较显示： VSD 组携带 RFC1-G80A 的 AA 基因型频率 (39.5%)显著高于对照组(27.7%),P0.05,OR=4.47,95%CI=1.60,12.48； VSD 组中 DHFR-c594+59del19 的 GG基因型在 VSD 和对照组中的分布频率分别为 34.9%和 45.2%，前者显著 低于后者，P0.05， OR=0.39， 95%CI=0.15,0.98。其他位点的杂合突变或纯合突变在 VSD 和正常对照组中的频率分布无显著差异 ， P 0.05。 3 对 CHD 患儿是否存在父系或母系先天性心脏病家族史和患儿母亲怀孕早期有无感冒、孕期有无 吸烟或被动吸烟等 相关 因素 (变量 )进行二值 Logistic 回归分析，孕中文摘要 单核苷酸多态性与先天性室间隔缺损相关性的初步研究 II 早期有无感冒（ B=-0.988， Wald=9.463， P=0.002）、母亲家系中是否有 CHD 患者（ B=-2.423， Wald=8.780， P=0.003）、父亲家系中是否有 CHD 患者（ B=-2.355，Wald=4.180， P=0.041）三个变量与 CHD 的发生有关。 结论： 1 NKX2-5 外显子 1 测序未发现基因突变。 NKX2-5 外显子 1 上的 c.63A G SNP位点与 VSD 之间无明显相关。 2 RFC1-G80A的 AA基因型构成 VSD的独立风险因素，而 DHFRC-594+59DEL19纯合缺失可能是 VSD 发生的保护因素。 3 CHD是以遗传因素为主导的多基因遗传病。 孕早期是胎儿心脏发育的关键时期，孕早期感冒可能 引起 CHD的发生 ， 加强孕早期保健防护 ， 对预防 CHD发生具有重要现实意义。 关键词 ：先天性心脏病；室间隔缺损；单核苷酸多态性； NKX2-5； SNaPshot 基因分型 ；叶酸代谢；酶；危险因素 作 者 ：王 波 指导老师 ：严文华 The initial research of SNPs in congenital ventricular septal defect Abstract III The initial research of SNPs in congenital ventricular septal defect Abstract Objective:In this study,it takes patients with congenital ventricular septal defect as the object and normal children as control.And at the same time,surveys to the parents of CHD patients and normal children are to explore the risk factors of CHD and to provide a reference for the etiology research and prevention of CHD. Methods： Use PCR-DNA sequencing technology to detect exon of the gene NKX2-5 in the 43 cases of VSD and 188 normal children； use SNaPshot genotyping technology to detect 13 SNPs of 11 enzyme genes related to folic acid metabolism of 43 cases of VSD and 188 normal children； survey the parents of 116 CHD patients and 161 controls about the risk factors of CHD with interview-style. And do statistical analysis about the results. Results： 1 No mutation was found in the exon of the Nkx2-5 gene,While we found an AtoG transition at nucleotide 63(Glu21Glu).Further study presented that there were no statistic differences of the genetype frequency and allele frequency between ventrial septal defect patients and normal controls,P 0.05. 2 No mutation was found in MTHFD-G878A.No GG genetype was found in CBS-C699T.SNP RFC1-G80A might increase the risk of VSD, and DHFR-c594+59del19 might decrease the risk of VSD. The ratios of the two SNPs between ventrial septal defect patients and normal controls are of statistic differences:the AA genotype of FC1-G80A,OR=4.47(95%CI=1.60,12.48,P0.05)；the GG genotype of DHFR-c594+ 59del19, OR=0.39(95%CI=0.15,0.98,P0.05). 3 Using logistic regression analyze the risk factors (variables) in the questionnaires. The mother catching a cold or not during the early pregnancy (B = -0.988, Wald = 9.463, P = 0.002), whether there are maternal CHD family history (B = -2.423, Wald = 8.780, P = Abstract The initial research of SNPs in congenital ventricular septal defect IV 0.003), whether there are paternal CHD family history (B =-2.355, Wald = 4.180, P = 0.041) are related to the occurrence of CHD. Conclusion： 1 No mutation was found in the exon of the Nkx2-5 gene. No significantly difference between the patients with ventricular septal defect and control group was found in the distribution of allele and genotype of the SNP(c.63A G). 2 The AA genotype of RFC1-G80A is a susceptible factor for VSD. The GG genotype of DHFR-c594+59del19 is a protective genotype for VSD. 3 Early pregnancy is a critical period of fetal heart development. Maternal cold may cause CHD.Strengthening early pregnancy health care has the important realistic significance to prevent the occurrence of CHD. Key words: Congenital heart disease； Ventricular septal defect； single nucleotide polymorphisms； SNaPshot genotyping technology； NKX2-5； Folate-related metabolism；enzyme； risk factor. Written by: Wang Bo Supervised by: Yan Wenhua 目 录 前 言 . 1 第一部分 先天性室间隔缺损中 NKX2-5外显子 1的突变筛查 . 3 材料与方法 . 3 结 果 . 7 讨 论 . 9 第二部分 叶酸代谢相关酶基因 SNPs与先天性室间隔缺损的关系探讨 .11 材料与方法 .11 结 果 . 13 讨 论 . 18 第三部分 先天性心脏病危险因素问卷调查 . 24 对象与方法 . 24 结 果 . 24 讨 论 . 25 结 论 . 27 研究的局限性 . 28 研究的创新性和展望 . 29 参考文献 . 30 综 述 . 38 英文缩略词表 . 50 攻读学位期间公开发表的论文 . 52 致 谢 . 53 单核苷酸多态性与先天性室间隔缺损相关性的初步研究 前 言 1 前 言 先天性心脏病 (Congenital Heart Disease, CHD)，简称先心病，是胚胎发育时期心血管 系统 发育异常或出生后应该退化的组织 未曾 退化所造成的心血管畸形，是由于控制人类心 血管系统 发育的基因 发 生突变以及这些基因在 环境因素影响下发生 时间（发育阶段）和空间（组织特异性）调控表达失误所 造成的 心 血管 畸形。 CHD 是最常见的出生缺陷之一，其发病率约为活产婴儿的 1 1，是 5 岁以下儿童非感染性疾病中最主要的死亡原因 2。心血管系统是人体最早发育的系统之一，在妊娠的前三个月就基本发育完成。在细胞不断分裂和组织不断分化成熟的这一时期， 处 在发生和发展的心血管系统极易遭受不良的宫内环境及其他环境因素的影响。研究表明，不良的环境因素及遗传因素的相互作用可直接影响胎儿心血管系统的分 化、发育和成熟，导致胎儿发生各种各样的心脏畸形 3。 各种 先天性 心脏畸形中 又以室间隔缺损 （ Ventricular septal defect， VSD） 的发生率最高 4。 最早在 1847 年 Dalrymple 进行了关于室间隔缺损的报道。它是指由于心室的间隔部分组织缺损形成异常开口而引起左右心室 间异常的血流交通，从而造成血流动力学改变的一种先天性心脏缺损。 虽然先天性心脏病的病因和发病机制尚未完全明确，但目前多数学者认为 CHD 的发生是由遗传因素和环境因素共同作用引起的 5。单核苷酸多态性 是人类基因组最常见的多态， 遍布于人类基因组中，主要是指 由于 基因组中单个核苷酸的变异导致了个体与个体之间的差异。 目前在公共数据库有过报道并经过确认的 SNP 在已经超过 2700 万，近几年来，研究者们在单核苷酸多态 性 与先心病的研究中已经取得了不少进展 6。 本课题中我们从基因遗传和环境因素两方面着手，运用 PCR-DNA 测序技术对43 例 VSD 患者及 188 例正常儿童进行 NKX2-5 外显子 1 的测序，运用 SNaPshot 基因分型技术 分别 检测 43 例 VSD 患者和 188 例正常儿童进行 叶酸代谢 通路上 的 11 个酶基因的 13 个多态位点 ，包括 CBS-C699T、 DHFR-c594+59del19、 GST01-C428T、MTHFD-G878A 和 -G1958A、 MTHFR-C677T 和 -A1298C、 MTR-A2756G、 MTRR-A66G、NFE2L2-ins1+C11108T、 RFC1-G80A、 TCN2-C776T 和 TYMS-1494del6， 同时根据文前 言 单核苷酸多态性与先天性室间隔缺损相关性的初步研究 2 献 6-11设计调查问卷，调查内容涉及 CHD 患儿是否有父系或母系先天性心脏病家族史和孕母早期是否感冒、是否吸烟或被动吸烟等。 从而探讨 VSD 的发病机制及 CHD的环 境易感因素， 为 CHD 的遗传咨询和早期诊断提供参考，进而采取有效的预防措施， 以期 减轻 CHD 给社会和家庭造成的严重的经济和精神负担。 单核苷酸多态性与先天性室间隔缺损相关性的初步研究 第一部分 3 第一部分 先天性室间隔缺损中 NKX2-5 外显子 1的 突变筛查 材料与方法 1.材料 1.1 研究对象 2010 年 10 月 -2012 年 10 月在苏州大学附属儿童医院住院，通过经胸心脏彩超、心电图、 胸部 X 线、临床症