黄芪对小鼠胰岛炎及胰岛β细胞凋亡的保护作用

黄芪对小鼠胰岛炎及胰岛B细胞凋亡的保护作用中文摘要目的探讨黄芪在体内对胰岛B细胞的保护作用。方法45周龄雄性健康昆明小鼠56只(SPF清洁级)，体质量189-229，随机分为4组：对照组、糖尿病对照组、黄芪小剂量+STZ组和黄芪大剂量+STZ组(以下分别简称为小剂量组和大剂量组)，每组14只(n=14)。所有小鼠适应性饲养一周后，小剂量和大剂量组分别以黄芪生药159(kgd)、309(kgd)连续腹腔注射10天，对照组和糖尿病对照组腹腔注射同体积的生理盐水。之后糖尿病对照组，小剂量组和大剂量组均给予STZ 40mg(kgd)连续腹腔注射5天，诱导TIDM模型，对照组腹腔注射同体积柠檬酸盐缓冲液。STZ腹腔注射后第3天、第7天及之后每周同一时间鼠尾静脉采血测空腹血糖，高于167mmolL可认为糖尿病早期成模。观察3周，摘取眼球取血lml，3000rmin离,blO分钟，留取血清，硝酸还原酶法测血清中一氧化氮(NO)含量；化学比色法测血清中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性；ELSIA法测血清胰岛素水平。分离胰腺置10中性福尔马林固定，常规制作石蜡切片，HE染色制备病理切片观察胰岛炎积分；末端脱氧核苷酰基转移酶介导dUTP切口末端标记(terminaldexynucleotidy transferase(TdT)一mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)法观察胰岛细胞凋亡，监测胰岛细胞凋亡率。结果 黄芪可延缓糖尿病发生，降低糖尿病发病率，降低iNOS活性和N0水平，同时降低胰岛炎积分和胰岛B细胞凋亡率，大剂量组效果更为显著。结论在体内黄芪对胰岛B细胞具有保护作用，与降氐iNOS活性、减少NO生成，抑制胰岛0细胞凋亡有关；改善机体清除自由基能力，可有效预防和延缓糖尿病的发生。硕士研究生：郝萌萌(d,Jg内科)指导老师：陈志红副教授关键词：黄芪；胰岛f3细胞；一氧化氮；糖尿病；凋亡2Protective Effect of Astragalus on Islet p Cells Insulitis andApoptosis in vivoAbstractObjective To investigate the protective effect of astragalus on islet B cells in vivoMethods Fiftysix male kunming mice aged from four to five weeks wererandomly divided into four groups：normal control group，diabetes mellitus group，smalldose group and large dose groupThe study was performed after all the mice wereallowed to acclimate for 1 weeksmall dose and large dose group were pretreatment withdifferent doses of astragalus for 1 0 days，while other groups were inj ected with saline ofthe same volume witll the same methodThen diabetes mellitus group。small dose groupand large dose group received intraperitoneal injection of strptozotocin in order to inducediabetic mellituswhile the normal control group were inj ected、ith equal volume ofcitrate buffer liquid with the same methodBood glycemia were measured at the sametime，three days，seven days，and once a week after inj ection of streptozotocinHigherthan 1 67mmolL is regarded as early diabetes modelsThree weeks later。all mice werekilled，collected serum which isolated from blood sampled by eyeball extirpating，serumnitric oxide(NO)was measured by the nitratase method，the activity of induced nitricoxide synthase(iNOS)Was measured by chemical colorimetric method，and insulin wasdetected by ELISA methodIsolation of pancreata，fixed in 1 0neutral buffered formalinovernight，embedded in paraffin，and sectionedInsulitis grades was measured fordetermination of assayed according to pancreatic histologyApoptosis Was measured byusing a terminal dexynucleotidy transferase(TdT)一mediated dUTP nick end labeling(TUNEL)assayResults Pretreatment with large dosage astragalus，the onset of diabetes mellitusWas delayed，and the incidence of diabetic mellitus Was significantly reducedMeantime，the activity of iNOS was significantly inhibited，and then NO level was significantlydeclined，insulin in serum show a higher degree，the insulitis score and apoptosis of pcells was also significantly decreasedConclusions Astragalus Can protect mice islet D cells in vivo，which is associatedwith its inhibition the iNOS activity,reduction NO generation，and then decreasing p cellsinsulitis and apoptosisTherefore，improving the body free radicals scavenger ability Canprevent and delay the occurrence of diabetic mellitusPostgraduate student：Hao Mengmeng(Pediatrics)Directed by ProfCHEN ZhihongKey words： Astragalus；Islet p cells；Nitric oxide；Diabetes mellitus；Apoptosis；3目录引言6第1章材料和方法811仪器、试剂、耗材8111主要仪器8112主要试剂及耗材8113实验动物8114糖尿病建模药品试剂8115病理切片与与细胞凋亡实验试剂设备8116小鼠血清NO、iNO及胰岛素检测实验设备912昆明小鼠的分组及处理913小鼠血糖、体质量变化及糖尿病发生情况检测1014小鼠血清N0测定1015小鼠血清iNO测定一1016小鼠血清胰岛素水平检测(ELISA法)1117胰腺病理切片制备一1218小鼠胰岛B细胞凋亡检测1319统计学处理15第2章结果1621黄芪对各组小鼠糖尿病发病率的影响1622小鼠血糖、体质量变化1623小鼠血清iNOS活力、NO和胰岛素水平1924黄芪对各组小鼠胰腺炎症程度影响1925黄芪对胰岛B细胞凋亡影响22第3章讨论24结论27参考文献28综述31参考文献374攻读学位期间的研究成果42致谢43学位论文独创性声明、学位论文知识产权权属声明44引言引言1型糖尿病(Type 1 diabetes mellitus，TIDM)是由T淋巴细胞介导的，以胰岛B细胞选择性破坏为特征的自身免疫性疾病。近年来，儿童及青少年发病率明显增加。据统计，我国儿童TIDM发病率大约为O610万，但是我国人口基数较大，因而TIDM患儿绝对数超过100万。儿童TIDM起病急，病情重，病程长，且传统的胰岛素替代治疗不仅不能从根本上保护胰岛B细胞、避免糖尿病并发症的发生，而且花费巨大，严重影响儿童身心健康。目前大量研究表明，自由基在TIDM胰岛B细胞的损伤中发挥重要作用。TIDM患者体内长期处于高血糖状态，高血糖可通过多条代谢途径产生过量活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，包括过氧化氢、羟自由基、一氧化氮(nitricoxide，NO)等。正常情况下，体内可产生少量ROS，参与机体许多重要的生物反应，机体抗氧化系统可催化ROS灭活反应。但是TIDM患者体内，ROS大量蓄积，超过机体自由基清除能力，胰岛B细胞由于葡萄糖代谢极度活跃，且本身抗氧化酶含量甚低，因此更容易受到氧自由基的攻击心叫1。氧自由基一方面通过直接损伤胰岛B细胞，影响胰岛素的合成及分泌而降低胰岛B细胞的功能，另一方面通过诱导胰岛B细胞凋亡，减少胰岛B细胞数目，两者共同加重TIDM患者胰岛B细胞功能衰竭畸一71。因此推断，改善机体自由基清除能力可以有效保护胰岛B细胞，防治TIDM的发生。由于认识到氧自由基对胰岛B细胞的损害机制，目前应用维生素E、维生素C、褪黑激素及微量金属元素等药物改善糖尿病的氧化损伤开始引起人们的关注陋。91。黄芪注射液是一种良好地高效自由基清除剂，研究表明，黄芪可直接清除羟自由基、超氧阴离子及脂质过氧化物等活性氧自由基，诱发糖尿病小鼠胰岛B细胞活性恢复，促进胰岛素及C肽的分泌，降低葡萄糖负荷后小鼠血糖水平，同时亦可以纠正免疫功能紊乱，恢复调节性T淋巴细胞功能，加强其免疫抑制作用，阻断胰岛B细胞的自身免疫性损伤过程n0。131。黄芪本身的抗氧化功能和免疫调节功能为糖尿病的预防和治疗带来新的希望。贺建荣等n钔测定黄芪多糖及黄芪总黄酮对羟自由基及超氧阴离子自由基的表观清除率，结果显示二者均具有较强的清除自由基的功能，且清除能力与浓度呈明显的剂量依赖关系。TIDM发生时出现ThlTh2失衡，Thl型细胞因子分泌增多，进而活化巨噬细胞，产生TNF-Q、IL-I B等细胞因子及氧自由基、N0等，导致胰岛B细胞损伤，最终导致TIDM的发生阻5|。研究表明，凋亡是TIDM胰岛B细胞死亡的主要方式n6。1 7|，自由基可通过直接损伤DNA、诱导细胞膜脂质过氧化、激活细胞凋亡调控基因等多条途径，进一步诱导胰岛B细胞凋亡n8屯0|。高剂量黄芪可显著减少糖尿病大鼠体内Caspase一3阳性表达，从而抑制胰岛B细胞凋亡晗1。6青岛大学硕士学位论文本课题组前期研究已经证明在体外黄芪预处理的胰岛B细胞显现出更好的自由基清除能力和胰岛13细胞保护作用乜2|。本研究首次应用黄芪预免疫改善机体自由基清除能力，观察能否在体内有效保护胰岛13细胞。材料与方法第一章材料与方法11仪器、试剂、耗材111主要仪器(1)电子天平(TP114美国丹佛)：上海台衡仪器仪表有限公司(2)普通显微镜：日本奥林巴斯公司(3)微量移液器：德国艾本德公司(4)低温冰箱(-20)：中国海尔有限公司(5)超净工作台：苏州净化设备厂(6)手术器械：眼科剪刀、组织钳、镊子、小鼠固定板(7)紫外分光光度计：上海旦鼎国际贸易有限公司UV-4802(8)高速台式离心机：德国艾本德公司112主要试剂及耗材(1)5mL Eppendorf管，15mL Eppendorf管，lOPE、200“L、1000ul吸头等一次性实验材料：上海昨非实验室设备有限公司(2)黄芪注射液购自河北省石家庄神威药业有限公司，批号：Z13020999，每lOml含有生药黄芪209(3)2，4，6一三硝基酚(苦味酸)：郑州瑞鑫化工有限公司113实验动物4-5周龄雄性健康昆明小鼠(SPF级)，体质量189一229，购自青岛市药检所，合格证号：SCXK(鲁)20090007。饲养于青岛大学医学院附属医院动物实验中心，饲养环境为SPF级，室温20。C一25。C，湿度40一70，室内明暗交替各12小时。期间自由进食、饮水。114糖尿病建模药品试剂(1)柠檬酸、柠檬酸钠购自青岛海汇生物化学制药有限公司(2)链脲佐菌素(strptozotocin，STZ)购自美国SIGMA公司(3)One Touch II血糖仪及试纸购自美国JohnsonJohnson公司115病理切片与细胞凋亡实验试剂设备(1)生理盐水(2)蛋白酶K溶液R青岛大学硕士学位论文(3)PBS缓冲液(PH-74，O01mmolL)(4)脱氧核苷酰基转移酶介导dUTP切口末端标记(terminal dexynucleotidytransferase(TdT)一mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)试剂盒购自德国Promega公司(5)其他试剂如苏木精、伊红、甲醛、4多聚甲醛、无水酒精、二甲苯、氨水、3H。0。、盐酸酒精、丙酮等均为国产分析纯试剂(6)冰箱：青岛海尔有限责任公司(7)光学显微镜、显微照相装置、计算机自动图像分析仪：日本奥林巴斯公司(8)Finesse325石蜡切片机：德国SHANDON公司(9)JLTA型切片包埋机：上海寰熙医疗器械有限公司116小鼠血清NO、iNO及胰岛素检测实验设备(1)N0试剂盒及iNO试剂盒购自南京建成生物研究所(2)小鼠血清胰岛素ELISA试剂盒购自美国R&D公司(3)酶标仪：上海永创医疗器械有限公司，型号：永gIJ-SM600(4)洗板机：上海永创医疗器械有限公司，型号：永创-SM600(5)离心机：上海贺默仪器科技有限公司，型号：Z 206A型(6)漩涡混合器：上海旦鼎国际贸易有限公司，型号：Vortex Genie2T(7)烘箱：上海昨非实验室设备有限公司，型号：UFE40012昆明小鼠的分组与处理(1)45周龄雄性健康昆明小鼠56只，SPF级，体质量189一229，随机分为4组：对照组、糖尿病对照组、黄芪小剂量+STZ组及黄芪大剂量+STZ组(以下分别简称为小剂量组和大剂量组)。所有小鼠适应性饲养一周后，分别测体重，同时予苦味酸标记。(2)小剂量和大剂量组分别予黄芪生药159(kgd)、309(kgd)连续腹腔注射10天，对照组和糖尿病对照组腹腔注射同体积的生理盐水。各组均于每天同一时间段给药(上午九点至十点)。(3)糖尿病对照组，小剂量组和大剂量组均给予STZ 40mg(kgd)连续腹腔注射5天，诱导T1DM模型，对照组腹腔注射同体积柠檬酸盐缓冲液。STZ配制方法：0imolL柠檬酸溶液：称2109柠檬酸(分子量21014)溶于100mL双蒸水0ImolL柠檬酸三钠溶液：称2949柠檬酸三钠(分子量29410)溶于lOOmL双蒸水q材料与方法01molL柠檬酸盐缓冲液：将01molL柠檬酸溶液和01molL柠檬酸三钠溶液按1：13比例混合，PH 44。注射时用柠檬酸盐缓冲液按1浓度溶解STZ，现用现配，避光保存。按空腹体重注射相应的STZ，所有小鼠需在30分钟内注射完毕。(4)所有小鼠自由进食、饮水(不限量)，观察每日饮水量、尿量，每周监测小鼠体质量及空腹血糖。(5)STZ注射后观察