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过敏性紫癜患儿外周血单核细胞TLR2表达及其与Th1和Th2型免疫应答相关性研究过敏性紫癜患儿外周血单核细胞TLR2表达及其与Th1和Th2型免疫应答相关性研究 -- 260 元

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过敏性紫癜患儿外周血单核细胞TLR2表达及其与Thl和Th2型免疫应答相关性研究摘要目的探讨TLR2在过敏性紫癜患JLJb周血单核细胞的表达及其与TM和Th2型免疫应答的相关性,探讨TLR2在HSP发病机制的作用。方法选取2011年10月.2012年11月于我院收治的过敏性紫癜患儿64例为研究对象,分为HSP无肾损害组NHSPN,36例及HSP有肾损害组HSPN,28例,另选取我院儿保科健康查体儿童30例作为正常对照组。采用流式细胞术检测外周血单核细胞TLR2蛋白表达阳性率,实时荧光定量PCR技术检测外周血单核细胞TLR2.mRNA的基因相对表达量,ELISA法检测血浆IFN一小IL.4水平。两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析和LSDt检验,相关分析采用Pearson相关检验进行统计学处理。结果1.HSP患儿外周血单核细胞peripheralbloodmononuclearcells,PBMCTLR2mRNA相对表达量及TLR2蛋白表达率均显著高于正常对照组t4.283。P0.01t75.487,P0.01,HSPN组外周血单核细胞TLR2mRNA相对表达量及TLR2蛋白表达率均明显高于NHSPN组F9.32,P0.05F21.522,P0.012.HSP组血浆IL.4水平显著高于对照组t13.446,P0.01,IFN.Y水平显著低于对照组t14.364,P0.01,IVNv/m一4比值显著低于对照组t7.410,P0.01。3.HSP组CD4T细胞TLR2蛋白表达率TLR2mRNA呈正相关与血浆IL.4水平呈显著正相关与IFN.7/IL.4比值呈显著负相关与血浆IFNy水平不存在相关性。结论1.HSP患儿外周血单核细胞TLR2mRNA及蛋白表达均明显增高HSP有肾损害组患LCb周血单核细胞TLR2mRNA及蛋白表达皆显著高于HSP无肾损害组。2.HSP病儿存在Thl/Th2失衡,Th2优势活化与TLR2蛋白表达升高呈显著相关。3.TLR2活化可能参与了HSP的免疫发病机制,TLR2的过度活化可能与HSP的肾损伤有关。。硕士研究生指导教师关键词过敏性紫癜紫癜性肾炎Toll样受体细胞介素.4IL.4程娜Jh科学常红副教授7干扰素IFNy白StudyontheexpressionofTLR2inperipheralbloodmononuelearcellandthebalanceofThlfrh2inofpatientswithHenochSchnleinpurpuraAbstractobiectiveWestudytheexpressionofTolllikereceptor2TLR2mRNAandproteininperipheralbloodmononuelearcellofchildrenwithHenochSchonleinpurpuraHSP,andtoexploreitsinfluenceonThl/Th2balanceinordertoinvestigatetherolesofTLR2inthepathogenesisofliSP.Methods64childrenwithaclinicaldiagnosisofHenochSch6nleinpurpurawereenrolledinthestudyatPediatricDepartmentoftheAmliatedHospitalofQingdaoUniversityMedicalCollegefromOctober2011toNovember2012,allpatientshadactivediseaseatthetimeofenrollment,whichweredividedinto2groups,36c11ildrenwithnonHenochSchonleinpurpuranephritisNHSPN,28childrenwithHenochSchonleinpurpuranephritisHSPN。30healthyagematchedchildrenservedascontrolsfromC11ildHealthDivisionofthishospital.TLR2mRNArelativeofexpressionlevelonperipheralbloodmononuelearcellsPBMCswasdetectedbyrealtimefluorescentpolymerasechainreactionTLR2proteinexpressionlevelWasdetectedbyflowcytometricanalysis.ThelevelsofIFNvandIL一4inplasmaweredeterminedbyELISA.WeusedOnewayanalysisofvarianceandPearsoncorrelationtestforStatisticalAnalysis.Results1.Comparedwitllthecontrolgroup,theexpressionlevelofTLR2mRNAwereremarkablyincreasedinchildrenwithHSPThelevelofTLR2mRNAinHSPNgroupwashigherthanthatoftheNHSPNgroup.2.ThelevelsofIFNYandtheratioofIFN一3/IL4inplasmaofHSPchildrenweresignificantlylowerthanthoseofthecontrols,respectivelywhilethelevelsofIL一4wereremarkablyhigherthanthoseofnormalchildren3.theexpressionofTLR2mRNAandproteininPBMCsofchildrenwithHSPshowedasignificantpositivecorrelation.TheTLR2proteinexpressionratesofCD4TinHSPchildrenhadpositivecorrelationwimtheplasmalevelsofIL4andnegativecorrelationwiththeratioofIFN7/IL一4,buthadnocorrelationwiththelevelsofIFNY.Conclusions1.InchildrenwithHSP,TheexpressionlevelsofTLR2mRNAandproteininPBMCswereremarkablyincreasedTheexpressionofTLR2mRNAandproteininPBMCsofchildrenwithHSPNshowedsignificantlyhigherthanthatoftheNHSPNgroup2thereiSaimbalaliceofThl/Th2inHSPchildren.andthefunctionofT112relativelyprevailsoverTh1.TheincreaseofTh2functionscorrelatescloselywithhighexpressionofTLR2OilPBMCs.3.TheaberrantactivationofTLI也maybecorrelated、ⅣitllimmunologicalpathogenesisofHSP,theexcessiveactivationofTLR2maybeassociatedwithrenalinjuryofHSR4.TheactivationofTLR2maymediateimmuDepathogenesisofliSPbyupregulationT112immulleresponse.KeywordsHSPHSPNTLR2IFN吖IL一4PostgraduatestudentChengNaPediatricsDirectedbyProfChangHong目录引言...1第一章材料与方法..31.1主要器材....31.2主要试剂....3l3引物...........31.4研究对象及分组....41.5研究方法....41.6统计学处理..9第二章结果.102.1血浆IFNY、IL4水平及IFNyIIL一4比值比较..102.2外周血单核细胞TLR2mRNA及蛋白表达变化.102.3HSP患儿外周血单核细胞TLR2mRNA与TLR2蛋白表达的相关性.1l2.4TLR2蛋白表达与血浆IFNY、IL一4水平及IFNY/IL一4比值的相关性分析.11第三章讨论.143.1HSP发病机制.143.2TLRs与免疫介导.143.3TLRs与相关疾病....153.3TLRs与HSP及HSPN.....16结论.18参考文献19综述.......22参考文献32攻读学位期间的研究成果.35致谢36学位论文独创性声明学位论文知识产权权属声明37引言过敏性紫癜患儿外周血单核细胞TLR2表达及其与Thl和Th2型免疫应答相关性研究引言过敏性紫癜henoehschonleinpurpura,HSP是儿童时期常见的系统性血管炎性疾病,临床表现可累及皮肤、胃肠道、关节,肾脏等多个系统,肾脏受累的严重程度往往直接影响到本病的病程和预后。迄今其病因及发病机制尚未完全阐明。目前认为,感染为主要的发病诱因,发病机制主要为免疫功能紊乱,体液免疫异常表现为B细胞异常活化,导致大量免疫球蛋白增加,尤其是lgA的作用可能在HSP的发病过程中发挥了重要作用细胞免疫异常主要表现有Thl/Th2免疫应答失衡即Thl功能降低,Th2优势活化,Th2类细胞因子中的IL一4、IL.5及IL.6明显增高,而Thl类细胞因子IL.2及IFN一丫分泌减少。此PbT细胞功能改变、细胞因子和炎症介质、易感基因等因素在其发病中也起着重要作用。Toll样受体Toll.1ikereceptor,TLRs蛋白家族是一种I型跨膜蛋白,通过识别病原微生物上的病原模式相关分子,激活细胞内的信号传导机制,最终产生一系列炎症细胞因子释放和启动适应性免疫应答,是连接固有免疫和适应性免疫的桥梁【1】oTLRs主要表达在单核巨噬细胞、中性粒细胞、村突状细胞、淋巴细胞等多种免疫细胞表面。根据TLRs的配体来源不同,我们将其分为外源性配体及内源性配体,外源性配体主要为病原微生物的共有成分,如细菌的脂多糖、脂蛋白、肽聚糖及核酸等内源性的配体主要为宿主凋亡细胞或其裂解产物,如热休克蛋白、细胞外基质及细胞降解的成分等。不同的TLRs识别不同的配体TLR2主要识别细菌的脂蛋白TLR3主要识别病毒RNA和人工合成RNATLR4可以识别细菌脂多糖、多种热休克蛋白、纤维蛋白原、肝素等12】。TLRs的信号途径分泌的细胞因子一方面可以介导炎症反应,使多种炎症细胞因子、趋化因子等表达上调,诱导或加重异常炎症反应,另一方面可以促使T细胞的分化及成熟。有研究发现TLRs可以调节Thl、Th2型免疫应答,不同的TLRs表型、不同的TLRs的配体以及树突状细胞表面共刺激分子的差异,均可使Th细胞向不同的方向分化。FabioRe研究显示TLR2活化可以诱导Th2细胞的分化,TLR4途径可能与Thl细胞的分化有关3J。近年研究发现15ITLRs细胞信号转导在自身免疫性疾病系统性红斑狼疮、川崎病等、炎症反应、超敏反应、细胞凋亡及移植排斥反应等疾病中有着非常重要的作用,TLRs信号通路还介导多种感染性和非感染性肾脏疾病,如尿路感染、病毒性相关性肾炎、IgA肾病、新月体性肾炎、狼疮性肾炎、糖尿病肾病、微小病变性肾病等51。1青岛大学硕士学位论文但TLRs在HSP及HSPN的发病机制中的作用鲜有报道。本研究的目的为,通过检澳,OHSP患儿外周血单核细胞TLR2基因及蛋白表达和HSP患儿血浆中IL4、IFN7水平以及IFN一3/IL.4比值,以观察HSP病I,TLR2表达与辅助性T细胞亚群的功能之间的相关性,为进一步研究儿童HSP的发病机制及为HSP的治疗提供新思路。2第一章材料与方法第一章材料与方法1.1主要器材1SWCJ.1F型净化工作台苏州净化设备厂2LD52A型低速离心机北京医用离心机厂3925型超低温冰箱最低达.80℃美国FormaScientific公司4移液器法国Eppendorf公司5凝胶成像仪北京赛智创业科技有限公司6电泳仪及电泳槽PowerSupplyPAC300B10一RAD7振荡器XH.DVORTEXMIXER8K5600超微量紫外分光光度计北京凯奥科技发展有限公司9低温合式高速冷冻离心机Neofuge13R型上海力申科学仪器有限公司10逆转录PCR机杭州博日有限公司11梯度PCR仪杭州博日有限公司12CytomicsFC500型流式细胞仪美国BeckmanCoulter公司13微量离心机SIGMA1.13型Sigma公司14制冰机AFIO型Scotsman公司15微量电子天平BP3100S和BP21Id型Sartorius公司16立式灭菌器山东新华医疗器械股份有限公司17550型酶标仪BIO.RAD公司f181575型洗板机BIO.m如公司1.2主要试剂1RPMI.1640培养液北京索莱宝生物技术有限公司2人淋巴细胞分离液北京索莱宝生物技术有限公司3RNAisoPlus大连宝生物有限公司4RNAisoReagent总RNA提取试剂75%乙醇三氯甲烷异丙醇超纯水5琼脂糖Agaroseloadingbuffer缓冲液6X溴酚兰50.500bpMarkerGel.redEB荧光定量反转录试剂盒DRR037A两步法嵌合荧光RTPCR试剂盒,大连宝生生物公司6Tip头10ul、200ul、1000ul美亘Axygen公司71.5mlEp管、200ulPCR反应管美雪Axygen公司9磷酸盐缓冲液Phosphatebufferedsaline,PBSebioscience公司10PE标记的抗人TLR4抗体及其同型对照PE标记的MouseIgG2a,KIsotype。3青岛大学硕士学位论文FITC标记的抗人CDl4抗体ebioscience公司11IFNv、IL.4ELISA试剂盒上海森雄科技实业有限公司1.3引物根据Genebank中人的TLR2、GAPDH序列,选定目标片段,并由此设计合成引物上海生工生物工程技术服务有限公司合成,引物序列见表1。引物开盖前先短暂离心,加入DEPC处理的双蒸水稀释到浓度100umol/1,振荡混匀后置于.20。C的冰箱储存备用。表1TLR2及GAPHD的引物序列基因序列产物大小bp复性温度1.4研究对象及分组选取2011年11月至2012年11月在本院收治的过敏性紫癜急性发作期患JL64例作为研究对象,均符合1990年美国风湿病协会制定的HSP诊断标准。其中男性33例,女性31例,年龄在3.14岁之间,所有患儿均为首次发病,近4周内未使用任何糖皮质激素、免疫抑制剂或肝素等药物。根据2009年中华医学会儿科学分会肾脏病学组HSPN的诊治循证指南16】分为过敏性紫癜无肾损害组NHSPN及过敏性紫癜有肾损害组HSPN。其中HSPN组共有28例,NHSPN组36例。另选取我院儿保科健康体检儿童30例作为正常对照组,其中男性17名,女性13名,年龄4.12岁。所有检查均获得受试者家属知情同意后实施,并报医院医学伦理会讨论通过。1.5研究方法1.5.1标本采集患儿入院后次日清晨无菌采取静脉血2.3miami入无菌肝素抗凝管20IU/m1中,另取2m1力11入普通管中,室温下即刻予以进一步处理。1.5.2脐血单个核细胞cBMc的分离与培养采用密度梯度离心法。严格无菌操作,所有器皿均经高压蒸汽灭菌。1抗凝血中加入等体积RPMI.1640培养液稀释,混匀。2用吸管吸取稀释血液,在距淋巴细胞分离液面上约lcm处,沿管壁慢慢加入,以21比例将稀释血液悬浮于淋巴细胞分离液之上,室温下用低速离心机以2000rpm/min离一b12分钟。3离心完成后液体分四层,上层为血浆,第二层为白膜层即CBMC,第三4
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