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儿童过敏性紫癜外周血单个核细胞TLR2和MyD88 mRNA表达初步观察儿童过敏性紫癜外周血单个核细胞TLR2和MyD88 mRNA表达初步观察 -- 260 元

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儿童过敏性紫癜外周血单个核细胞TLR2和MyD88mRNA表达初步观察摘要目的探讨Toll样受体2Tolllikereceptor2,TLR2、髓样细胞分化蛋白88Myeloiddifferentiationprimaryresponsegene88,MyD88、肿瘤坏死因子aTumorNecrosisFactoralpha,TNFamRNA在过敏性紫癜HenochSchSnleinpurpura,HSP患儿外周血单个核细胞的表达,从基因水平揭示TLR2、MyD88、TNFQ在HSP患儿的免疫发病机制中的可能作用。方法选取2011年11月至2012年11月就诊于青岛大学医学院附属医院急性期HSP患儿64例为病例组,其中合并肾损害HSP组28例,无肾损害HSP组36例,健康对照组为我院健康体检儿童30例。无菌条件下采用密度梯度离心法获取外周血单个核细胞Peripheralbloodmononuciearcells,PBMC,采用荧光定量PCR检测外周血单个核细胞TLR2、MyD88、TNFⅡmRNA的表达。两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析和LSD~t检验,TLR2、MyD88、TNFQmRNA表达变化相关性采用spearman秩相关分析。结果1HSP患儿PBMCTLR2、MyD88和TNFQmRNA表达量与正常对照组比较均显著增高pO.05。结论HSP患儿PBMcTLR2、MyD88、TNFdmRNA表达明显升高,有肾损害组也明显高于无肾损害组,提示PBMCTLR2和MyDSSmRNA的过表达可能参与HSP和紫癜性肾炎的免疫发病机制。硕士研究生指导教师孙燕儿科学张秋业教授关键词过敏性紫癜Toll样受体2髓样细胞分化蛋白88肿瘤坏死因子一aTheexpressionpreliminaryobservationofTLR2,MyD88andTNFamRNAfromPeripheralbloodmononuclearcellsinchildrenwithHenochSchSnleinpurpuraAbstractObjectiveTorevealthepossibleroleofTolllikereceptor2,Myeloiddifferentiationprimaryresponsegene88andTumorNecrosisFactoralphainimmunologicalpathogenesisofHenochSchOnleinpurpurafromgenelevelbystudyingtheexpressionlevelsofTLR2.MyD88andn、IF吨mRNAfromperipheralbloodmononuclearcellsinchildrenwithHenochSchOnleinpurpura.MethodssixtyfourHSPpatientsinacutephaseweresubsequentlyenteredintostudygroupwhowerehospitalizedinDepartmentofPediatrics,TheAffiliatedHospitalofQingdaoUniversityMedicalCollage,fromNovember2011toNovember2012.TheHSPgroupWasdividedintotwogroups,includingpatients谢threnaldamagen236andthosewithoutrenaldamagen28.№heahbychildrenconstitutedthecontrolgroupwhowerecarriedonthehealthycheckupinthehospital.PeripheralbloodmononuclearcellsPBMCwereisolatedbydensitygradientcentrifugationmethodinasepticconditions.RealtimefluorescentquantitativepolymerasechainreactionwasusedtomeasuretheexpressionlevelsofTLR2,MyD88andTNFQmRNAfromPBMC.TheStudentttestWasusedforcomparisonbetweentheHSPpatientsandthecontr01.TheonewayanalysisofvarianceandLSDttestwereusedtodeterminethedifferencesamonggroups.ThespearmanSrailcorrelationanalysisWasusedforthecorrelationamongtheexpressionlevelsofTLR2,MyD88andTNFQmRNA.Results①Comparedwiththecontrolgroup,theexpressionlevelsofTLR2,MyD88andTNF0【mRNAfromPBMCwereupregulatedsignificantlyinchildrenwithHSPpO.05.ConclusionsT11cexpressionlevelsofTLR2.MyD88andTNF.oanRNAfromPBMCwereremarkablyincreasedinchildren、析t11HSP,andtheseweresignificantlyhigherinpatientswithrenaldiseasethanthosewithoutrenaldisease.OurfindssuggestthatoverexpressionofTLR2andMyD88mRNAfromPBMCmayparticipateinimmunologicalpathogenesisofHenochSchOnleinpurpuraandHcnochSch6nleinpurpuranephritisHSPN.PostgraduatestudentSunYanpediatriesDirectedbyProf.ZhangQiuyeKeywordsHenoehSch6nleinpurpuraTolllikereceptor2Myeloiddifferentiationprimaryresponsegene88TumorNecrosisFactoralpha目录引言..1第一章材料与方法31.1主要器材31.2主要试剂31.3研究对象41.4研究方法41.5统计学处理.8第二章结果92.1TLR2、MyD88、TNFamRNA表达结果稳定性与可靠性评价.92.2HSP患LPBMCTLR2、MyD88、TNFQmRNA的表达..112.3有、无肾损害HSP患儿PBMCTLR2、MyD88、TNFQmRNA的表达比较..112.4HSP患儿PBMCTLR2、MyD88、TNFamRNA表达的相关性分析.12第三章讨论143.1TLRs结构、分布、配体、信号通路及功能特性.143.2HSP患儿PBmCTLR2和MyD88mRNA表达与意义探讨15结论..17参考文献.18综述..2l综述的参考文献.29攻读学位期间的研究成果..32致谢..33学位论文独创性声明学位论文知识产权权属声明..34引言儿童过敏性紫癜外周血单个核细胞TLR2和MyDSBmRNA表达初步观察引言过敏性紫癜Henoch.SchOnleinpurpura,HSP是一种主要以IgA免疫介导的系统性小血管炎,临床主要表现为非血小板减少性可触性紫癜、腹痛、关节肿痛、血尿、蛋白尿。根据不同的临床症状及体征,可将HSP分为皮肤型、腹型、肾型、关节型、混合型等,其中肾型的病情多较严重且预后较差【I】。肾损害多发生在出现典型皮疹4.6周内,据文献报道20%.100%的HSP患儿会有肾损害发生2】,发病率的差异可能与判断标准不同有关。11%.35%的紫癜性肾炎Henoch.Schdeinpurpuranephritis,HSPN患儿会发展为d,JL慢性肾功能衰竭【3】,因此肾损害的发生与否及其损害程度直接决定HSP的预后。HSP病因及发病机制尚未完全明确。常见的病因中感染居首,其中20.50%HSP患儿急性期通过血清学或细菌培养发现为A组13溶血性链球菌感染,其抗原肾炎相关的纤溶酶受体nephritis.associatedplasminreceptor.NAPlr在HSPN发病中起一定作用l锎。其它较常见的细菌包括幽门螺杆菌、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、肺炎链球菌等,支原体、柯萨奇病毒、EB病毒、微小病毒B19等可能与HSP发病有关。其它病因为多种高蛋白类食物、某些药物、接种疫苗、及遗传因素等可能与HSP发病有关。HSP发病机制可能涉及体液免疫及细胞免疫的紊乱,同时有细胞因子及炎症介质的参与。HSP患儿体液免疫紊乱主要是B淋巴细胞多克隆活化,患儿血清IgA水平增高,出现以IgAl为主的免疫复合物沉积于小动静脉及毛细血管,造成皮肤、胃肠、肾脏等血管内皮的损伤。IgAl氧连接枢纽区的糖基化异常及TgAl分子清除障碍是导致Igg免疫复合物沉积的主要原因781。HSP患儿细胞免疫紊主要表现为急性期外周血T淋巴细胞亚群异常,CD4T淋巴细胞数量降低,CD8T淋巴细胞数量增高,CD4T/CD8T比值下斛9】Thl/Th2细胞失衡,n12、Thl7细胞的优势活化及CD4CD25Treg的减少可能参与HSP的发生发展【10.11J。相关国内外研究文献显示HSP患儿急性期血清TNF.a、IL.6、IL.8、转化生子因子TGF.B、血管内皮生长因子ⅦGF等炎性介质显著升高,而且HSPN患儿血清耵师.d水平显著高于HSP患儿【1216Ha等研究揭示在HSP患儿急性期显著升高的血清n吓.Q可能引起肾小球细胞功能及形态学上的变化,且血清n虾.d水平可作为HSP疾病活动和肾脏严重受损的监测指标【17】。综合以往资料显示,HSP及HSPN的发生发展过程存在明显的免疫异常、免疫紊乱状态,而导致这种免疫失调的初始环节目前尚不清楚。Toll样受体Toll.1ikereceptor,TLR是近年来发现的一类模式识别受体,通过识l青岛大学硕士学位论文别病原相关分子PAMP,激活天然免疫。Ⅱ。R信号还通过上调抗原提呈细胞APC表面共刺激分子及促进APC分泌的炎症细胞因子调节获得性免疫。TLR信号通路包括髓样细胞分化蛋白88MyD88依赖性或MyD88qE依赖性途径激活核转录因子.KBNF.KB、干扰素调节因子3IRF3诱导细胞因子及趋化因子基因转录ll8】。近年来国内外研究显示,TLRs信号通路在自身免疫性疾病、超敏反应、炎症反应、细胞凋亡及移植排斥反应中发挥重要的作用。本研究目的旨在检测T011样受体2TU匕、髓样细胞分化蛋白88MyD88、肿瘤坏死因子QTNF.QmRNA在HSP患JLI周血单个核细胞的表达。从基因水平揭示TLl也和MyD88表达异常在HSP患儿的免疫发病机制中可能作用。2材料与方法1.1主要器材第一章材料与方法1sw.CJ.1F型净化工作台苏州净化设备厂2Rotorgene480荧光定量PCR仪瑞士Roche公司3LD5.2A型低速离心机北京医用离心机厂4925型超低温冰箱最低达.80℃美国FormaScientific公司5移液器法mEppendorf公司6凝胶成像仪北京赛智创业科技有限公司7电泳仪及电泳槽PowerSupplyPAC300BIO.RAD8振荡器XH.DVORTEXMIXER9K5600超微量紫外分光光度计北京凯奥科技发展有限公司10低温合式高速冷冻离心机Neofuge13R型上海力申科学仪器有限公司11逆转录PCR机杭州博日有限公司12梯度PCR仪杭州博日有限公司1.2主要试剂及耗材1RPMI.1640培养液2人淋巴细胞分离液3氯仿4异丙醇575%乙醇6RNAisoPlus7两步法嵌合荧光RT.PCR试剂盒8核酸分子量标准Marker97I物及GAPDH10Tip头10ul、200ul、1000ul111.5mlEp管、200ulPCR反应管12超纯水13琼脂糖14loadingbuffer缓冲液6X溴酚兰15GELRED染料北京索莱宝生物技术有限公司北京索莱宝生物技术有限公司南京化学试剂有限公司南京化学试剂有限公司南京化学试剂有限公司宝生物工程大连有限公司宝生物工程大连有限公司宝生物工程大连有限公司上海生物工程有限公司合成美NAxygen公司美mAxygen公司青医附院中心实验室美国基因有限公司宝生物工程大连有限公司宝生物工程大连有限公司青岛大学硕士学位论文16荧光定量反转录试剂盒DRR037A宝生物工程大连有限公司1.3研究对象1.3.1过敏性紫癜组为2011年11月至2012年11月就诊于青岛大学医学院附属医院急性期的患儿,所有患儿依据2005年EULAR/PReS过敏性紫癜诊断标准确诊1191。男33例,女31例,年龄8.3±3.O岁。根据患儿就诊或入院后是否存在血尿或/和蛋白尿分为有、无肾损害HSP两组,其中有肾损害HSPN组28例,男15例,女13例,年龄为9.4±3.0岁无肾损害HSP组36例,男18例女18例,年龄7.5±2.7岁。所有患儿均为首次发病,标本采集前未使用任何糖皮质激素和免疫抑制剂。均征得受试者家属同意,并获医院医学伦理委员会讨论通过。1.3.2正常对照组30例,为健康体检儿童,其中男16例女14例,年龄为8.5±2.8岁。病例组与对照组在性别及年龄比较无显著差异,具有可比性。1.4研究方法1.4.1标本采集清晨状态、无菌条件采取外周静脉血23ml,肝素钠抗凝。1.4.2外周血单个核细胞PBMC的制备在严格无菌操作下采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,所有器皿均经高压蒸汽灭菌。1抗凝血中加入等体积RPMI.1640培养液稀释混匀。2用吸管吸取稀释血液,倾斜含有淋巴细胞分离液的离心管45。,在距离淋巴细胞分离液面上约lcm处,沿管壁慢慢加入,以21比例将稀释血液悬浮于淋巴细胞分离液上,室温下用低速离心机以2000r/min离,112分钟。3离心完成后液体分四层,上层为血浆,第二层为白膜层PBMC层,第三层为淋巴细胞分离液,下层为红细胞及粒细胞。用吸管轻至白膜层后沿管壁吸出白膜层,移至15ml离心管中。4用2倍的RPMI.1640培养液混匀,以2000r/min离心lO分钟,弃去上清,再加入2倍的RPMIl640培养液混匀,以2000r/min离心5分钟。5末次离心后,弃去上清,加入RNAisoPluslml振荡混匀,静置5min后,于.80℃冰箱保存备用。1.4.3TrizoiRNA提取方法1使用1000ul枪取待测样本放入离心管中,加入300ul氯仿后用手剧烈振荡混匀约15s。然后室温静置5min后于低温离心机在4。C下以12000r/min离,tM5min。2离心完成后液体分3层,上层为无色的上清液,中间为白色蛋白层,有颜色的4材料与方法下层为有机相,吸取500ul上清液至离心管中,然后加入与上清液等体积的异丙醇后上下颠倒离心管混匀,于室温下静置10min后置于低温离心机中,在4℃下以12000r/mm离,,10min。3离心完成后取出离心管弃去上清,向沉淀中贴壁加入lml的75%异醇,轻轻上下颠倒清洗沉淀,置于低温离心机中在4℃下以12000r/min离心5min。4离心后取出离心管弃上清保留沉淀,于室温下静置干燥约5rain,,加入15ul的超纯水中轻轻吹打以完全溶解沉淀。1.4.4RNA浓度及纯度的测定1打开取样臂,以移液枪吸取超纯水l¨l滴加到检测平台上,放下取样臂,再打开取样臂后用干净的吸水纸擦去检测平台上的超纯水,连续两次清洗检测平台,第三次同样用移液枪加入超纯水校准仪器。2打开取样臂,用干净的吸水纸擦去检测平台上的超纯水,以移液枪吸取样品lpl滴加到检测平台上,放下取样臂,点击软件界面上的Measure按钮,即可得出样品参数吸光度和浓度和图表。记录待测样品的RNA浓度及OD260/OD280,所有标本的OD260/OD280比值是在1.8.2.0之间,低于此值者表明其含有蛋白质杂质,用氯仿重新提纯,高于此值表明提取样本RNA降解,需弃用该样品。1.4.5逆转录获得模板eDNA1按下列反应体系配制I江反应液反应液配制在冰上进行试剂使用量终浓度5xPrimeScripBuffe炳rreal10l皿timePrimeScriptRTEnzymeMixI2.5皿一OligodTPrimer501.tM2.5汕Random6me似lOOI_avi2.5uLTotalRNAxRNaseFreeH20upto50止22幸2反应体系可按需求相应放大,根据所测的样本RNA浓度,10ul反应体系可最大使用500ng的TotalRNA,得出所加TotalRNA体积,再加IⅢ嬲eFreeI12O至50ul,震荡混匀后室温离心使反应液全部沉于管底。5旧讲仃nn却卿
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vyyolyg827上传于2014-03-19

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