儿童急性淋巴细胞白血病CTLA4基因多态性研究

摘要目的探讨儿童急性B淋巴细胞白血病CTLA一4基因多态性分布特点。方法分别对32名高危、54标危急性B淋巴细胞性白血病患儿及112名正常对照者采取聚合酶链式反应(PCR)及产物直接测序方法检测CTLA-4基因调控位点启动子-318、外显子1+49及3UTR CT60基因型，比较各组间基因型频率及等位基因频率的差异。结果ALL-318位点TC、T1基因型频率显著高于正常组(z2=8799，P=O012)，T等位基因频率显著高于正常对照组(Z勾527，P-0002)；ALL高危组一318位点Tc、T，r基因型频率显著高于标危组(z24，P=0044)，T等位基因频率显著高于标危组(Z 2=6599，P=001)。三组间+49位点基因型及等位基因频率分布差异无统计学意义(Z2=2101，P=035：z 2卸205，P=0651)。ALL CT60位点从基因型频率显著低于正常对照(Z 2=6365，P=0041)，A等位基因频率亦明显低于对照组(Z 2=6761，P=o009)；ALL CT60位点基因型及等位基因频率在高标危患儿中的分布差异无统计学意义(Z 2-2625，P-O269；Z 2_2923，P=0087)。结论ALL患儿CTLA_4基因318位点TT、TC基因型及T等位基因频率显著高于对照，调控CA_4在T淋巴细胞表面表达增强，T细胞活化抑制信号增强，T细胞活化受抑，可能与白血病发生存在一定关系；高危组318位点TT、TC基因型及T等位基因频率显著高于标危组，高危组CA_4表达调控增强，T细胞活化抑制信号增强，可能是导致ALL治疗不同预后的重要因素之一：斛49位点基因型及等位基因频率在ALL组和正常对照组之间无差异，该位点对ALL患儿CnA_4表达不发挥异常的调控；ALL患儿CT60位点AA基因型及A等位基因频率降低，可能是导致sCTLA-4表达降低的主要原因之一。推测低水平的sCTLA-4反馈性使膜表面CTLA4表达增强，结果导致T细胞活化抑制信号增强。关键词：白血病；单核苷酸多态性；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原_4ABSTRACTObjective：To investigate the correlation between cytotoxic T lymphocyte antigen-4(C11LA-4)gene polymorphism and children with acute lymphoblastic leukemia(ALL)Methods：A total of 86 children of AL“23 HR,54SR)and 1 1 2 healthy controls wasselectedUse means of polymerase chain reaction(PeR)and the PCR product sequencingto determine the genotypeGenotype and alleles frequency of SNP一3 1 8，SNP+49 andSNPCT60 were compares among different groupsResults：QThe frCcluency of TC、TT genotype and T allele in ALL children at SNP3 1 8position were statistically higher than controls(Z8799，p司0 1 2；Z z_-9527，P=o002)In HR group，the frequency of TC、I T gcnotypc at SNP-31 8 position was statisticallyhigher than SR group(z 2=624，P=0044；z 2=6599，P=00 1)There was nosignificantly difference in genotype and allele distribution of SNP+49 position among theHR patients、SR patients and control group(Z 2-2101，P=o35；Z z=o205，P=0651)The frequency of AA genotype and A allele in ALL children at SNP-CT60 position嗍significantly lowerthan controls(Z2=6365，P=0041；z2=6761，P=0009)Thegenotype and allele distribution of SNPCT60 position between different clinical riskgroups were no significantly different(z 2=2625，P-0269：Z 2-2923，P=0087)Conclusion：舡a result ofthe increased frequency ofTC、TT genotype and T allele atSNP3 1 8，刽LL children synthesized more Cn。A4 to deliver the inhibitive signed，andthis lead to restraint of T cell activation(室)Such difference at SNP一3 1 8 position wasobvious in HR childrenne SNP+49 position is probably not the main regulating po砬in ALL(DThe decrease of A allele frequency at SNPCT60 position result in the lowexpression of sCTI。A-4，which may stimulate high expression of membrane C11LA-4 asfeedbackKey words：Leukemm：Single Nucleotide Polymorphisms；Cytotoxic T Lymphocyteassociated Antigen 4目录弓I言1第l章材料与方法!311主要试剂312主要仪器313主要溶液配制414研究对象4141病例组(case)。一4l-42对照组(contr01)5143病例组及对照组年龄分布比较5144样本收集：515实验方法一151全血标本模板DNA的提取。6152引物设计与合成715-3聚合酶链式反应(PCR)8154 PCR产物鉴定和测序916统计学处理9第2章结果1021 CnA_4基因启动子318(TC)多态性位点结果分析10211 CnA4基因启动子31 8(1佗)位点PCR扩增结果10212 C1rIA4基因启动子318(1C)多态性位点测序图谱及分型结果1022 C1rIA_4基因外显子1+49(AG)多态性位点结果分析12221 C1rIA-4基因外显子l+49(AG)位点PCR扩增结果12222 CTLA4基因外显子1+49 CAG)多态性位点测序图谱及分型结果1223 CTLA-4基因CT60(AG)多态性位点结果分析14231 C11A-4基因CT60(AG)位点PCR扩增结果14232 C1lA4基因CT60(AG)多态性位点测序图谱及分型结果1524统计学分析结果172A1遗传平衡性检验17242 CnA4基因SNP一318、+49、CT60多态性与急性淋巴细胞白血病单因素分析17243 C1rIA-4基因SNP-318、+49、CT60多态性与急性淋巴细胞白血病不同临床危险度的单因素分析20第3章讨论24结论28参考文献29综j苤32攻读硕士期间发表的论文41附录42致谢43学位论文独创性声明44学位论文知识产权权属声明44青岛大学硕士学位论文引言急性淋巴细胞白血病是儿童时期最常见的恶性肿瘤之一，发病率约3-410万，每年发病呈上升趋势n，。白血病的病因和发病机制至今尚未完全阐明。先天性因素、病毒感染(HTLv-1、EB病毒)、化学因素(苯、烷化剂)、物理因素(电离辐射)等堙1是白血病常见病因。目前认为多种致病因素作用于骨髓中的造血前体细胞，使其遗传背景发生改变，随后通过多种机制最终导致白血病的发生及发展。在肿瘤的发生发展过程中，免疫系统起着重要作用，免疫系统可以识别和清除突变的恶性肿瘤细胞，同时也会筛选出新的肿瘤突变体。免疫系统和肿瘤细胞之间的相互作用分为3个阶段嗍，即清除、均衡和逃逸。肿瘤发生早期，机体免疫系统识别恶变的细胞并且通过多种途径予以杀伤和清除；但如果机体不能完全清除肿瘤细胞，则免疫系统对恶变细胞实施的免疫选择压力就会使弱免疫原性肿瘤细胞得以存活，从而进入免疫均衡阶段。新的肿瘤细胞变异体不断跨过平衡期的免疫抑制作用不断增值，就形成了临床肿瘤，即肿瘤细胞得以免疫逃逸。免疫逃逸的机制涉及肿瘤细胞自身的改变及机体免疫功能障碍等。肿瘤细胞的改变包括FasFasL抵抗、下调肿瘤抗原表达、自发分泌细胞因子(TGF-B、IL-IO、IL-6等)等H1。机体抗肿瘤免疫的主力是细胞免疫，其中T细胞为主要的效应细胞。T淋巴细胞的正常活化是其增殖和发挥生物学活性的前提，T细胞的激活依赖于双信号，T细胞活化的第一信号主要来自T细胞抗原识别受体(T ceil receptor，TCR)与抗原肽一删C分子复合物的特异性结合，此过程为抗原识别。第二信号又称共刺激信号，是由抗原递呈细胞(Antigen-presenting cells，APC)和T细胞表面的共刺激分子提供嘲。在缺乏共刺激时，T细胞识别抗原后不能有效增殖，且会进入无应答状态，从而妨碍抗肿瘤免疫的产生。马肖荣等1研究发现血液恶性肿瘤细胞删C分子的表达基本是正常的，说明肿瘤细胞将MHC-Ag提成给T细胞的功能基本正常，特异性第一信号系统的功能是基本正常的；绝大多数病例存在B7-1缺陷导致的第二信号缺乏可能是血液肿瘤细胞逃避宿主免疫监视的机制之一。另有大量研究显示口1白血病细胞存在B7分子的异常表达。体外研究证实博1导入B7基因的肝癌细胞具有更强的免疫原性，更能有效的刺激CTL的增殖。但是共刺激信号CD28CTLA一4少有研究。 位于T细胞上的CD28CTLA一4与APC上的B7(B7-1，B7-2)是起主要作用的协同刺激分子。与CD28分子不同，cTLA一4与B7家族分子结合后传递负调节信号，通过介导T细胞凋亡、抑制IL-2分泌、控制细胞周期及远端信号模式等p1途径下调或引言终止T细胞的应答，抑制T细胞增值、活化。CTLA-4对T细胞增生的这种负性调节作用，在介导自身耐受、防止自身免疫病、防止移植排斥反应及调节机体免疫机能，抗肿瘤、抗过敏、抗感染等方面发挥重要作用。大量研究显示肺癌、胃癌、乳腺癌n01别等恶性肿瘤性疾病外周血T细胞CTLA一4表达较对照组明显升高，我们的前期研究显示急性淋巴细胞性白血病患儿T淋巴细胞CTLA-4过度表达，这均提示CTLA-4的过度表达从而传递的过强的抑制性信号可能是肿瘤发生发展的机制之一。C1LA一4的表达受基因的调控，基因通过赋予人们对不同疾病的抵抗力，影响机体与环境因素的相互作用，对疾病的发生发展起重要作用。SNP是由美国麻省理工学院(MIT)人类基因组研究中心在1996年首先提出的，是继限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、简单串联重复序(simpletandem repeat，STR)之后一种新型的分子标记。SNP广泛存在于基因组中，数量大且比较稳定，其对疾病易感性、药物治疗效果有重要影响。大量研究显示，CTLA一4基因启动子及外显子1的基因多态性影响CTLA一4分子的表达。当CTLA-4启动子-318位点为胸腺嘧啶T，外显子1第49位点为腺嘌呤A时，细胞表达的CTLA-4水平增高u引。CTLA-4外显子l多态性还与CTLA一4的功能有关，CTLA一4外显子l中G等位基因频率增高，CTLA一4的抑制功能降低n钔。CT60位点决定了可溶性CTLA4(sCTLA4)相对于全长CTLA4(flCTLA4)的量，尤其是纯合子中拥有疾病易感基因型CT60*G的个体相对于拥有疾病抵抗基因型CT60*A的个体，sCTLA4转录产物的产量要少n引。本课题采用PCR及产物直接测序的技术，通过病例一对照研究，探讨CTLA一4基因启动子一318位点、第1外显子+49位点及CT60位点的多态性与儿童急性B淋巴细胞白血病的相关性，从基因调控角度探讨儿童急性B淋巴细胞白血病T淋巴细胞活化的第二信号系统的表达对急性B淋巴细胞白血病发生、发展及预后的影响。2青岛大学硕士学位论文11主要试剂第1章材料与方法血液基因组DNA提取试剂盒无水乙醇异丙醇琼脂糖TriSEDTA-Na2tt20冰醋酸DLI 000 MARKERPremix Ex Taq Version 20(Loadingdye mix)PrimeSTAR HS DNA PolymeraseGelred核酸染料12主要仪器电子天平普通冰箱超低温冰箱(-70。C)常温离心机迷你离心机微型漩涡混合器微量移液器电热恒温水浴锅干式恒温器天根生化科技有限公司南京化学试剂有限公司南京化学试剂有限公司Biowest公司SIG姒公司SIGMA公司南京化学试剂有限公司TaKaRa公司TaKaRa公司TaKaRa公司Biotium公司Sarrorius公司青岛澳柯玛公司VILBER LoURM公司THERMO公司BIo1汕公司上海跃进医疗器械厂Eppendorf公司龙口先科仪器杭州奥盛仪器3中国中国中国西班牙美国美国中国日本日本日本美国美国中国美国德国美国中国德国中国中国第1章材料与方法制冰机梯度PCR仪医用微波炉超纯水系统DYY1131电泳仪琼脂糖水平电泳槽k5500超微量分光光度剂13主要溶液配制AFIO Scotsman公司Eppendorf公司格兰仕公司MILLIPORE公司北京六一仪器厂北京六一仪器厂北京凯奥科技发展公司英国美国中国法国中国中国中国电泳试剂的配制IOXTAE电泳缓冲液：称量Tris碱4849，加冰醋酸II42mi，05M EDTA(pH80)20ml，加蒸馏水定容至1000ml。使用时加蒸馏水稀释成l XTAE电泳缓冲液。6x loading buffer：称量3729 EDTA-Na2H20加入蒸馏水90ml，充分溶解后调PH值至80(或用20mlO5molL EDTA(pH=80)，在溶液中加入Ig SDS，0259溴酚兰，0259二甲苯青，209聚蔗糖(Ficoll 400)，充分混匀后加蒸馏水定容至lOOml，常温贮存备用。1、2琼脂糖凝胶电泳溶液：1琼脂糖凝胶：049琼脂糖加入40ml 1 XTAE缓冲液于三角烧瓶中，微波中火煮沸并摇匀3次后取出，冷却至70左右，加入3pl Gelred染料，倒入准备好的电泳凝胶槽中，冷却待凝。30min后拔出梳子，将胶取出。2琼脂糖凝胶：089琼脂糖加入40ml 1 XTAE缓冲液于三角烧瓶中，微波中火煮沸并摇匀3次后取出，冷却至70左右，加入3N Gelred染料，倒入准备好的电泳凝