CN103961713A一种壳聚糖修饰的介孔二氧化硅基缓控释材料的应用

CN103961713ACN103961713A一种壳聚糖修饰的介孔二氧化硅基缓控释材一种壳聚糖修饰的介孔二氧化硅基缓控释材 料的应用料的应用 10 申请公布号103961713A 43 申请公布日xx 08 06103961713A 21 申请号xx10188283 7 22 申请日xx 05 06A61K47 36 xx 01 A61K47 04 xx 01 A61K47 48 xx 01 A61P35 00 xx 01 71 申请人中国科学院上海硅酸盐研究所地址200050上海市长宁区 定西路1295号 72 发明人祝迎春符静珂 74 专利代理机构上海瀚桥专利代理事务所 普通合伙 31261代理人 曹芳玲郑优丽 54 发明名称一种壳聚糖修饰的介孔二氧化硅基缓控释材料的应用 57 摘要本发明涉及一种壳聚糖修饰的介孔二氧化硅基缓控释材料 的应用 所述材料由介孔孔道可负载能够产生自由基的化合物或基 团的介孔二氧化硅纳米粒子 负载在介孔二氧化硅纳米粒子介孔孔 道中的自由基的化合物或基团 以及包覆所述介孔二氧化硅纳米粒 子的壳聚糖聚合电解质膜组成 所述材料响应pH值控制材料负载的能够产生自由基的化合物或基团 的释放速率 51 Int Cl 权利要求书1页说明书9页附图2页 19 中华人民共和国国家知识产权局 12 发明专利申请权利要求书1页说明书9页附图2页 10 申请公布号103961713A103961713A1 1页21 一种壳聚糖修饰的 介孔二氧化硅基缓控释材料 其特征在于 所述材料由介孔孔道可 负载能够产生自由基的化合物或基团的介孔二氧化硅纳米粒子 负 载在介孔二氧化硅纳米粒子介孔孔道中的自由基的化合物或基团 以及包覆所述介孔二氧化硅纳米粒子的壳聚糖聚合电解质膜组成 2 根据权利要求1所述的材料 其特征在于 产生自由基的化合物或 基团包括含有过氧键的过氧化物或基团 3 根据权利要求1或2所述的材料 其特征在于 产生自由基的化合 物或基团被装载入或者被键接在介孔二氧化硅基材料的介孔孔道内 和 或者介孔表面 4 根据权利要求1 3中任一所述的材料 其特征在于 自由基是指过氧化物 内氧化物 在反应过程中的一系列中间产物 包括以自由基形式存在和不以自 由基形式存在的具有高活性的中间产物 5 根据权利要求4所述的材料 其特征在于 中间产物包含过氧自由 基 烷氧基自由基 烷基自由基 有机过氧化氢物中的至少一种 6 一种权利要求1 5任一所述材料的应用 其特征在于 所述材料响应pH值控制材料负 载的能够产生自由基的化合物或基团的释放速率 7 根据权利要求6所述的应用 其特征在于 所述材料负载的产生自 由基的化合物或基团在pH 6 5条件下的释放率大于在pH 7 4条件下 的释放率 权利要求书103961713A21 9页3一种壳聚糖修饰的介孔二氧化硅基缓 控释材料的应用技术领域 0001 本发明涉及一种缓控释材料及其应 用 具体涉及一种壳聚糖修饰的介孔二氧化硅基缓控释材料及其应 用 属于纳米生物医药材料技术领域 背景技术 0002 活性氧自由基 ROS 是一类活性物种 包括氧分子的 还原产物 如单线态氧 1O2 超氧阴离子自由基 O2 过氧化氢 H2O2 羟基自由基 HO 以及碳中心自由基和氧分 子的反应产物 如过氧自由基 ROO 烷氧自由基 RO 和有机过 氧化氢物 ROOH 等 由于自由基具有生物化学活性 并且可以自由穿过细胞膜 因而自 由基具有杀灭细胞的特性 大量研究表明 过量的自由基会引发细胞内生物大分子的氧化损伤 会抑制蛋白质的功能 破坏脂质 并引发DNA链断裂进而引发细胞 死亡 通过辐射诱发产生自由基 放疗 已经被证实为一种有效的癌症治疗 手段 另外一种方法就是通过药物诱发产生自由基 化疗 一些常见的抗癌药 如喜树碱 阿霉素 长春新碱 三氧化二砷以 及博来霉素等的毒性作用都与自由基有关 如何能够在肿瘤组织周围长时间的释放自由基将会是一种有效的治 疗癌症的方式 0003 过氧化物是一类含有过氧键 O O 的化合物 通式为R O O R 这些分子中的过氧键 O O 具有很强的氧化能力 容易发生断裂生成两个自由基RO 因此 被广泛用在塑料和橡胶行业作为自由基引发剂 这些引发剂在光 热的刺激下可以迅速产生自由基 正是由于过氧化物这种产生自由基的特性 我们考虑到使用过氧化 物作为一种自由基源用于癌症的自由基疗法 但过氧化物本身作为自由基引发剂 对光和热很敏感 而且在很多 溶剂中都不稳定 这就使得过氧化物很难用于临床治疗使用 因为这些过氧化物很有可能在还未到达病灶部位的时候已经分解产 生自由基了 从而对正常细胞造成严重损伤 另外 很多过氧化物 尤其是一些有机过氧化物 在水中溶解度很 低 这就限制了他们的进一步的口服及皮下注射应用 如何能够改善这些过氧化物的稳定性 提高他们在水中的溶解度并 进一步实现可控性的输运将会是一个非常有前景的研究领域 但是 却还未见报道 0004 把过氧化物装入一种载体可能会是解决这个问题的一个思路 已见的报道使用脂质体 VB Patel AN Misra YS Marfatia Drug DevInd Pharm xx 27 863 9 微球 M Jelvehgari MR Siahi Shadbad S Azarmi Int JPharm xx 308 124 32 RC Wester R Patel S Nacht J AmAcad Dermatol 1991 24 720 6 聚合物 J Shim HS Kang WS Park J ControlRelease xx 97 477 84 和脂质体纳米粒子 A Dingler RP Blum H Niehus J Microencapsul 1999 16 751 67 来装载和输运过氧化物 但是 这些有机载体因为自身化学稳定性有限 加上药物装载效率 低 从而限制了他们的临床应用 因此 迫切需要开发一种具有较高化学和热稳定性 而且具有极高 的生物相容性和可降解性的自由基释放体系 发明内容说明书103961713A32 9页4 0005 本发明旨在克服现有自由 基释放体系存在的缺陷 本发明提供一种壳聚糖修饰的介孔二氧化 硅基缓控释材料及其应用 0006 本发明提供了一种壳聚糖修饰的介孔二氧化硅基缓控释材料 所述材料由介孔孔道可负载能够产生自由基的化合物或基团的介 孔二氧化硅纳米粒子 负载在介孔二氧化硅纳米粒子介孔孔道中的 自由基的化合物或基团 以及包覆所述介孔二氧化硅纳米粒子的壳 聚糖聚合电解质膜组成 0007 较佳地 产生自由基的化合物或基团包括含有过氧键的过氧 化物或基团 0008 较佳地 产生自由基的化合物或基团被装载入或者被键接在 介孔二氧化硅基材料的介孔孔道内和 或者介孔表面 0009 较佳地 自由基是指过氧化物 内氧化物在反应过程中的一 系列中间产物 包括以自由基形式存在和不以自由基形式存在的具 有高活性的中间产物 0010 较佳地 中间产物包含过氧自由基 烷氧基自由基 烷基自 由基 有机过氧化氢物中的至少一种 0011 本发明还提供一种上述述材料的应用 所述材料由介孔孔道 负载能够产生自由基的化合物或基团的介孔二氧化硅纳米粒子和包 覆所述介孔二氧化硅纳米粒子的壳聚糖聚合电解质膜组成 所述材 料响应pH值控制材料负载的能够产生自由基的化合物或基团的释放 速率 0012 较佳地 所述材料负载的能够产生自由基的化合物或基团在p H 6 5条件下的释放率大于在pH 7 4条件下的释放率 0013 本发明的有益效果介孔二氧化硅的孔容大 装载量大 壳聚 糖聚合电解质膜在中性及微碱性 模拟正常细胞 的条件下 由于其 表面的氨基质子化程度低 分子间氢键的作用大于静电斥力的作用 分子链团聚 成有序聚集状态 有效阻止装载的化合物或集团释 放 而在酸性 模拟肿瘤细胞 的条件下 其表面的氨基质子化程度 高 静电斥力大于分子间氢键 与水作用 成溶胶状态 使得负载 的化合物或基团可以释放出来 达到靶向缓释作用本发明所述的pH 响应性自由基释放体系可以响应性地在肿瘤组织附近 pH 6 5 产生 自由基 而在正常组织处 pH 7 4 不释药 从而避免了自由基对正 常组织的损伤作用 因此 具有重大的医药业应用前景和价值 附图说明 0014 图1为本发明的一个实施方式中制备的空心介孔二氧 化硅纳米粒子 HMSNs 的透射电子显微照片 TEM 图2为本发明的一 个实施方式中制备的载有过氧化苯甲酰 BPO 的空心介孔二氧化硅纳 米复合物 BPO HMSNs 的傅里叶变换红外光谱图 FTIR 图3为本发 明的一个实施方式中制备的BPO HMSNs Cs 2的释放液的紫外 可见吸收光谱 具体实施方式 0015 以下结合附图及下述具体实施方式进一步说明 本发明 应理解 下述实施方式和 说明书103961713A43 9页5或附 图仅用于说明本发明 而非限制本发明 0016 本发明公开了一种介孔二氧化硅基的pH响应性自由基释放体 系的应用 属于纳米生物医药材料技术领域 所述的自由基体系是利用介孔二氧化硅基材料为载体 通过物理浸 渍装载能够产生自由基的化合物或者通过化学基团修饰键接能够产 生自由基的基团 所述的pH响应性释放是通过在介孔二氧化硅表面包覆或者键接pH响 应性的壳聚糖聚电解质 实现对产生的自由基的pH响应性释放 所释放的自由基可以攻击肿瘤组织 进而导致恶性细胞死亡 本发明不仅制备工艺简单 而且可以实现自由基在肿瘤组织周围靶 向 pH响应性释放 从而大幅度降低传统药物对于正常组织的损伤 因而具有重大的生理意义和临床应用前景 0017 本发明提供了一种介孔二氧化硅基的pH响应性自由基释放体 系 所述体系利用介孔二氧化硅基材料为载体 通过负载自由基产 生化合物 基团 可控的释放自由基 0018 所述的介孔二氧化硅基材料 具有介孔孔道的介孔二氧化硅 或者空心介孔二氧化硅纳米材料 本发明利用介孔二氧化硅材料巨大的空腔结构或者丰富的介孔孔道 实现自由基产生化合物的大量装载 或者利用二氧化硅表面丰富的 硅羟基 实现与自由基产生基团的大量键连 实现对自由基产生化 合物的有效负载 0019 所述的自由基产生化合物 基团 含有过氧键 O O 的过氧化物或基团 0020 所述的自由基体系的制备方法 自由基产生化合物 基团 被 装载入介孔二氧化硅基材料或者被键接在介孔二氧化硅基材料的介 孔孔道内和 或者 介孔表面 0021 所述的自由基体系的制备方法中 自由基产生化合物 基团 的负载方法是物理浸渍或者化学基团键接 0022 所述的pH响应性自由基释放体系 介孔二氧化硅表面负载有p H响应性的壳聚糖聚电解质 0023 所述的pH响应性的壳聚糖聚电解质 壳聚糖聚电解质被包覆 或者键接在介孔二氧化硅表面 0024 所述的可控的自由基释放体系 所产生的自由基是指过氧化 物 内氧化物在反应过程中的一系列中间产物 包括以自由基形式 存在和不以自由基形式存在的具有高活性的中间产物 0025 所述的过氧化物 内氧化物的中间产物 包含过氧自由基 RO O 烷氧基自由基 RO 烷基自由基 R 和有机过氧化氢物 R OOH 等 0026 所述的可控的自由基释放体系 所述的任一项介孔二氧化硅 基的pH响应性自由基释放体系的用途是用于肿瘤组织的损伤和肿瘤 细胞的杀灭 0027 近些年来 无机的介孔二氧化硅纳米载体由于具有较高的化 学和热稳定性 而且具有极高的生物相容性和可降解性 越来越多 的被用于催化 生物成像 药物 基因输运等方面 因而受到了广泛 的关注 其中 空心介孔二氧化硅纳米粒子 HMSNs 尤其受到关注 这主要是 因为空心介孔二氧化硅纳米粒子具有更大的比表面积 孔体积 具 有巨大的空腔结构 从而可以提高药物的装载效率 同时 这些介孔二氧化硅纳米材料的表面富含硅羟基 可以键接各 种官能基团 从而赋予HMSNs各种刺激响应的可控性药物释放能力 另外 利用纳米粒子本身在肿瘤组织周围的EPR效应 可以实现纳米 粒子对于肿瘤组织周围的靶向输运 这就使得介孔二氧化硅纳米材料成为一种用于装载这种不稳定的过 氧化物的良好说明书103961713A54 9页6的载体材料 0028 本发明所述的自由基产生化合物为过氧化苯甲酰 青蒿素 叔丁基过氧化氢等有机过氧化物 0029 本发明所述的自由基释放体系的制备方法 包括如下步骤步 骤A 自由基产生化合物 基团 通过物理浸渍被装载入介孔二氧化硅 基材料或者通过化学基团键接在介孔二氧化硅基材料的介孔孔道内 和 或者 介孔表面 步骤B 通过物理吸附作用或者化学键接方式在 介孔二氧化硅基材料表面或者介孔孔道内部负载pH响应性的壳聚糖 聚合电解质 实现所装载化合物的有效包覆以及后续的pH响应性释 放 步骤A 和步骤B 的顺序根据具体的装载物质和壳聚糖负载方式 而有所调整 0030 本发明所述的介孔二氧化硅基的pH响应性自由基释放体系利 用纳米粒子本身在肿瘤组织周围的EPR效应 可以实现纳米粒子对于 肿瘤组织的靶向输运 本发明所述的自由基释放体系的制备方法简便易行 本发明所述的pH响应性自由基释放体系可以响应性地在肿瘤组织附 近 pH 6 5 产生自由基 而在正常组织处 pH 7 4 不释药 从而 避免了自由基对正常组织的损伤作用 因此 具有重大的医药业应用前景和价值 0031 图1为本发明的一个实施方式中制备的空心介孔二氧化硅纳米 粒子 HMSNs 的透射电子显微照片 TEM 图2为本发明的一个实施方 式中制备的载有过氧化苯甲酰 BPO 的空心介孔二氧化硅纳米复合物 BPO HMSNs 的傅里叶变换红外光谱图 FTIR 图3为本发明的一个 实施方式中制备的BPO HMSNs Cs 2的释放液的紫外 可见吸收光谱 0032 下面进一步例举实施例以详细说明本发明 同样应理解 以下实施例只用于对本发明进行进一步说明 不能理 解为对本发明保护范围的限制 本领域的技术人员根据本发明的上 述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围 下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例 即本领 域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择 而并非要限 定于下文示例的具体数值 0033 实施例1制备包覆壳聚糖 Cs 和装载过氧化苯甲酰 BPO 的空 心介孔二氧化硅纳米粒子 BPO HMSNs Cs 1 0034 步骤A 制备空心介孔二氧化硅纳米粒子 HMSNs 首先 利用st ober方法制备实心二氧化硅纳米球 之后 将制备出来的实心二氧化硅纳米球 200mg 分散到40mL去离子 水中 并超声15分钟以分散其中的纳米粒子 在此期间 将300mg十六烷基三甲基溴化铵 C16TAB 分散到60mL去离 子水 60mL乙醇和1 3mL氨水中 室温下混匀 之后 将上述超声后的实心二氧化硅纳米球悬浮液加入到C16TAB混 合液中并超声1小时 之后 向上述混合物中快速加入0 53mL正硅酸乙酯 TEOS 并继续搅 拌7小时 反应结束后 将获得的白色沉淀物离心 之后 将这些沉淀物重新分散到0 4M Na2CO3水溶液中 并在50 条件下磁力搅拌13小时 最终获得的白色沉淀物经离心 醇洗后真空干燥 最后 通过离子交换法去除所制备的空心介孔二氧化硅孔道内的表 面活性剂C16TAB将上述获得的干燥后的样品 0 5g 分散到含有95 的乙醇水溶液和0 2g硝酸铵的混合液说明书103961713A65 9页7中 将此混合物在60 下磁力搅拌5小时 产物经离心 醇洗后真空干燥 即可得空心介孔二氧化硅纳米粒子 HMSNs 0035 图1为本实施例制备的空心介孔二氧化硅纳米粒子 HMSNs 的 透射电子显微照片 TEM 由图1可见所制备的空心介孔二氧化硅纳米球呈规整的球形结构 直 径约为350nm 所制备的球形二氧化硅为空心并具备清晰的介孔孔道 介孔壁厚约 为80nm 0036 步骤B 将过氧化苯甲酰 BPO 装入空心介孔二氧化硅纳米粒子 HMSNs 采用简单的物理浸渍方法装载过氧化苯甲酰 BPO 首先将由步骤A 获得的HMSNs分散到BPO丙酮溶液中 将此悬浊液在 黑暗环境下常温搅拌12小时 之后 将获得的悬浮液离心 用少量乙醇洗去表面吸附的BPO分子 之后真空室温干燥 即可获得装载了BPO的HMSNs 标记为BPO HMSNs 0037 图2为本实施例制备的装载BPO的空心介孔二氧化硅纳米粒子 BPO HMSNs 的傅里叶变换红外光谱图 与单纯的HMSNs相比 在BPO HMSNs中出现了位于1760 1228 1000和7 06cm 1处的BPO的特征峰 这些特征峰分别对应于过氧化苯甲酰的 C O 1760cm 1 C C 1600 1450cm 1 C H 706cm 1 和 C O 1228和1000cm 1 从而证明了BPO的成功装载 0038 步骤C 对BPO HMSNs进行表面壳聚糖 Cs 包覆将0 6g壳聚糖加 入到100mL10 的乙酸水溶液中常温搅拌24小时 得到0 6 的壳聚 糖溶胶 然后用氢氧化钠将溶液的pH调节至6 0 将步骤B 中制得的BPO HMSNs分散到上述的壳聚糖溶胶中 缓慢搅拌 24小时 之后 离心 水洗后 干燥即得到壳聚糖 Cs 包覆的载有BPO的介孔 二氧化硅纳米粒子 标记为BPO HMSNs Cs 1 0039 用透射电子显微镜 TEM 观察所制备的表面包覆有壳聚糖并装 载有BPO的介孔二氧化硅纳米复合物 BPO HMSNs Cs 1 TEM结果显示 HMSNs的表面有一层有机物分子覆盖 所形成的纳米 复合物相对于之前的HMSNs 颗粒尺寸因为壳聚糖的包覆而略有增加 TEM清楚的表面了壳聚糖在纳米复合物表面的成功包覆 0040 实施例2制备键接壳聚糖 Cs 和装载过氧化苯甲酰 BPO 的空 心介孔二氧化硅纳米粒子 BPO HMSNs Cs 2 以及pH响应性的BPO释放评价 0041 步骤A 制备空心介孔二氧化硅纳米粒子 HMSNs 按照实施例1 的步骤A 制备得到HMSNs 步骤B 对空心介孔二氧化硅纳米粒子 HMS Ns 表面进行 GPTMS修饰利用HMSNs表面富含硅羟基的特点 将HMSNs与硅烷偶联剂 环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷 GPTMS 反应 使HMSNs的表面修饰一层 GPTMS分子 成为以环氧烷基为端基的HMSNs 标记为HMSNs G 以方便后续的壳聚糖修饰 步骤C 将过氧化苯甲酰 BPO 装入HM SNs G采用简单的物理浸渍方法将过氧化苯甲酰 BPO 分子扩散进入HMSNs G的介孔孔道 将步骤B 获得的HMSNs G分散到BPO丙酮溶液中 在黑暗环境下常温搅拌12小时 之后 将获得的悬浮液离心 用少量乙醇洗去表面吸附的BPO分子 之后真空室温干燥 即可获得装载了BPO的HMSNs G 标记为BPO HMSNs G 步骤D 在BPO HMSNs G表面键接壳聚糖 Cs 说明书103961713A76 9页8BPO HMSNs G表面键接了大量的环氧烷基 利用环氧烷基与壳聚糖的氨基在酸性 催化下的环氧烷基 氨基加成反应 将Cs键接到BPO HMSNs G表面 将0 6g壳聚糖加入到100mL10 的乙酸水溶液中常温搅拌24小时 得 到0 6 的壳聚糖溶胶 然后用氢氧化钠将溶液的pH调节至5 0 将步骤C 获得的BPO HMSNs G分散到上述的壳聚糖溶胶中 在黑暗条件下常温搅拌12小时 静置 6小时 之后调节溶液的pH至7 4 经离心 水洗 干燥后即可得到表面键接壳聚糖 Cs 并装载BPO的二 氧化硅纳米复合物 标记为BPO HMSNs Cs 2 对获得的BPO HMSNs Cs 2进行能量色散谱 EDS 分析发现 与HMSNs相比 在BPO HMSNs Cs 2中出现了明显的C元素的吸收峰 说明了Cs的成功键接 步骤E 评 价BPO HMSNs Cs 2的pH响应性的BPO释放将BPO HMSNs Cs 2分散到不同pH的PBS溶液中以检测所制备的BPO HMSNs Cs 2中BPO的释放情况 选择pH7 4和6 5的PBS溶液是为了分别模拟正常组织细胞环境 pH 7 4 和发炎组织和癌细胞等病变组织环境 pH 6 5 将混合液至于室温下的摇床上轻轻摇晃 在特定的时间间隔 将混合液离心 并从上清液中取出3mL用于紫外 可见吸收光谱测定 于此同时 向离心后的混合液中加入3mL新鲜的释放介质 混合液经 混匀后 继续至于摇床上 用于后续的药物释放分析 为了测定所获得的溶液中BPO的含量 对所取出的释放介质经乙醇稀 释后 将获得的乙醇溶液进行紫外 可见吸收光谱测定分析 每份测试做三次 对三次的测试结果取平均值 0042 图3是BPO HMSNs Cs 2的释放液的紫外 可见吸收光谱 从图中可以看出 释放介质中BPO在234nm处有一个明显的吸收峰 这与BPO乙醇水溶液的吸收峰 max 234nm 是一致的 这就说明所 释放出来的BPO保持了良好的稳定性 0043 根据紫外 可见吸收光谱分析所获得的BPO的累积释放曲线发 现BPO HMSNs Cs 2中BPO的释放具有明显的pH响应性 在pH7 4的PBS环境中的释放量要明显低于在pH6 5的PBS环境中的药 物释放量 这种巨大的释放差异主要是由以下原因引起的壳聚糖中的氨基的离 子化状态和pH有很大的关系 当处于pH 7 4的释放介质中 壳聚糖 分子呈现有序的团聚态 壳聚糖塌陷的网络结构有效的阻止了BPO从 BPO HMSNs Cs 2中释放出来 与pH7 4条件下的受限的释放相比 在pH6 5的PBS溶液中 BPO的释 放速率有所增加 这主要是由于HMSNs表面的壳聚糖分子在不同pH环 境中的柔性和膨胀行为引起的 当处于酸性的微环境 pH6 5 下 壳聚糖的氨基发生质子化 进一步 的 PBS溶液中的抗衡离子会在壳聚糖聚电解质表面聚集以补充多余 的电荷 这种富集会引起溶液渗透压的增加 这种增加的渗透压使 得更多的水分子从溶液中进入壳聚糖聚电解质层 结果 壳聚糖层 膨胀成为一种疏松多孔的网络结构 并从之前的有序团聚态变为一 种杂乱的柔性团聚态 这就使得HMSNs表面部分的介孔孔道被释放 进而导致后续的加速的BPO释放 基于以上的分析 我们可以推断 壳聚糖赋予了HMSNs载体一种pH响 应的可控性释放特性 也就是说 在病变组织附近 BPO加速释放 但是 在正常组织的微环境下基本不会产生BPO的泄露 这种pH响应下的BPO释放特性增加了BPO的治疗效率并降低了它对正 常组织的毒副作用 0044 实施例3制备过氧化氢修饰的介孔二氧化硅纳米粒子 MSNs OOH 步骤A 制备介孔二氧化硅纳米粒子 MSNs 将0 28g氢氧化钠 NaO H 和1 0g十六烷基三甲基溴化铵 C16TAB 分散到480mL去离说明书10 3961713A87 9页9子水中 并在80 下剧烈搅拌1个小时 之后将5 0mL正硅酸乙酯 TEOS 加入上述混合液中 并继续在80 搅 拌2小时 反应结束后将获得的白色沉淀物离心 用大量乙醇洗 之后真空冷 冻干燥 最后 通过离子交换法去除所制备的介孔二氧化硅孔道内的表面活 性剂C16TAB将上述获得的干燥后的样品 0 5g 分散到含有95 的乙 醇水溶液和0 2g硝酸铵的混合液中 将混合物在60 下磁力搅拌5小 时 产物经离心 醇洗 真空干燥 即可得介孔二氧化硅纳米粒子 MSNs 步骤B 制备过氧化氢修饰的介孔二氧化硅纳米粒子 MSNs OOH 利用硫酸和过氧化氢混合物的强氧化性 使介孔硅表面发生过 氧化反应从而获得过氧化氢修饰的介孔二氧化硅纳米粒子 在0 的冰浴中 将由步骤A 制得的MSNs分散到65 的硫酸和30 的 双氧水混合液中 将获得的悬浊液超声30分钟后 继续磁力搅拌4小时 将所获得的悬浊液离心 并用大量的水洗 直到溶液的pH达到7左右 最后将获得的白色沉淀物室温真空干燥 即可得到过氧化氢修饰 的介孔二氧化硅纳米粒子 标记为MSNs OOH 0045 实施例4制备叔丁基过氧化的介孔二氧化硅纳米粒子 MSNs OO CH3 3 及自由基产生评价A 制备介孔二氧化硅纳米粒子 MSNs 按 照实施例3的步骤A 制备得到MSNs 步骤B 制备表面氯化的介孔二氧 化硅纳米粒子 MSNs Cl 介孔二氧化硅纳米粒子 MSNs 表面存在大量的硅羟基 氯化亚砜 SOCl2 是有机合成中常用的硅羟基等基团的氯化剂 先用SOCl2对MSNs进行氯化 将步骤A 制得的干燥的MSNs 2 0g 分散到90mL SOCl2和100mL氯仿混合液中 经超声30分钟后 在磁力搅拌下回流2 4小时 反应结束后 将获得的产物抽滤 用氯仿和丙酮洗一遍以除去多余 的SOCl2 之后真空干燥 即可得到表面氯化的介孔二氧化硅纳米粒 子 标记为MSNs Cl 将所得的MSNs Cl转移至手套箱中充氮气保护 以用于后续的过氧化修饰 步骤C 制备表面叔丁基过氧化的介孔二氧化硅纳米粒子 MSNs OO CH3 3 将步骤B 制得的MSNs Cl分散到90mL二氧六环和12mL叔丁基过氧化氢 TBHP 混合液中 并 向其中加入0 3g NaHCO3 反应混合物在20 下干燥的氮气氛围中搅拌反应12小时 反应结束后 悬浊液经抽滤 甲醇洗 之后在室温真空干燥 即可 获得表面叔丁基过氧化的介孔二氧化硅纳米粒子 标记为MSNs OO CH3 3 步骤D 评价MSNs OO CH3 3产生自由基的特性使用荧光实验检测MSNs OO CH3 3产生出来的自由基 为了检测MSNs OO CH3 3产生自由基的特性 细胞在给予MSNs OO CH3 3培养4小时后 我们向细胞培养基中加入了一种非荧光的探 针2 7 二乙酰二氯荧光素 DCFH DA 进一步培养30分钟之后 进行荧光显微镜观察 实验结果发现细胞在给予MSNs OO CH3 3培养后 出现了明显的绿色DCF荧光 这就说明在培养过程 中有氧自由基的产生 相比之下 空白组细胞内基本上看不到荧光 说明了所构建的MSNs OO CH3 3可以有效的实现自由基的释放 0046 实施例5制备包覆壳聚糖 Cs 和装载青蒿素 ART 的空心介孔 二氧化硅纳米粒子 ART HMSNs Cs 1 步骤A 制备空心介孔二氧化硅纳米粒子 HMSNs 说明书103961713A 98 9页10按照实施案例1的步骤A 制备得到HMSNs 步骤B 将青蒿素 ART 装入空心介孔二氧化硅纳米粒子采用简单的物理浸渍方法装载 青蒿素 ART 首先将步骤A 获得的HMSNs分散到ART乙醇溶液中 在黑暗环境下常 温搅拌12小时 之后 将获得的悬浮液离心 用少量水洗去表面吸附的ART分子 之 后真空室温干燥 即可获得装载了ART的HMSNs 标记为ART HMSNs 步骤C 对ART HMSNs进行表面壳聚糖 Cs 包覆将0 6g壳聚糖加入到10 0mL10 的乙酸水溶液中常温搅拌24小时 得到0 6 的壳聚糖溶胶 然后用氢氧化钠将溶液的pH调节至6 0 然后将步骤B 中制得的ART HMSNs分散到上述的壳聚糖溶胶中 缓慢 搅拌24小时 之后 离心 水洗 干燥即得到壳聚糖 Cs 包覆的载有ART的介孔二 氧化硅纳米粒子 标记为ART HMSNs Cs 1 0047 对制得的HMSNs和ART HMSNs Cs 1进行氮气洗脱附等温线分析 分析结果发现 单纯的HMSNs呈现出典型的Langmuir IV型等温线 在相对压 P P0 位于0 3 0 4之间有一个明显的毛细管收缩 相比之下 经ART装载和进一步的壳聚糖包覆之后 ART HMSNs Cs 1样品中基本已检测不到相对压的变化 我们推断 壳聚糖分子可能吸附于介孔二氧化硅的孔道表面 使得 介孔孔道被阻塞 这也间接的证明了Cs在介孔硅纳米粒子表面的成功包覆 0048 实施例6制备键接壳聚糖 Cs 和装载青蒿素 ART 的空心介孔 二氧化硅纳米粒子 ART HMSNs Cs 2 以及所产生的自由基的细胞毒性