（果树学专业论文）枣水溶性多糖的研究.pdf

摘要枣( 2 拓枷办淞，巧“妇m i l l ) 为鼠李科枣属植物。枣成熟果实是传统中药和滋补保健佳品，具有镇静、安神、补血、健脑、抗癌、增强免疫力等功效。作为药食通用的优质果品，对其系统研究和开发利用还处于初级阶段。枣含有丰富的糖、三萜及其苷类，尚含黄酮、酚酸、维生素等成分。对枣中化学成分的研究尤其是对枣中主要成分多糖的研究还远不及同类的传统中药。为了明确枣中糖类的有效成分，探讨其作用机制，以利于今后枣的合理开发和利用，本文对金丝小枣( 拢枣垧螂，巧“妇m i l l “，沁】k 嬲o ) 水溶性多糖进行了系统的研究，并对其进行了体外免疫活性和抗肿瘤活性筛选。此外，还对不同枣品种，枣的不同器官和不同发育期枣果实的水溶性多糖的组成和含量进行了分析。金丝小枣果实通过水提醇沉，再以s e v a g e 法和反复醇洗除去蛋白质和色素，得到粗多糖。经d e a e 纤维素柱色谱及s e p h a r o s ec l 6 b 和s e p h a d e xg - 2 5 柱色谱纯化得到了1 2 个纯多糖，运用酸水解、甲基化、部分酸水解、h p l c 、g c ，承光谱、1 dn m r 和2 d n m r 技术等，研究分析了粗多糖和纯多糖的化学性质，分离纯化得到的1 2 个均一多糖中1 个为中性多糖，1 1 个为酸性多糖。通过体外脾细胞增殖试验对金丝小枣水溶性多糖进行了研究。结果表明，粗多糖中的大分子量粗多糖具有更好的免疫活性。经d 目墟柱色谱分离，从水和低浓度盐洗脱的多糖级分以及从这些级分中分离纯化的多糖具有较高的体外免疫活性。通过体外肿瘤细胞抑制试验对从金丝小枣中纯化的1 2 个多糖进行了研究，结果表明中性多糖以及通过水和低浓度盐洗脱级分中分离纯化的大分子量多糖具有较好的抗肿瘤活性。运用水提醇沉的方法提取了金丝小枣、冬枣、圆铃枣、圆铃小枣、怀柔大脆和月光6 个枣品种，冬枣的花、果实和叶片3 种器官以及金丝小枣不同发育期果实中的水溶性多糖，并通过苯酚硫酸法测定了多糖的含量。结果显示，6 个品种中金丝小枣具有更高的多糖粗提得率和多糖含量：各个器官中花器官具有更高的多糖粗提得率和多糖含量；果实发育的前期，多糖含量较低，在果实发育的大部分时期多糖含量处于缓慢增长状态，果实近成熟期多糖含量急速增加至最高。本研究首次系统对金丝小枣果实中的水溶性多糖的性质和活性进行了研究，并对不同枣品种，枣的不同器官以及不同发育期枣果实中的水溶性多糖进行了研究。此研究丰富了枣化学成分研究的内容，明确了枣果实中免疫活性成分和抗肿瘤活性成分，为枣果实以及枣各器官的开发利用提供了科学依据。关键词：枣；金丝小枣；水溶性多糖；果胶多糖；免疫活性；抗肿瘤活性s t u d i e so nt h ew a t e rs o l u b kp o l y s 丑c c h a r i d e sf h mc h i n e s ej u j u b ec l l i n e s ej 哂u b e 亿脚 淞a f “6 口m i l l ) b e l o n g i n gt ot l l eg e n u sz 把垂柏淞m i l l ( r h 鼬n a c e a e ) i su s e d 雒at r a d 惜。砌c l l i i l e s em e d i c 妇a 1 1 di n v i g o r a n t i th a sa c d v i t i e so fs e d a t i o n ，n o 戚s 岫唱b 1 0 0 d ，a n d t u m o re 髓c t ，i m m u n o m o d u l 曲i u 吼e t c b e i n ga ss u p e re d i b l ef o o d 趴d 仃a d i t i o 蒯c l l i n e s em e d i c i n e ，i t ss y s t c 1 i cs m d i e s ，e x p l o i 诅t i o n &u t m z a t i o n 、e r es t i l li np r i m a r ys t a j 蓦e c 曲1 e s ej u j u b ec 0 删i l sr i c hs u g a r s ，t r i t e 巾e n o i d sa n dt h e i r 西y c o s i d e s ，t o 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i c a lc o m p o s i t i o n ，i d e n t i f e dt l l ei m m u n o l o g i c a la i l da n t i t t l i n o ra c t i v 时c o m p o n e 吣，、v h i c h 、i l lp r 0 v i d es c i e d t i f i cs u p p o r tf o rt l l ee x p l o i t a t i o n u t i l i z a t o o no f c l l i n e 鸵j 讶u b e 蚤耐w o r d s ：毖驷厅淞巧“蚰m i l i ；瑟护 螂，咖6 口腼1 1 c v 肋哦缸d 瑚；w a t e rs o i u b i ep o l y s a c c h 耐d e ；p e c t i cp o l y s a c c h a r i d e ；i 砌u n o l o g i c a la c t i v i t y ；a m i t u m o ra c t i “可缩略词h p l ch 碘p e r f b 哪鳓c el i q u i dc h r o m 咖铲a p h yg cg 舾c h r o m a t o 掣a p h yu vu l 仃a v i o l e ts p e c 怕s c o p yi rh l f r a ds p e c 咖s c o p yn m rn u c l e a rm a g n e t i cr e n 锄c e ss p e c t r o s c o p yh m q ch e t e r o n u c l e 缸m u n i p l e q u a n t u mc o h e 咖c ce x p e r i m e n tg c - m sg 酃c l i r o m a t o g r a p h y ，m 越ss p e c 廿o m e 订ye l s de v a p o r 砌v el i g h ts c a t i e r i n gd e 钯c t o rf i df l a m ei o n i z a t i o nd e t e c t o l t l ct h i n - l a y e rc 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垦盎些盘茎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：延己蘸签字日期：枷6 年月步曰学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：导师签名：1 旁签字日期：帅f 年f 月u 7 日电话：邮编：枣水溶性多糖的研究1 引言1 1 研究意义多糖是自然界中资源最丰富的生物高分子聚合物，几乎存在于所有的生物中，具有能量储存、结构支持、防御功能等多方面的生物功能：有些多糖或其衍生物还有抗肿瘤、免疫促进、抗感染等多种药理活性。近年来的研究发现，多糖的糖链在分子生物学中具有决定性的作用，它能控制细胞的分裂和分化，调节细胞的生长和衰老。不断积累的证据还表明，糖及其缀合物是细胞识别的主要标记物对特定的糖类参与细胞识别的基础研究，在预防和治疗包括癌症在内的多种疾病中将有巨大的应用潜能。所以近年来多糖研究成为天然产物研究的一个热点。迄今为止已经有数千种多糖得以分离纯化和完成一级结构的确定。但是因其结构测定方法繁琐复杂，所取得的进展相当缓慢，因此，寻找新的具有商活性的多糖仍然是多糖研究领域的一大重点。枣原产我国，是我国的优势特色果树树种。枣中糖类成分丰富，是我国传统药食通用的优良补品。目前对枣的利用以干食和鲜食为主，对其开发利用还处于较原始的阶段，对枣中化学成分尤其是多糖的研究远不及同类的传统中药。金丝小枣( z 拓0 旃w 阿“蚰m i l l “舯扛抽口o ) 原产山东、河北交界地带，因果实晒干至半干时掰开果肉，粘稠的果汁可拉成6 0 c m 长的金色细丝，故名。金丝小枣是我国目前栽培面积和产量最大的优良制干枣品种和最主要的出口枣品种之一。本课题以河北沧州产金丝小枣为主要试材，系统地对金丝小枣中的多糖进行了研究。主要运用化学的( 如酸水解、甲基化等) 和主要包括红外、紫外、h p l c 、g c 、n m r 、g c m s 等的现代仪器分析方法以及生物酶解方法对分离得到的多糖进行结构分析：通过体外细胞增殖试验对分离得到的多糖样品进行细胞免疫活性研究；并且对分离纯化的均一多糖样品进行抗肿瘤的体外筛选实验。此外对枣不同品种果实、器官以及不同发育期果实的水溶性多糖进行研究。目的是为枣的生物化学成分与结构研究增加新内容：明确枣免疫作用的有效成分，探讨其作用机割；筛选枣多糖中的抗肿瘤成分：为今后枣的合理使用及枣保健品进一步开发利用提供理论依据。1 - 2 多糖研究进展多糖是存在于自然界的醛糖和( 或) 酮糖通过糖苷键连接在一起的聚合物。多糖是一切有生命的有机体必不可少的成分，它与维持生命的种种生理机能有着密切的联系。近年来，植物、海洋生物及菌类等来源的多糖已作为有生物活性的天然产物中的一个重要类型出现，各种多糖所具有的抗肿瘤、免疫、抗凝血、降血糖和抗病毒活性已相继被发现。同时多糖联系着细胞与细胞之间及细胞与外界的能量和物质传递，决定着大分子与细胞及与其它分子之间的相互作用【1 】。但就其研究状况而言，与蛋白质和核酸的发展相比，显得远远落伍。多糖结构复杂，它具有不同单糖残基、不同的连接位置和不同类型的糖苷键。并且多糖具有不同的构象、不同的相对分子质量，以及不同的高级结构。由于多糖的生物活性与其纯度和化学结构即糖苷键的不同连接方式有着重要的关系，因此对多糖的研究开发包含了多糖的分离、纯化、结构测定、活性测定及结构修饰。目前，多糖的研究主要以这些工作为主。河北农业大学博士学位( 毕业) 论文1 2 1 多糖的来源多糖来源很广，广泛存在于植物、动物和微生物( 细菌和真菌) 中。其中研究的较早且最多的是从细菌中得到的各种英膜多糖，它在医药上主要用于疫苗。多糖作为药物始于1 9 4 3 年，2 0世纪6 0 年代作为广谱免疫促进剂而引起医药界的关注口翔。8 0 年代又发现多糖的糖链在分子生物学中具有决定性的作用，能控制细胞分裂和分化，调节细胞的生长和衰老1 4 j 。近年来真菌多糖因其具有较好的活性，深入开展了真菌多糖的研究，如酵母菌多糖、食用菌多糖，特别是食用菌多糖的研究，如香菇、灵芝、茯苓多糖研究得较清楚。植物多糖的开发也倍受人们的青睐，由于我国是中药的起源之地，而糖类是中药材中普遍存在的成分，在对各种中药材的化学成分研究的过程中，人们都少不了对其中多糖的关注。檐物多糖研究比较深入的是稻草多糖、麦秸多糖、竹多糖、刺五茄多糖。近来，海藻多糖的研究已引起人们的关注i ”。1 2 2 多糖的分类根据组成单糖的类别，多糖可分为均聚多糖( h o m o p o j ”a c c h 捌d e s ) 和杂多糖( h e t e r o p o l y s a c c h ”i d e s ) 。均聚多糖是指由同一单糖组成，如淀粉( s t a r c h ) 、纤维索( c e l l u l o s e ) ；而杂多糖则是由多种单糖组成，如树胶( g m s ) 、粘胶多糖( m u c i l a g e s ) 、果胶( p e c 6 n s ) 、半纤维索( h e m i c e l l u l o s e s ) 等。自然界中多糖大部分往往不是单独存在，而是与其它非糖部分如蛋白质、肽、目目类以及核酸等结合形成糖缀合物( g i y c o c o n j u g a t ) ，参与许多重要的生命活动。1 2 3 多糖的提取、分离和纯化多糖的分离纯化一般包括分离、纯化和纯度鉴定。其中分离纯他是多糖研究的关键。其成功与否、效果的好坏都会直接影响后续研究的可行性与可信度。1 2 3 1 多糖的提取和分离多糖的种类繁多，不同的多糖其提取分离方法各不相同。多糖是极性大分子化合物，大多采用不同温度的水、稀碱溶液或氯化钠等盐的水溶液作提取溶剂】。有些生物材料，含脂类物质较高，如植物的种子，在提取前要先脱脂；有些植物的果实或其它器官组织中含色素较多，也需要进行脱色处理；一般采用丙酮、乙醚、乙醇进行预处理达到除脂和除色的目的。对多糖的提取工艺，有人尝试双水相逆流色谱萃取法、环流泡沫分离法等对多糖进行分离纯化1 8 ，。1 2 3 2 多糖的纯化多糖的纯化就是指将粗多糖中的杂质去除并经过一些如色谱的技术获得单一的多糖组分，一般是先脱除非多糖组分。再对多糖组分进行分级。多糖在提取过程中，一些小分子的物质和蛋白质极易同时提取出来。一般乙醇沉淀的方法会去除部分小分子物质，因为小分子物质一般会溶解在一定浓度的乙醇中，而多糖一般是不溶于乙醇的。提取液中游离蛋白质的去除方法有s e v a g e 法、三氟三氯乙烷法和三氯乙酸法，结合蛋白质的去除可用蛋白酶法【l o 】。对结合态的蛋白质有报道用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和链霉菌蛋白酶等处理多糖样品而去除的【”1 “。2枣水溶性多糖的研究目前常用于多糖纯化的方法有盐析法、分步沉淀法、季胺盐沉淀法、纤维素柱色谱、凝胶柱色谱、金属络台物法、纤维素阴离子交换剂柱色谱法、以及制备性高效液相色谱、制备性区域电泳、超滤法和亲和色谱法等。其中应用最多的是d e a e 一纤维素，d e a e 凝胶色谱法和其它各种类型的凝胶色谱柱【1 ”。1 2 4 多糖的纯度鉴定多糖的纯度不能用通常化合物的纯度标准来衡量，即便是多糖纯品，其微观也并不均一，仅代表相似链长的多糖分子的平均分布，通常所谓的多糖纯品实际上也只是一定相对分子质量范围的多糖的均一组分。目前常用于多糖纯度鉴定的方法有功能团分析、比旋光度法、水解法、纸色谱和高效液相色谱、超离心和高压电泳法等【l ”。随着现代生化技术的发展，样品的纯度一般建议采用两种以上的方法来系统证明。在检测的方法中，电泳技术( 醋酸薄膜电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳、玻璃纤维纸电泳等) 所检查的谱带，一般均较宽；色谱则以各种凝胶柱色谱较好必须得单一对称窄峰，高效液相色谱配以适合的糖分析柱，则效果更好【l ”，毛细管电泳也被运用到糖的纯度鉴定上i l q 。1 2 5 多糖的性质和结构1 2 5 1 多糖的相对分子质量测定多糖的相对分子质量测定是研究多糖性质的一项较为重要的工作，因为多糖的性质往往与它的相对分子质量大小有关。常用于多糖相对分子质量测定的方法有凝胶色谱法、蒸汽压渗透计法、端基法、粘度法、光散射法、渗透压法和超滤法等。凝胶色谱法是比较常用的方法【l ”。以不同型号的s e p h a d e x 或者s e p h a r 0 s e 装柱，用一定离子强度的氯化钠水溶液进行平衡，然后将各种不同的已知相对分子质量的多糖分别相继上柱，用同一离子强度的氯化钠水溶液洗脱，分步收集，苯酚一硫酸法监测，分别隶得洗脱体积( 妇) ，再将标准葡聚糖( 肘矿2 0 0 万) 上同一根色谱柱求出柱的空体积( 如) 。根据妇，勋与相对分子质量的对数之间存在着线性关系，可绘制标准曲线。最后，将待测样品按上述不变的条件上柱求得待测多糖的跆，通过标准曲线上的跆怖，查得待测多糖的相对分子质量对数，进一步求出相对分子质量。如果用高效液相色谱配以相应的凝胶色谱柱，同法操作，结果会更加准确。并且稳定。聚丙烯酰胺凝胶电泳也可用于多糖相对分子质量测定。在测定过程中要注意标准品的选择，尽量使用与被测多糖结构相似的标准品，因为不同结构的标准晶虽然其相对分子质量相同，但在一定的条件下所表现的相对分子质量则有所不同。多糖相对分子质量的测定没有一种绝对的方法，其相对分子质量只代表相似链长的平均而不是确切的分子大小。往往用不同的方法会得到不同的相对分子质量。1 2 5 2 多糖的结构由于分子生物学和分析技术的快速发展，多糖的分离和结构测定也取得了很大进展，糖诧学家们利用化学、物理和生物学手段对多糖分子结构和功能进行研究，而高新技术的发展使分析手段更快速、高效和灵敏。但化学分析法仍然是经典的方法。此外除了多糖的一级结构外，多糖的结构还包括有高级结构( 二级、三级和四级结构) 。多糖的高级结构( 即构象) 决定于其一级结3河北农业大学博士学位( 毕业) 论文构，其结构层次可分为二级、三级、四级结构。多糖的二级结构通常指多糖的骨架的形状，即多糖骨架链内以氢键结合所形成的各种聚合体。二级结构一般只关系到多糖分子的主链构象。不涉及侧链的空间排布。在多糖链中，糖环的几何形状几乎是硬性的，各种单糖残基绕糖营键旋转而相对定位，可决定多糖的整体的非共价相互作用，导致在二级结构的基础上进一步卷曲或折叠，或者是两链双螺旋排列关系而形成的一定构象即多糖的三级结构。多糖的四级结构是相同或不同多糖链的协同结合而形成的聚集体，也即亚单位现象。多糖的内部基团有相互作用，因其不同氢键的形成而构成特定的高级结构【l8 1 ”】。1 2 s 2 1 多糖的一级结构多糖的结构分析手段很多，其中包括化学方法，如甲基化分析、高碘酸氧化、s m i m 降解、乙酰解、三氧化铬氧化法等；物理方法如红外光谱、核磁共振波谱、气相色谱、液相色谱、质谱等：生物学方法如酶解等b ”。糖的位置、糖环的大小、异头碳的结构、连接的位置、内部排列顺序、分支、非碳端的取代等的测定都不可能通过一种方法解决，必须几种方法结合使用才能完成。( 1 ) 多糖中的单糖组成分析测定多糖的单糖组成之前，首先需要进行酸水解。酸水解的条件如酸的种类、浓度、温度、时间等可根据需要来控制。常用于水解多糖的酸类有：盐酸、硫酸和三氟醋酸。硫酸主要用于水解中性糖：三氟醋酸可用于植物细胞壁多糖、糖蛋白及糖胺聚糖的水解；而盐酸则用于糖蛋白和含氨基酸脱氧多糖的多糖水解。r u i c e r 等【2 4 】比较了这些酸水解法的优缺点，根据他们的试验结果，认为甲醇结合三氟醋酸可得到最佳水解效果。多糖水解成单糖后，可用多种方法进行组成分析，目前常用的有气相色谱法、液相色谱法和毛细管电泳法。它们在分析中各有其优缺点。气相色谱法( g c ) 口”气相色谱是多糖结构分析中最重簧的手段之一。它与质谱联用可以得出有关单糖残基类型、链的连接方式、糖的序列和糖环形式、聚合度等多种结构信息。用气相色谱法测定糖类具有选择性好，样品用量少，分辨率强，灵敏度高，分析速度快以及可用于定性及定量分析等优点。气相色谱要求试样具有良好挥发性和热稳定性。多糖本身是大分子物质，且由于含大量羟基不能在高温下直接挥发，必须将其降解为结构单糖或寡糖，并衍生成具有挥发、对热稳定的衍生物- 通常采用的是用三甲基硅烷基化( 1 m s ) 或乙酰化( 醋酐) ，一般认为糖衍生物气相色谱分辨率高，但单糖在衍生化后会产生多峰，而影响定性、定最分析。液相色谱法( h p l c )高效液相色谱近来也用于糖的分析，其优点是可以直接进样，不需要衍生化，操作简便，并且具有较高的分辨率。对于热不稳定的单糖、双糖、低聚糖( 寡糖) 的测定尤其适用。收集流出组分，可进一步与质谱、红外光谱等仪器联用进行分析鉴定。高效离子交换色谱和高效凝胶渗透色谱直接分离若干单糖和低聚糖虽分辨率高，但分离速度慢。一般认为碳水化合物色谱柱和氨基结合键固定相色谱柱( 简称氨基柱) 有较好的分离效果。但在高效液相色谱中，直接用于检测的示差折射检测器灵敏度较低为提高分析灵敏度可预先制备糖的紫外标记衍生物( 用荧光检测器) 进行色谱分离，但操作繁杂。近年来采用示差检测器( r j ) 进行糖的液相色谱分析的报道逐渐增多【2 6 】。采用专用的糖柱，直接用重蒸水作流动相对单糖进行高效液相色谱分析，亦可获得了4枣水溶性多糖的研究良好的结果【2 7 l 。蒸发光检测器( e l s d ) 因其具有高灵敏度而得到越来越广泛的应用。电喷雾检测器( c a d ) 是又一更灵敏的检测器，因其价格昂贵还没有得到广泛的应用。毛细管电泳法( c e ) 口“1 l毛细管电泳( c e ) 是近二十年发展起来的一种新的分离分析技术它以快速、高效、高灵敏度、所需样品少等优点被广泛应用于各个领域。八十年代末开始应用于糖类物质的分析，并获得了快速发展。应用于多糖类化合物的研究还不是很多，这主要是由于分子不带电荷和没有紫外吸收对分析构成一定困难，而要解决这一难题就在于引进发色基团并使其带上电荷。多糖的酸水解物经衍生后，以硼砂溶液作缓冲液经毛细管电泳分析，其各种单糖组分均能被检出，尤其是在 ，l c上不易分开的葡萄糖和甘露糖在毛细管电泳上可得到较好的分离。刘少民田1 等对烟草中糖类物质进行了高效毛细管电泳- 安培检测研究，得到了令人满意的结果。毛细管电泳与质谱联用是近年来发展起来的一种新型分离检测技术。它综合了毛细管电泳的高效、快速和质谱强大的检测功能的优点，广泛应用于生命科学研究各领域，成为分析生物大分子的重要工具之一i ”。另外，毛细管电泳与质谱联用可以对细胞水平的极微量多糖进行精确分析。( 2 ) 多糖的糖苷键类型及连接方式在糖的结构分析方面，经典的化学方法仍然是不可缺少的手段，而且近年来许多新的技术特别是物理和生物技术的广泛运用，使糖的结构分析有了重大的发展，多种方法和技术的联合应用，己使多种多糖结构得以阐明。多糖的甲基化分析甲基化方法是多糖及其缀合物中糖结构分析的重要方法，可用来判断单糖的组成和连接位置。多糖的甲基化方法很多，如p u f d i e 法、h a 、v o n l i 法、m e n 西e s 法、h a k o 谢法、c i c u 法及液氨甲基化等m j 。甲基化分析中关键的一步是糖环上的羟基必须全部甲基化。甲基化程度的确定最早是测定甲氧基的含量，这种方法需较多样品，而且比较繁琐。目前应用较广泛的是红外光谱法，即根据红外光谱中有无3 5 0 0c m 。1 的羟基吸收峰判断甲基化的完全与否，这种方法也不能用于微量样品的分析。h a l c o m 一法是以甲基亚磺酰负离子( c h 3 s o c h 2 。) 为强碱，碘甲烷为甲基供体。c i u c a n u法用n a o h 代替c h 3 s o c h 2 - 作为强碱，由于省去了制备c h 3 s o c h 2 。的复杂步骤，因而操作比较简单。n e e d s 法是对c i u c 法的改进，它是先加入n a o h 使糖的羟基充分解离后，再加入碘甲烷使羟基迅速甲基化，这样减少了多糖氧化降解的可能性。李波等m 1 对难溶于二甲亚砜( d m s o ) 但易溶于水的多糖羊栖菜褐藻糖胶的甲基化方法进行了研究。多糖的高碘酸氧化和s m i t i i 降解多糖的结构中含有邻二羟基和邻三羟基的结构，易被高碘酸盐氧化开环，通过测定过碘酸盐的消耗、甲酸的生成量和剩余糖的摩尔比就可能确定多糖中各种单糖的键型及其比例。高碘酸氧化反应是一种选择性的氧化降解反应。通过测定高碘酸消耗量及甲酸释放量，可以用来辅助判断糖苷键的位置、直链多糖的聚合度、支链多糖的分支数目等p “。不溶于水的多糖可在二甲基亚砜中进行高碘酸氧化。s m i 也降解将高碘酸氧化产物还原后进行酸水解，再鉴定水解产物。由所得产物可以推断糖苷键的位置。s m i m 降解的产物之一甘油除可用g c 检测外，还可以用甘油激酶与3 磷酸脱氢酶测定。5河北农业大学博士学位( 毕业) 论文( 3 ) 多糖的核磁共振( n m r ) 分析核磁共振( n 虹t ) 方法是2 0 世纪7 0 年代引入到多糖结构的研究中来的，随着n m r 技术的发展和高磁场n m r 仪的出现，在糖类结构的光谱解析中逐渐起着决定性的作用。2 0 世纪8 0 年代2 d - n m r 技术也快速发展起来”】。n m r 是分析有机物结构的有力手段，但由于糖类的结构单体( 糖残基) 相似，其分子量大，因此对其进行n m r 分析有一定的难度。通常，测定糖类样品的一维1 h _ n m r 和”c n m r 谱可得到其整体结构信息，二维n m r 谱( 如c o s y 、h m o c 、 m m c 等) 则能给出相关碳氢连接方式方面的信息【3 8 】。对于多糖的分析，重点在于糖基的连接顺序和立体构型( 踯) ，在多糖的空间构型分析上应用较多的分析方法是r o e s y 、偏共振r o e s y 等二维谱技术。( 4 ) 紫外光谱在多糖化学中的应用受实验技术条件的限制，常用的紫外光谱是指2 0 0 4 0 0m 的近紫外区光谱，因此紫外光谱在多糖结构分析上没有多大用处。然而，对于多糖复合物常用紫外光谱扫描检测2 6 0 2 8 0m 有无特征吸收峰，来判别是否含有核酸或蛋白质缀合物p ”。( 5 ) 糖的红外光谱法红外光谱指以连续波长的红外线为光源照射样品所测得的吸收光谱，它是由于分子发生振动能级的跃迁而产生的。红外光谱提供了极其丰富的分子结构信息，不同物质具有不同的吸收波长和不同的红外光谱1 4 。红外光谱法用于确定糖苷键构型及其它官能团。物质的红外图谱包含丰富的结构信息集中表现了各种基团的振动形式，因此红外光谱法一直是经典的结构分析方法。近年来傅立叶变换红外光谱法( f o l l r i 日t r a i l s f o mi r l 舶r e ds p e c h d s c o p y ，f t 取) 发展迅速，成为定性分析和研究分子相互作用的有效手段。它具有噪声低、光通量高、测量速度快、波数精度高、频率测量范围宽等优点，同时借助各种附件技术，如光声光谱、漫反射光谱、反射吸收光谱和发射光谱等，因而在许多领域具有广阔的应用前景j 。( 6 ) 质谱( m s ) 分析在多糖结构解析上的应用在多糖结构研究的诸多方法中，质谱被认为是一种重要的不可缺少的手段，灵敏度高，信息直观，特别是2 0 世纪8 0 年代出现的快原子轰击质谱( f a b m s ) 或二次离子质谱( s i m s ) ，使极性高、难挥发、热不稳定的多糖的直接分析成为可能，只需要用pm o l nm o l 的样品量便能得到寡糖的一些信息。在多糖结构的描述中，用于多糖中单糖的连接位置测定的甲基化分析方法，也须用o c - m s来进行定性和定量分析1 4 “。1 2 5 2 2 多糖的高级结构研究越来越多的研究表明。多糖的活性和多糖的高级结构有更为密切的关系。因而研究多糖的高级结构更有助于阐明多糖的构效关系。研究多糖高级结构的常用方法有x 射线衍射法h ”、原子力显微镜法( a f m ) 1 4 4 1 、圆二色谱h 5 l 等方法。1 2 6 多糖活性多糖广泛分布于生物体中，尤其是动物细胞膜、植物和微生物细胞壁中，是一类由醛糖或酮6枣水溶性多糖的研究糖通过糖苷键连接而成的天然高分子多聚物，是构成生命的分子基础之一。人们对多糖的认识首先是把它看作食物中的能量来源，2 0 世纪6 0 年代后作为广谱免疫促进剂而引起人们极大兴趣。近几十年来，人们发现从植物中提取的多糖具有非常重要与特殊的生理活性。这些多糖参与了生物体中细胞的各种活动，具有抗肿瘤和免疫促进、抗炎、抗病毒、抗凝血、降血糖、降血脂、抗疲劳、抗衰老等作用1 4 。据报道，已有近百种植物的多糖被分离提取出来。这类多糖来源广泛且细胞毒性较低，应用于生物体毒副作用小，因此对植物多糖的研究已成为医药界的热门领域。1 2 6 1 增强机体免疫功能植物多糖最重要的药理作用为免疫促进作用。多糖能在多条途径、多个层面对免疫系统发挥调节作用如激活网状内皮系统( r e s ) 的吞噬功能，促进i l 1 、i l 2 、1 n f a 、i n f 吖、n o 等生成，增强天然杀伤性细胞( n k ) 的活性，活化巨噬细胞，诱导免疫调节因子的表达，调节机体抗体和补体的形成等【4 7 】。牛膝多糖( a b p s ) 能升高血清溶血数和脾脏内抗体形成细胞数，提高血清免疫球蛋白i g g 水平，激活巨噬细胞促进n 吓和几2 的生长，促进淋巴细胞的增殖j 。从当归中得到的多糖具有免疫增进功能删。低相对分子质量( 1 0 0 0 2 0 0 0 ) 的地黄多糖( l r p s ) 可使小鼠l e w i s 肺癌细胞内抗癌p 5 3 基因表达明显增强。从而引发l e w i s 肺癌细胞的程序性死亡p 。从条斑紫菜中得到的多糖p y 3 对小鼠骨髓细胞和脾脏淋巴细胞的增殖以及对混合淋巴细胞反应均有一定的促进作用，对血癌细胞k 5 6 2 的生长有一定抑制作用p “。云芝多糖( p s k ) 可提高小鼠腹腔滤液细胞( p e c ) 和脾细胞中巨噬细胞集落刺激因子( m s f ) 的基因表达水平1 5 “。1 2 6 2 抗肿瘤作用多糖通过活化巨噬细胞，活化淋巴细胞，提高n k 细胞和l a k ( 淋巴因子激活的杀伤细胞)细胞的活性，促有丝分裂作用，增强网状内皮系统，促进细胞因子分泌，增强红细胞免疫等作用而提高宿主抗肿瘤免疫功能，通过改变瘤体细胞膜的生长特性，抗突变，抗自由基，诱导分化与诱导凋亡等作用而发挥直接的抗肿瘤作用p ”。自从2 0 世纪5 0 年代发现酵母多糖具有抗肿瘤效应以来，己分离出很多具有抗肿癌活性的多糖。就多糖的抗肿瘤作用而言，可将抗肿瘤多糖分为2 大类：一类是具有细胞毒性的多糖直接杀死了肿瘤细胞，这类多糖有牛膝多糖、刺五茄多糖等；第二类是作为生物免疫反应调节剂通过增强机体的免疫功能而间接抑制或杀死肿瘤细胞，如：能增强天然杀伤性细胞( n k ) 活性、诱导巨噬细胞产生肿瘤坏死因子的多糖，具有抗肿瘤活性的多糖大多是通过这种途径起作用的。也就是常说的宿主介导抗肿瘤活性p 4 - ”j 。从灰树花菌丝体中分离得到的低分子量多糖对s 1 8 0 肉瘤、e a c 腹水瘤、h e p s 实体瘤都有明显抑制作用p “。从深层发酵菌丝体得到的水溶性多糖h w s p 对体外培养的不同肿瘤细胞具有一定程度的选择性杀伤作用，对肝癌b e l 7 4 0 2 细胞具有相当的抑制作用p ”。当归多糖对l 1 2 1 0 、k g 2 1 、u 9 3 7 细胞系均有明显的抑制作用；当归多糖组分a p 2 0 可显著减轻肉瘤s 1 8 0 模型小鼠的瘤重量，可显著减轻艾氏腹水癌小鼠模型的瘤重量。提高生命延长率p ”。掌叶大黄多糖( i t p p ) 对肿瘤细胞具有直接杀伤作用，对肿瘤干细胞增殖有抑制作用，并可抑制3种贴壁生长的肿瘤细胞粘附，致细胞增殖停滞”w 。从人参根分离出的中性多糖葡聚糖具有抗肿瘤的作用州。粗多糖可增强环磷酰胺抗肿瘤的作用：人参废渣中提取的多糖。抑癯率显著强于人参粗多糖。杨桦等【6 l 】认为人参多糖具有一定的抗肿瘤活性，其机制可能是人参多糖诱生了肿瘤坏死7河北农业大学博士学位( 毕业) 论文因子。