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文档简介

儿童过敏性紫癜外周血单个核细胞TLR2和MyD88 mRNA表达初步观察摘要目的探讨Toll样受体2(Tolllike receptor 2,TLR2)、髓样细胞分化蛋白88(Myeloid differentiation primary response gene 88,MyD88)、肿瘤坏死因子a(Tumor Necrosis Factor alpha,TNFa)mRNA在过敏性紫癜(HenochSchSnleinpurpura,HSP)患儿外周血单个核细胞的表达,从基因水平揭示TLR2、MyD88、TNF-Q在HSP患儿的免疫发病机制中的可能作用。方法选取2011年11月至2012年11月就诊于青岛大学医学院附属医院急性期HSP患儿64例为病例组,其中合并肾损害HSP组28例,无肾损害HSP组36例,健康对照组为我院健康体检儿童30例。无菌条件下采用密度梯度离心法获取外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuciear cells,PBMC),采用荧光定量PCR检测外周血单个核细胞TLR2、MyD88、TNF-mRNA的表达。两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析和LSDt检验,TLR2、MyD88、TNFQ mRNA表达变化相关性采用spearman秩相关分析。结果(1)HSP患儿PBMC TLR2、MyD88和TNF-Q mRNA表达量与正常对照组比较均显著增高(pO。01),有、无肾损害HSP组PBMC TLR2、MyD88和TNFa mR_NA表达量均显著高于正常对照组(p005),而有肾脏损害HSP组患儿TLR2、MyD88、TNFQ mRNA表达量也显著高于无肾损害HSP组(pO05)。(2)HSP患儿PBMC TLR2mRNA表达水平与MyD88mRNA表达水平呈正相关(r=O726,pO05)。结论HSP患儿PBMc TLR2、MyD88、TNF-d mRNA表达明显升高,有肾损害组也明显高于无肾损害组,提示PBMC TLR2和MyDSSmRNA的过表达可能参与HSP和紫癜性肾炎的免疫发病机制。硕士研究生指导教师孙燕(儿科学)张秋业教授关键词:过敏性紫癜;Toll样受体2;髓样细胞分化蛋白88;肿瘤坏死因子一aThe expression preliminary observation of TLR2,MyD88 andTNFamRNA from Peripheral blood mononuclear cells in child ren withHenochSchSnlein purpuraAbstractObjective To reveal the possible role of Tolllike receptor 2,Myeloid differentiationprimary response gene 88 and Tumor Necrosis Factor alpha in immunologicalpathogenesis of HenochSchOnlein purpura from gene level by studying the expressionlevels of TLR2MyD88 and n、IF吨mRNA from peripheral blood mononuclear cells inchildren with Henoch-SchOnlein purpuraMethods sixty-four HSP patients in acute phase were subsequently entered into studygroup who were hospitalized in Department of Pediatrics,The Affiliated Hospital ofQingdao University Medical Collage,from November 20 1 1 to November 20 1 2The HSPgroup Was divided into two groups,including patients谢th renal damage(n 2 36)andthose without renal damage(n-28)heahby children constituted the control groupwho were carried on the healthy check-up in the hospitalPeripheral blood mononuclearcells(PBMC)were isolated by density gradient centrifugation method in asepticconditionsReal-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction was used tomeasure the expression levels of TLR2,MyD88 and TNF-Q mRNA from PBMCTheStudent t test Was used for comparison between the HSP patients and the contr01Theone-way analysis of variance and LSD-t test were used to determine the differencesamong groupsThe spearmanS rail correlation analysis Was used for the correlation amongthe expression levels ofTLR2,MyD88 and TNF-Q mRNAResultsCompared with the control group,the expression levels of TLR2,MyD88 andTNF-0【mRNA from PBMC were upregulated significantly in children with HSP(pO01)The expression levels of TLR2,MyD88 and TNF-a mRNA from PBMC were remarkablyincreased in patiems with renal damage and those withom renal damage when comparedto the control(p005),and these were significantly higher in pmiems winl renal diseasethan those without renal disease(p005)The expression levels of TLR2 rnRNA fromPBMC had remarkably positive correlations、,im the expression levels of MyD88 mRNAin children诵也HSP(F0726,pO05)Conclusions T11c expression levels ofTLR2MyD88 and TNFoanRNA from PBMC wereremarkably increased in children、析t11 HSP,and these were significantly higher in patientswith renal disease than those without renal diseaseOur finds suggest that over expressionof TLR2 and MyD88mRNA from PBMC may participate in immunologicalpathogenesis of Henoch-SchOnlein purpura and Hcnoch-Sch6nlein purpura nephritis(HSPN)Postgraduate student:Sun Yan(pediatries)Directed by ProfZhang QiuyeKeywords:Henoeh-Sch6nleinpurpura;Tolllikereceptor 2;Myeloid differentiationprimary response gene 88;Tumor Necrosis Factor alpha目 录引言1第一章材料与方法311主要器材312主要试剂313研究对象414研究方法415统计学处理8第二章结果921 TLR2、MyD88、TNF-a mRNA表达结果稳定性与可靠性评价922 HSP患)LPBMC TLR2、MyD88、TNFQ mRNA的表达1123有、无肾损害HSP患儿PBMC TLR2、MyD88、TNFQ mRNA的表达比较1124 HSP患儿PBMC TLR2、MyD88、TNFa mRNA表达的相关性分析12第三章讨论1431 TLRs结构、分布、配体、信号通路及功能特性1432 HSP患儿PBmC TLR2和MyD88mRNA表达与意义探讨15结论17参考文献18综述2l综述的参考文献29攻读学位期间的研究成果32致谢33学位论文独创性声明学位论文知识产权权属声明34引言儿童过敏性紫癜外周血单个核细胞TLR2和MyDSBmRNA表达初步观察引 言过敏性紫癜(HenochSchOnlein purpura,HSP)是一种主要以IgA免疫介导的系统性小血管炎,临床主要表现为非血小板减少性可触性紫癜、腹痛、关节肿痛、血尿、蛋白尿。根据不同的临床症状及体征,可将HSP分为皮肤型、腹型、肾型、关节型、混合型等,其中肾型的病情多较严重且预后较差【I】。肾损害多发生在出现典型皮疹46周内,据文献报道20100的HSP患儿会有肾损害发生(2】,发病率的差异可能与判断标准不同有关。1135的紫癜性肾炎(HenochSch&dein purpuranephritis,HSPN)患儿会发展为d,JL慢性肾功能衰竭【3】,因此肾损害的发生与否及其损害程度直接决定HSP的预后。HSP病因及发病机制尚未完全明确。常见的病因中感染居首,其中2050HSP患儿急性期通过血清学或细菌培养发现为A组13溶血性链球菌感染,其抗原肾炎相关的纤溶酶受体(nephritisassociated plasmin receptorNAPl r)在HSPN发病中起一定作用l锎。其它较常见的细菌包括幽门螺杆菌、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、肺炎链球菌等,支原体、柯萨奇病毒、EB病毒、微小病毒B19等可能与HSP发病有关。其它病因为多种高蛋白类食物、某些药物、接种疫苗、及遗传因素等可能与HSP发病有关。HSP发病机制可能涉及体液免疫及细胞免疫的紊乱,同时有细胞因子及炎症介质的参与。HSP患儿体液免疫紊乱主要是B淋巴细胞多克隆活化,患儿血清IgA水平增高,出现以IgAl为主的免疫复合物沉积于小动静脉及毛细血管,造成皮肤、胃肠、肾脏等血管内皮的损伤。IgAl氧连接枢纽区的糖基化异常及TgAl分子清除障碍是导致Igg免疫复合物沉积的主要原因7-81。HSP患儿细胞免疫紊主要表现为急性期外周血T淋巴细胞亚群异常,CD4+T淋巴细胞数量降低,CD8+T淋巴细胞数量增高,CD4+TCD8+T比值下斛9】;ThlTh2细胞失衡,n12、Thl7细胞的优势活化及CD4+CD25+Treg的减少可能参与HSP的发生发展【1011 J。相关国内外研究文献显示HSP患儿急性期血清TNFa、IL6、IL8、转化生子因子(TGF)B、血管内皮生长因子(GF)等炎性介质显著升高,而且HSPN患儿血清耵师d水平显著高于HSP患儿【12-16;Ha等研究揭示在HSP患儿急性期显著升高的血清n吓Q可能引起肾小球细胞功能及形态学上的变化,且血清n虾d水平可作为HSP疾病活动和肾脏严重受损的监测指标【17】。综合以往资料显示,HSP及HSPN的发生发展过程存在明显的免疫异常、免疫紊乱状态,而导致这种免疫失调的初始环节目前尚不清楚。Toll样受体(Toll1ike receptor,TLR)是近年来发现的一类模式识别受体,通过识l青岛大学硕士学位论文别病原相关分子(PAMP),激活天然免疫。R信号还通过上调抗原提呈细胞(APC)表面共刺激分子及促进APC分泌的炎症细胞因子调节获得性免疫。TLR信号通路包括髓样细胞分化蛋白88(MyD88)依赖性或MyD88qE依赖性途径激活核转录因子K B(NFK B)、干扰素调节因子3(IRF3)诱导细胞因子及趋化因子基因转录ll 8】。近年来国内外研究显示,TLRs信号通路在自身免疫性疾病、超敏反应、炎症反应、细胞凋亡及移植排斥反应中发挥重要的作用。本研究目的旨在检测T011样受体2(TU匕)、髓样细胞分化蛋白88(MyD88)、肿瘤坏死因子Q(TNFQ)mRNA在HSP患JL#I-周血单个核细胞的表达。从基因水平揭示TLl也和MyD88表达异常在HSP患儿的免疫发病机制中可能作用。2材料与方法11主要器材第一章材料与方法(1)swCJ1F型净化工作台 苏州净化设备厂(2)Rotor gene 480荧光定量PCR仪 瑞士Roche公司(3)LD52A型低速离心机 北京医用离心机厂(4)925型超低温冰箱(最低达80) 美国Forma Scientific公司(5)移液器 法mEppendorf公司(6)凝胶成像仪 北京赛智创业科技有限公司(7)电泳仪及电泳槽Power Supply PAC300 BIORAD(8)振荡器XHDVORTEX MIXER(9)K5600超微量紫外分光光度计 北京凯奥科技发展有限公司(10)低温合式高速冷冻离心机(Neofuge 13R型)上海力申科学仪器有限公司(11)逆转录PCR机 杭州博日有限公司(12)梯度PCR仪 杭州博日有限公司12主要试剂及耗材(1)RPMI1640培养液(2)人淋巴细胞分离液(3)氯仿(4)异丙醇(5)75乙醇(6)RNAiso Plus(7)两步法嵌合荧光RTPCR试剂盒(8)核酸分子量标准(Marker)(9)7 I物及GAPDH(10)Tip头:10ul、200ul、1000ul(1 1)15ml Ep管、200ulPCR反应管(12)超纯水(13)琼脂糖(14)loading buffer缓冲液:6X溴酚兰(15)GELRED染料北京索莱宝生物技术有限公司北京索莱宝生物技术有限公司南京化学试剂有限公司南京化学试剂有限公司南京化学试剂有限公司宝生物工程(大连)有限公司宝生物工程(大连)有限公司宝生物工程(大连)有限公司上海生物工程有限公司合成美NAxygen公司美mAxygen公司青医附院中心实验室美国基因有限公司宝生物工程(大连)有限公司宝生物工程(大连)有限公司青岛大学硕士学位论文(16)荧光定量反转录试剂盒(DRR037A) 宝生物工程(大连)有限公司13研究对象:131过敏性紫癜组:为2011年11月至2012年11月就诊于青岛大学医学院附属医院急性期的患儿,所有患儿依据2005年EULARPReS过敏性紫癜诊断标准确诊1191。男33例,女31例,年龄833O岁。根据患儿就诊或入院后是否存在血尿或和蛋白尿分为有、无肾损害HSP两组,其中有肾损害(HSPN)组28例,男15例,女13例,年龄为9430岁;无肾损害HSP组36例,男18例女18例,年龄7527岁。所有患儿均为首次发病,标本采集前未使用任何糖皮质激素和免疫抑制剂。均征得受试者家属同意,并获医院医学伦理委员会讨论通过。132正常对照组:30例,为健康体检儿童,其中男16例女14例,年龄为8528岁。病例组与对照组在性别及年龄比较无显著差异,具有可比性。14研究方法141标本采集:清晨状态、无菌条件采取外周静脉血2-3ml,肝素钠抗凝。142外周血单个核细胞(PBMC)的制备:在严格无菌操作下采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,所有器皿均经高压蒸汽灭菌。(1)抗凝血中加入等体积RPMI1640培养液稀释混匀。(2)用吸管吸取稀释血液,倾斜含有淋巴细胞分离液的离心管45。,在距离淋巴细胞分离液面上约lcm处,沿管壁慢慢加入,以2:1比例将稀释血液悬浮于淋巴细胞分离液上,室温下用低速离心机以2000rmin离,1)12分钟。(3)离心完成后液体分四层,上层为血浆,第二层为白膜层(PBMC层),第三层为淋巴细胞分离液,下层为红细胞及粒细胞。用吸管轻至白膜层后沿管壁吸出白膜层,移至15ml离心管中。(4)用2倍的RPMI1640培养液混匀,以2000rmin离心lO分钟,弃去上清,再加入2倍的RPMIl640培养液混匀,以2000rmin离心5分钟。(5)末次离心后,弃去上清,加入RNAiso Plus lml振荡混匀,静置5min后,于80冰箱保存备用。143 Trizoi RNA提取方法(1)使用1000u l枪取待测样本放入离心管中,加入300ul氯仿后用手剧烈振荡混匀约15s。然后室温静置5min后于低温离心机在4。C下以12000rmin离,tM5min。(2)离心完成后液体分3层,上层为无色的上清液,中间为白色蛋白层,有颜色的4材料与方法下层为有机相,吸取500ul上清液至离心管中,然后加入与上清液等体积的异丙醇

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