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基因与蛋白水平抑制B7CD28信号通路对狼疮样肾炎模型的逆转效应及分子机制研究基因与蛋白水平抑制B7CD28信号通路对狼疮样肾炎模型的逆转效应及分子机制研究 -- 260 元

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博士学位论文论文题目基因与蛋白水平抑制B7/CD28信号通路对狼疮样肾炎模型的逆转效应及分子机制研究研究生姓名黄莉指导教师姓名邱玉华专业名称儿科学研究方向自身免疫与共刺激分子论文提交日期2013年3月基因与蛋白水平抑制B7/CD28信号通路对狼疮样肾炎模型的逆转效应及分子机制研究中文摘要I中文摘要B7分子是表达于抗原提呈细胞(antigenpresentingcell,APC)表面的重要协同刺激分子。B7与CD28结合介导的协同刺激作用对初次免疫应答是必需的,若缺乏该信号,T细胞将进入无反应状态(Anergy)或免疫耐受(Tolerance),甚至引起程序性死亡(Apoptosis)。B7/CD28信号通路的过度活化与自身免疫性疾病的发生密切相关。系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus,SLE)是一种自身免疫性疾病,病因至今尚无明确定论。机体以出现T、B细胞活化增强,产生抗核抗体antinuclearantibody,ANA、抗双链DNAdoublestrandedDNA,dsDNA抗体、形成免疫复合物(immunecomplex,IC)以及多种组织器官损伤为其特征。其中狼疮性肾炎(lupusnephritis,LN)是系统性红斑狼疮最常见和最严重的并发症,是导致患者死亡的主要原因。研究表明,B7/CD28信号通路在SLE的发病及病理损伤过程中发挥了重要的作用。RNA干扰RNAinterference,RNAi是由长约2123个核苷酸的双链RNA分子smallinterferingRNA,siRNA介导,以序列特异的方式抑制同源基因表达的一项技术,属于转录后基因沉默posttranscriptionalgenesilencing,PTGS,能够迅速、特异、有效地抑制特定基因的表达。特异性抗体与相应抗原的结合,可影响抗原分子介导的生物信号。B7分子的抑制性抗体通过封闭抗原分子,可阻止或削弱其与CD28结合而转导B7/CD28协同刺激信号,进而抑制T、B细胞的活化与应答。本课题运用化学法(Pristane)诱导类似人类SLE发病过程及临床表现的小鼠(C57BL/6J)狼疮样肾炎模型,对其进行生物学鉴定的基础上,采用B71shRNA慢病毒表达载体及单克隆抗体进行整体干预,通过免疫学、血清学及病理损伤评价等指标的动态变化,探究在基因与蛋白水平抑制B7/CD28信号通路,对狼疮样肾炎模型的形成及病理损伤的逆转效应及其分子机制,以期对SLE疾病模型形成中免疫细胞活化及病理损伤的演变过程进行研究,同时为该类疾病寻找新的特异、中文摘要基因与蛋白水平抑制B7/CD28信号通路对狼疮样肾炎模型的逆转效应及分子机制研究II高效、低毒的生物干预手段。第一部分小鼠B71基因RNA干扰慢病毒载体的构建及对受体细胞膜型B71分子表达的干扰效应研究目的构建小鼠B71shRNA慢病毒表达载体,根据其对受体细胞膜型B71分子表达的干扰效应挑选最佳靶序列。方法选择四条B71基因RNA干扰有效靶序列,合成靶序列的双链DNA,接入LV3(pGLVH1GFPPuro)载体,再与pLV/helperSL3、pLV/helperSL4、pLV/helperSL5质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒,依据绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)的表达水平测定病毒滴度。慢病毒感染L929细胞,运用免疫荧光及流式细胞术,筛选对受体细胞膜型B71分子表达干扰效应较高的靶序列。结果经过测序证实,LV3B71shRNA慢病毒表达载体构建正确,病毒滴度达1108TU/ml,适合感染L929细胞的复合感染(multiplicityofinfection,MOI)值为60,此时感染效率为88.7。四条候选的shRNA模板序列中,B71shRNA256,对L929细胞膜型B71分子的沉默效率最高,达73.2,以此作为最佳靶序列。结论成功构建了小鼠B71基因RNA干扰慢病毒载体,其能有效沉默L929细胞膜型B71分子的表达。第二部分鼠抗人B71分子功能性单克隆抗体的制备及生物学特性研究目的制备鼠抗人B71分子功能性单克隆抗体,并对其生物学特性进行研究。方法运用本科室已成功获取的分泌鼠抗人B71单克隆抗体杂交瘤细胞株,采用体内诱生腹水法进行单抗的制备ProteinG免疫亲和层析法纯化抗体小鼠IgG亚类快速定性试纸鉴定单抗的亚类间接免疫荧光法测定抗体效价流式细胞术分析单抗对人及小鼠细胞膜型B71分子的识别MTT法分析抗体对协同刺激信号的拮抗作用。结果经体内诱生腹水法制备单克隆抗体,小鼠腹水形成阳性率约为80,腹水收获量平均为5.9ml/只小鼠经免疫亲和层析法纯化,腹水中抗体蛋白的得率为2.3mg/ml单抗与细胞株Daudi、Raji、H1299以及小鼠脾脏细基因与蛋白水平抑制B7/CD28信号通路对狼疮样肾炎模型的逆转效应及分子机制研究中文摘要III胞的阳性结合率分别为89.2、92.7、20.6及48.5经MTT法分析,抗体能够阻断B71介导的协同刺激信号,从而抑制L929B71刺激PBTCs的增殖效应。结论成功制备了鼠抗人B71分子功能性单克隆抗体,体外研究结果显示,其能够有效阻断B71介导的协同刺激信号。第三部分小鼠狼疮样肾炎模型的建立及生物学鉴定目的运用化学法建立小鼠(C57BL/6J)狼疮样肾炎模型,并对其进行生物学鉴定。方法68周龄雌性C57BL/6J小鼠30只,随机分为造模组和正常对照组。造模组予一次性腹腔注射Pristane0.5ml/只,正常对照组予一次性腹腔注射生理盐水0.5ml/只。建模后第10天,每组处死5只小鼠,免疫荧光及流式细胞术flowcytometry,FCM分析脾脏中巨噬细胞(CD11b)、树突状细胞(CD11c)、粒细胞(Gr1)及B细胞(CD21)的阳性表达率,同时检测CD21B细胞膜型协同刺激分子CD86及MHCII分子的表达每月定期活体眶经脉丛取血,检测血清中ANA及抗dsDNA抗体水平及采用Albustix试纸法检测尿蛋白量持续观察至8个月时处死小鼠,HE染色观察小鼠肾脏病理损伤,直接免疫荧光法分析肾脏免疫复合物(IC)的沉积。结果1.建模后第10天,脾脏中Mφ、DC、粒细胞及B细胞均出现不同程度的活化,其阳性表达率分别为7.27±0.85、4.72±0.68、9.82±1.26及17.79±0.65,与对照组相比明显升高,具有统计学差异(p0.05)。5.血清中细胞因子的水平B71抗体早期干预组及慢病毒干扰组小鼠血清IL4水平分别为0.84±0.52pg/ml及0.88±0.64pg/ml,IFNγ水平为3.06±0.38pg/ml及3.02±0.55pg/ml,均较造模组降低,差异有统计学意义(P0.05)。6.尿蛋白生成及动态变化造模组建模4个月时,20小鼠开始出现蛋白尿,尿蛋白含量为~,随着时间的推移,蛋白尿的阳性率和尿蛋白含量增加,8个月时100小鼠出现蛋白尿,尿蛋白含量为~(1000~20000mg/L),随着时间的延长,蛋白尿程度加重慢病毒干扰组及B71抗体延迟干预组蛋白尿程度减轻,尿蛋白含量为±~(≤3000mg/L),与造模组相比,差异有统计学意义(P0.05)B71抗体早期干预组蛋白尿程度最轻,尿蛋白含量为±~(≤1000mg/L),与慢病毒干扰组及B71抗体延迟干预组相比,亦具有统计学差异(P0.05)。7.肾脏IC沉积分析显示造模组肾小球出现强阳性的IC沉积,慢病中文摘要基因与蛋白水平抑制B7/CD28信号通路对狼疮样肾炎模型的逆转效应及分子机制研究VI毒干扰组及抗体干预组小鼠肾脏IC沉积减少,B71抗体早期干预组IC沉积最少。8.肾脏组织病理改变的光镜分析结果显示造模组大部分小鼠肾小球体积中重度增大,细胞数量明显增多,肾小球血管充血明显,间质淋巴细胞浸润严重,纤维组织增生慢病毒干扰组及抗体干预组小鼠肾小球体积轻中度增大,细胞数轻度增多,肾小球血管轻度充血,间质淋巴细胞浸润减少,B71抗体早期干预组光镜下病理损伤最轻。9.肾脏超微结构的透射电镜分析显示造模组大部分小鼠肾小球内皮细胞下有大块状的电子致密物沉积,部分小鼠系膜内、上皮细胞下及基底膜内也有电子致密物沉积,足细胞间突起广泛融合,足细胞表面有假绒毛形成,基膜增厚慢病毒干扰组及抗体干预组小鼠肾小球内皮细胞下有少量电子致密物沉积,足细胞间突起部分融合,基膜稍增厚,B71抗体早期干预组电镜下超微结构改变最少。结论运用特异的RAN及抗体均能抑制B71分子介导的信号通路,从而降低免疫细胞的活化及逆转疾病模型病理损伤的程度,但抗体的干预效果优于RNA干扰特异性抗体不仅对狼疮样肾炎的形成有预防作用,而且对已经形成的狼疮样肾炎具有治疗作用,且早期干预效果更好。关键词慢病毒,B71,RNA干扰,系统性红斑狼疮,共刺激分子作者黄莉指导老师邱玉华基因与蛋白水平抑制B7/CD28信号通路对狼疮样肾炎模型的逆转效应及分子机制研究英文摘要VIIStudyonthereverseeffectandmolecularmechanismofinhibitingB7/CD28signalpathwayfromgenetoproteinlevelinlupuslikediseaseAbstractB71moleculeisanimportantcostimulatorymoleculeexpressedonthesurfaceofantigenpresentingcellAPC,anditscombinationtothereceptorCD28cangeneratecostimulatorysignals,whichisessentialtotheprimaryimmuneresponse.Withoutthiscostimulatorysignal,Tcellswillentertoastateofanergy,toleranceevenapoptosis.ThehyperreactionofB7/CD28signaliscloselyrelatedtotheoccurrenceofautoimmunediseases.SystemiclupuserythematosusSLEisacommonautoimmunediseasewhichetiologyisuncertaincharacterizedbyT、Blymphocytedysfunction,avarietyofantoantibodies,especiallyantinuclearantibodyANAandantidoublestrandedDNAdsDNAantibody,immunecomplexformationandmanyorgansdamage.LupusnephritisLNisoneofthemostcommonandseriouscomplicationsofSLE,whichisalsotheprimarycauseleadingtodeathofpatients.SomestudieshaverevealedthatB7/CD28signalparticipatedinthepathogenesisofSLE.RNAinterferenceRNAiisakindoftechnologymediatedbydoublestrandedRNAwith2123nucleotidessmallinterferingRNAsiRNA,whichcansuppresshomologeneexpressionbyspecificsequence,belongingtoposttranscriptionalgenesilencingPTGS.Itcansuppressdefinitegeneexpressionquickly,specificlyandefficiently.Specificantibodyinteractionwithitsligandleadstoinhibitorstimulatebiologicsignal.BlockingantibodyofB7moleculecanpreventordownregulateitsinteractionwithCD28,theninhibittheactivationandresponseofT,Blymphocytes.Inthepresentstudy,weestablishedaC57BL/6JmousemodelwithlupuslikediseaseinducedbyPristane,whichissimilartoclinicalpathogenesyandmanifestationofpatientswithSLE.Baseduponthemodel,weapplythelentiviralexpressionvector英文摘要基因与蛋白水平抑制B7/CD28信号通路对狼疮样肾炎模型的逆转效应及分子机制研究VIIIB71shRNAandmouseantihumanB71monoclonalantibodytothemodelmouseinordertoevaluateitsreverseeffectandmolecularmechanismbyblockingB7/CD28signalpathway,whichcouldprovidesomeexperimentalandtheoreticaldata,evenfindabiologicinterventionwhichisspecific,efficientandharmfullessforSLE.PartⅠConstructionoflentiviralvectortargetingmouseB71genebyRNAinterferenceandevaluationitsdisturbingeffectontheexpressionofmembraneB71moleculeObjectToconstructlentiviralexpressionvectortargetingmouseB71genebyshorthairpinRNAshRNA,evaluateitsdisturbingeffectontheexpressionofmembraneB71moleculeandselectanoptimaltargetsequence.MethodsThecomplementaryDNAcontainingbothsenseandantisenseoligonucleotidesofthetargetingsequencewasdesigned,synthesized.Afterannealed,doublestrandedDNAwasinsertedintotheLV3(pGLVH1GFPPuro)vector.293TcellswerecotransfectedwithpLV/helperSL3、pLV/helperSL4andpLV/helperSL5.ThetiterofviruswastestedaccordingtotheexpressionlevelofGFP.MouseL929fibroblastcellswasinfectedbytherecombinantlentiviruses,theoptimaltargetsequencewasselectedaccordingtothedisturbingeffectontheexpressionofmembraneB71moleculebyflowcytometryandimmunofluorescenceResultsDNAsequencingdemonstratedthatlentivirusplasmidLV3B71shRNAwasconstructedsuccessfully.Thetiteroftherecombinantlentiviruswas1108TU/ml,thebestMOIforlentivirusinfectingL929cellwas60andinfectionefficiencywas88.7.AsforthefourshRNAtemplatesequencecandidates,theoptimaltargetsequenceisB71shRNA256,itssilencingefficiencyofthemembraneB71moleculeonL929cellsreachedthehighestratefor73.2.ConclusionsLentiviralexpressionvectorstargetingmouseB71genebyRNAinterferencewasconstructedsuccessfully.TherecombinantlentiviruscaneffectivelysilencethemembraneB71moleculeonL929cells.PartⅡPreparationandassayofmouseantihumanB71antibodyObjectToobtainpureB71antibody,analyzeitstiterandrecognitionof
编号:201403191655180550    大小:4.93MB    格式:PDF    上传时间:2014-03-19
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vyyolyg827上传于2014-03-19

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