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儿童急性淋巴细胞白血病CTLA4基因多态性研究儿童急性淋巴细胞白血病CTLA4基因多态性研究 -- 260 元

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摘要目的探讨儿童急性B淋巴细胞白血病CTLA一4基因多态性分布特点。方法分别对32名高危、54标危急性B淋巴细胞性白血病患儿及112名正常对照者采取聚合酶链式反应PCR及产物直接测序方法检测CTLA4基因调控位点启动子318、外显子149及3UTRCT60基因型,比较各组间基因型频率及等位基因频率的差异。结果①ALL318位点TC、T1基因型频率显著高于正常组z28.799,PO.012,T等位基因频率显著高于正常对照组Z勾.527,P0.002②ALL高危组一318位点Tc、T,r基因型频率显著高于标危组z‰.24,P0.044,T等位基因频率显著高于标危组Z26.599,P0.01。③三组间49位点基因型及等位基因频率分布差异无统计学意义Z22.101,P0.35z2卸.205,P0.651。④ALLCT60位点从基因型频率显著低于正常对照Z26.365,P0.041,A等位基因频率亦明显低于对照组Z26.761,Po.009⑤ALLCT60位点基因型及等位基因频率在高标危患儿中的分布差异无统计学意义Z22.625,PO.269Z2_2.923,P0.087。结论①ALL患儿CTLA_4基因.318位点TT、TC基因型及T等位基因频率显著高于对照,调控CⅡA_4在T淋巴细胞表面表达增强,T细胞活化抑制信号增强,T细胞活化受抑,可能与白血病发生存在一定关系②高危组.318位点TT、TC基因型及T等位基因频率显著高于标危组,高危组CⅡA_4表达调控增强,T细胞活化抑制信号增强,可能是导致ALL治疗不同预后的重要因素之一斛49位点基因型及等位基因频率在ALL组和正常对照组之间无差异,该位点对ALL患儿CnA_4表达不发挥异常的调控④ALL患儿CT60位点AA基因型及A等位基因频率降低,可能是导致sCTLA4表达降低的主要原因之一。推测低水平的sCTLA4反馈性使膜表面CTLA4表达增强,结果导致T细胞活化抑制信号增强。关键词白血病单核苷酸多态性细胞毒性T淋巴细胞相关抗原_4ABSTRACTObjectiveToinvestigatethecorrelationbetweencytotoxicTlymphocyteantigen4C11LA4genepolymorphismandchildrenwithacutelymphoblasticleukemiaALL.MethodsAtotalof86childrenofAL23HR,54SRand112healthycontrolswasselected.UsemeansofpolymerasechainreactionPeRandthePCRproductsequencingtodeterminethegenotype.GenotypeandallelesfrequencyofSNP一318,SNP49andSNPCT60werecomparesamongdifferentgroups.ResultsQThefrCcluencyofTC、TTgenotypeandTalleleinALLchildrenatSNP318positionwerestatisticallyhigherthancontrolsZ≮8.799,p司.012Zz_9.527,Po.002.②InHRgroup,thefrequencyofTC、ITgcnotypcatSNP318positionwasstatisticallyhigherthanSRgroupz26.24,P0.044z26.599,P0.01.③TherewasnosignificantlydifferenceingenotypeandalleledistributionofSNP49positionamongtheHRpatients、SRpatientsandcontrolgroup.Z22.101,Po.35Zzo.205,P0.651④ThefrequencyofAAgenotypeandAalleleinALLchildrenatSNPCT60position嗍significantlylowerthancontrolsZ26.365,P0.041z26.761,P0.009.ThegenotypeandalleledistributionofSNPCT60positionbetweendifferentclinicalriskgroupswerenosignificantlydifferentz22.625,P0.269Z22.923,P0.087.Conclusion①舡aresultoftheincreasedfrequencyofTC、TTgenotypeandTalleleatSNP.318,刽LLchildrensynthesizedmoreCn。A.4todelivertheinhibitivesigned,andthisleadtorestraintofTcellactivation.室SuchdifferenceatSNP一318positionwasobviousinHRchildren.③neSNP49positionisprobablynotthemainregulatingpo砬inALL.DThedecreaseofAallelefrequencyatSNPCT60positionresultinthelowexpressionofsCTI。A4,whichmaystimulatehighexpressionofmembraneC11LA4asfeedback.KeywordsLeukemmSingleNucleotidePolymorphismsCytotoxicTLymphocyteassociatedAntigen4目录弓I言..1第l章材料与方法...31.1主要试剂31.2主要仪器31.3主要溶液配制41.4研究对象41.4.1病例组case。一4l4.2对照组contr01.51.4.3病例组及对照组年龄分布比较51.4.4样本收集51.5实验方法~一1.5.1全血标本模板DNA的提取。61.5.2引物设计与合成.71.53聚合酶链式反应PCR..81.5.4PCR产物鉴定和测序.91.6统计学处理.9第2章结果102.1CnA_4基因启动子.318T/C多态性位点结果分析.102.1.1CnA4基因启动子.3181佗位点PCR扩增结果102.1.2C1rIA.4基因启动子.3181/C多态性位点测序图谱及分型结果102.2C1rIA_4基因外显子149A/G多态性位点结果分析122.2.1C1rIA4基因外显子l49A/G位点PCR扩增结果122.2.2CTLA4基因外显子149CA/G多态性位点测序图谱及分型结果.122.3CTLA4基因CT60A/G多态性位点结果分析142.3.1C11A4基因CT60A/G位点PCR扩增结果...142.3.2C1lA4基因CT60A/G多态性位点测序图谱及分型结果152.4统计学分析结果.172A.1遗传平衡性检验172.4.2CnA.4基因SNP一318、49、CT60多态性与急性淋巴细胞白血病单因素分析.172.4.3C1rIA4基因SNP318、49、CT60多态性与急性淋巴细胞白血病不同临床危险度的单因素分析.20第3章讨论24结论.28参考文献29综j苤.32攻读硕士期间发表的论文.41附录.42致谢.43学位论文独创性声明..44学位论文知识产权权属声明..44青岛大学硕士学位论文引言急性淋巴细胞白血病是儿童时期最常见的恶性肿瘤之一,发病率约34/10万,每年发病呈上升趋势n,。白血病的病因和发病机制至今尚未完全阐明。先天性因素、病毒感染HTLv1、EB病毒、化学因素苯、烷化剂、物理因素电离辐射等堙1是白血病常见病因。目前认为多种致病因素作用于骨髓中的造血前体细胞,使其遗传背景发生改变,随后通过多种机制最终导致白血病的发生及发展。在肿瘤的发生发展过程中,免疫系统起着重要作用,免疫系统可以识别和清除突变的恶性肿瘤细胞,同时也会筛选出新的肿瘤突变体。免疫系统和肿瘤细胞之间的相互作用分为3个阶段嗍,即清除、均衡和逃逸。肿瘤发生早期,机体免疫系统识别恶变的细胞并且通过多种途径予以杀伤和清除但如果机体不能完全清除肿瘤细胞,则免疫系统对恶变细胞实施的免疫选择压力就会使弱免疫原性肿瘤细胞得以存活,从而进入免疫均衡阶段。新的肿瘤细胞变异体不断跨过平衡期的免疫抑制作用不断增值,就形成了临床肿瘤,即肿瘤细胞得以免疫逃逸。免疫逃逸的机制涉及肿瘤细胞自身的改变及机体免疫功能障碍等。肿瘤细胞的改变包括Fas/FasL抵抗、下调肿瘤抗原表达、自发分泌细胞因子TGFB、ILIO、IL6等等H1。机体抗肿瘤免疫的主力是细胞免疫,其中T细胞为主要的效应细胞。T淋巴细胞的正常活化是其增殖和发挥生物学活性的前提,T细胞的激活依赖于双信号,T细胞活化的第一信号主要来自T细胞抗原识别受体Tceilreceptor,TCR与抗原肽一删C分子复合物的特异性结合,此过程为抗原识别。第二信号又称共刺激信号,是由抗原递呈细胞Antigenpresentingcells,APC和T细胞表面的共刺激分子提供嘲。在缺乏共刺激时,T细胞识别抗原后不能有效增殖,且会进入无应答状态,从而妨碍抗肿瘤免疫的产生。马肖荣等№1研究发现血液恶性肿瘤细胞删C分子的表达基本是正常的,说明肿瘤细胞将MHCAg提成给T细胞的功能基本正常,特异性第一信号系统的功能是基本正常的绝大多数病例存在B71缺陷导致的第二信号缺乏可能是血液肿瘤细胞逃避宿主免疫监视的机制之一。另有大量研究显示口1白血病细胞存在B7分子的异常表达。体外研究证实博1导入B7基因的肝癌细胞具有更强的免疫原性,更能有效的刺激CTL的增殖。但是共刺激信号CD28/CTLA一4少有研究。位于T细胞上的CD28/CTLA一4与APC上的B7B71,B72是起主要作用的协同刺激分子。与CD28分子不同,cTLA一4与B7家族分子结合后传递负调节信号,通过介导T细胞凋亡、抑制IL2分泌、控制细胞周期及远端信号模式等p1途径下调或引言终止T细胞的应答,抑制T细胞增值、活化。CTLA4对T细胞增生的这种负性调节作用,在介导自身耐受、防止自身免疫病、防止移植排斥反应及调节机体免疫机能,抗肿瘤、抗过敏、抗感染等方面发挥重要作用。大量研究显示肺癌、胃癌、乳腺癌n01别等恶性肿瘤性疾病外周血T细胞CTLA一4表达较对照组明显升高,我们的前期研究显示急性淋巴细胞性白血病患儿T淋巴细胞CTLA4过度表达,这均提示CTLA4的过度表达从而传递的过强的抑制性信号可能是肿瘤发生发展的机制之一。C1.LA一4的表达受基因的调控,基因通过赋予人们对不同疾病的抵抗力,影响机体与环境因素的相互作用,对疾病的发生发展起重要作用。SNP是由美国麻省理工学院MIT人类基因组研究中心在1996年首先提出的,是继限制性片段长度多态性restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP、简单串联重复序simpletandemrepeat,STR之后一种新型的分子标记。SNP广泛存在于基因组中,数量大且比较稳定,其对疾病易感性、药物治疗效果有重要影响。大量研究显示,CTLA一4基因启动子及外显子1的基因多态性影响CTLA一4分子的表达。当CTLA4启动子318位点为胸腺嘧啶T,外显子1第49位点为腺嘌呤A时,细胞表达的CTLA4水平增高u引。CTLA4外显子l多态性还与CTLA一4的功能有关,CTLA一4外显子l中G等位基因频率增高,CTLA一4的抑制功能降低n钔。CT60位点决定了可溶性CTLA4sCTLA4相对于全长CTLA4flCTLA4的量,尤其是纯合子中拥有疾病易感基因型CT60G的个体相对于拥有疾病抵抗基因型CT60A的个体,sCTLA4转录产物的产量要少n引。本课题采用PCR及产物直接测序的技术,通过病例一对照研究,探讨CTLA一4基因启动子一318位点、第1外显子49位点及CT60位点的多态性与儿童急性B淋巴细胞白血病的相关性,从基因调控角度探讨儿童急性B淋巴细胞白血病T淋巴细胞活化的第二信号系统的表达对急性B淋巴细胞白血病发生、发展及预后的影响。2青岛大学硕士学位论文1.1主要试剂第1章材料与方法血液基因组DNA提取试剂盒无水乙醇异丙醇琼脂糖TriSEDTANa2tt20冰醋酸DLI000MARKERPremixExTaqVersion2.0Loadingdyemix.PrimeSTARHSDNAPolymeraseGelred核酸染料1.2主要仪器电子天平普通冰箱超低温冰箱70。C常温离心机迷你离心机微型漩涡混合器微量移液器电热恒温水浴锅干式恒温器天根生化科技有限公司南京化学试剂有限公司南京化学试剂有限公司Biowest公司SIG姒公司SIGMA公司南京化学试剂有限公司TaKaRa公司TaKaRa公司TaKaRa公司Biotium公司Sarrorius公司青岛澳柯玛公司VILBERLoURM公司THERMO公司BIo.1汕公司上海跃进医疗器械厂Eppendorf公司龙口先科仪器杭州奥盛仪器3中国中国中国西班牙美国美国中国日本日本日本美国美国中国美国德国美国中国德国中国中国第1章材料与方法制冰机梯度PCR仪医用微波炉超纯水系统DYY1131电泳仪琼脂糖水平电泳槽k5500超微量分光光度剂1.3主要溶液配制AFIOScotsman公司Eppendorf公司格兰仕公司MILLIPORE公司北京六一仪器厂北京六一仪器厂北京凯奥科技发展公司英国美国中国法国中国中国中国电泳试剂的配制①IOXTAE电泳缓冲液称量Tris碱48.49,加冰醋酸II.42mi,0.5MEDTApH8.020ml,加蒸馏水定容至1000ml。使用时加蒸馏水稀释成lXTAE电泳缓冲液。②6xloadingbuffer称量3.729EDTANa2H20加入蒸馏水90ml,充分溶解后调PH值至8.0或用20mlO.5mol/LEDTApH8.0,在溶液中加入IgSDS,0.259溴酚兰,0.259二甲苯青,209聚蔗糖Ficoll400,充分混匀后加蒸馏水定容至lOOml,常温贮存备用。③1%、2%琼脂糖凝胶电泳溶液1%琼脂糖凝胶0.49琼脂糖加入40ml1XTAE缓冲液于三角烧瓶中,微波中火煮沸并摇匀3次后取出,冷却至70℃左右,加入3plGelred染料,倒入准备好的电泳凝胶槽中,冷却待凝。30min后拔出梳子,将胶取出。2%琼脂糖凝胶0.89琼脂糖加入40ml1XTAE缓冲液于三角烧瓶中,微波中火煮沸并摇匀3次后取出,冷却至70℃左右,加入3NGelred染料,倒入准备好的电泳凝胶槽中,冷却待凝。30min后拔出梳子,将胶取出。1.4研究对象1.4.1病例组case青岛市妇女儿童医院血液科及青岛大学医学院附属医院小儿血液科2012年3月4青岛大学硕士学位论文至2012年9月收治的86名B系急性淋巴细胞白血病患儿作为实验组,男54例,女47例,年龄1~14岁,平均年龄5.60±3.02岁,其中标危型54例,高危型32例。病例组入选标准所有患儿根据其I临床表现,均进行骨髓细胞形态学、免疫分型、分子遗传学/融合基因及细胞遗传学检查,诊断标准符合儿童急性淋巴细胞白血病诊疗建议第三次修订草案n61,并依照其标准进行临床危险度分型。因纳入研究病例较少,故只分两组不具备任何一项危险因素的为标危组,余为高危组,入组患儿实验前未接受任何糖皮质激素及细胞毒性药物等治疗。所有入选患儿均经监护人知情同意。1.4.2对照组contr01按casecontrol的原则选择年龄与病例组相对应的个体112例,男50例,女62例,年龄1.5~14岁,平均年龄6.30_42.76岁,来自于青岛市妇女儿童医院儿童保健科健康体检儿童。对照组入选标准排除其他肿瘤性疾病、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病,近半年无重大感染性疾病,无糖皮质激素等免疫抑制剂用药史。全部研究对象均无血缘关系。1.4.3病例组及对照组年龄分布比较病例组和对照组年龄分布无显著性差异P0.05,说明两组间具有可比性。1.4.4样本收集根据联合国教科文组织UNESCO、世界卫生组织WHO以及生物伦理委员会IBO等有关关于DNA取样、控制和获得的声明精神的要求,按照知情同意和知情选择的原则收集血样。清晨采集空腹血2ml,EDTA抗凝,一20℃保存。5
编号:201403191807310498    大小:6.34MB    格式:PDF    上传时间:2014-03-19
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vyyolyg827上传于2014-03-19

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