【毕业学位论文】（Word原稿）利用噬菌体展示技术鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原表位-兽医生物技术硕士论文

密级 : 论文编号 : 学位论文 利用噬菌体展示技术鉴定 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原表位 A 国农业科学院硕士学位论文 摘 要 I 摘 要 抗原表位，又称抗原决定簇，是抗原分子抗原性的基础。正确而详细地绘制抗原表位图谱对疾病的诊断、设计无毒副作用的多表位疫苗以及免疫治疗试剂等具有积极的意义。因此目前在预防医学领域许多关于以表位为基础的如表位疫苗和特异性诊断试剂等的研究也就成了热点 。 而噬菌体展示技术作为近年来新兴起的研究蛋白质抗原表位的有利工具，已经成功地鉴定出了多种病原微生物的抗原表位。这就为揭示一些病原体未知 的抗原表位，从而进一步达到预防和控制疾病的发生提供了条件。 猪繁殖与呼吸综合征（ 由 以妊娠母猪的繁殖障碍以及各年龄猪呼吸道症状为特征的一种传染病。该病于 1987 年首次在美国发现，目前，已广泛流行于世界各国，给养猪业造成了巨大的经济损失。 1996 年我国分离到第一株 毒，命名为 。虽然对该病毒的一些分子生物学特已经进行了深入研究，但迄今为止，对于 的抗原表位还没有 报道。为深入了解 的抗原结构，便于设计科学合理的疫苗和诊断试剂，我们对 进行了抗原表位的鉴定。 本研究利用噬菌体随机 7 肽库对 蛋白的单克隆抗体 行了 3 轮筛选，得到了 3 个模拟表位：“ “ “ 为进一步研究表位结构，本研究构建了 因特异性肽库，利用 行了 3 轮筛选， 获得 3 个阳性噬菌体克隆。序列分析表明，这 3 个克隆都展示有“ 9 个氨基酸的序列，对应于 N 蛋白的 79 氨基酸残基（ 9人工 合成这段表位编码序列并进行原核表达，利用单抗 表达产物进行 析和 定，均为阳性。由此表明 的 一个线性 B 细胞抗原表位，并将其命名为 通过序列比较发现， （ 1998） 在 N 蛋白中 鉴定 的一个构象表位（由 1 0成）的 0列完全相同，而 0 1现二者存在 2 个氨基酸的差异 (60 59 和 65 64)。 个半胱氨酸（ 而 中含有 3 个半胱氨酸（ ，因此二者的 N 蛋白在 通过二硫键形成高级结构的方式可能不同，导致两种蛋白具有不同的空间结构和抗原性 。 二级结构分析发现， 9域以 折叠为主，这种构型有助于表位的形成。蛋白的三维结构显示， 9 个氨基酸多肽暴露于蛋白的表面。 3 个模拟表位 与表位 序列“ 比，相同的氨基酸很少，但是各表位氨基酸的极性却有一个共同的特征：亲水性氨基酸比例较大，疏水性氨基酸比例较少。通过与 41 株美洲型分离株的 N 蛋白的序列进行比较，发现 序列在 美洲型毒 株中高度保守。 因此，我们鉴定的表位 一个 在 美洲型毒 株中保守的 线性 B 细胞抗原表位 。 关键词 噬菌体展示，抗原表位，猪繁殖与呼吸综合征病毒 本研究得到国家重点基础研究发展规划项目 (973) (资助 I or is an to a in of A it a of In be of a to to of is an of as in in It in 987. is in it is In 996, no is so To of we in by a by a 3 no To we by 3 of 3 a to 79 A to 3H2 We is a of is to 0V is of a of 10et in 0 to 1V In we of So we of in of of is of an a D is on of to be by No is of of In we by a a at 9 is 目 录 第一章 绪论 引言 . 1 内外研究现状 . 1 原表位的研究 . 1 别抗原表位的方法 . 3 菌体展示技术 . 5 繁殖与呼吸综合征概述 . 7 繁殖与呼吸综合征病毒抗原表位的研究现状 . 8 究内容和方法 . 11 究目的和意义 . 11 第二章 研究报告 试验一 利用噬菌体展示随机肽库鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原表位 . 12 1 材料和方法 . 12 库 、 菌 株与 单克隆抗体 . 12 抗的纯化 . 13 库的生 物淘选 . 13 一轮 淘选 . 13 菌体的扩增 . 14 菌体的滴定 . 14 菌体的第 2、 3 轮淘选 . 15 序模板的制备 . 15 列测定 . 15 菌体夹心 . 15 争抑制 试 验 . 16 2 结果 . 16 选的产率 . 16 列测定结果 . 16 菌体 . 17 争抑制试验 . 18 3 讨论 . 18 得模拟表位的原因 . 18 响噬菌体特异性的因素 . 19 试验二 猪繁殖与呼吸 综合征病毒 因特异性 噬菌体 展示 肽库的构建 及抗原表位的鉴定 . 21 1 材料与方法 . 21 株、 菌株、 噬菌粒、单克隆抗体与辅助噬菌体 . 21 因小片段的制备 . 22 因的获得 . 22 因随机小片段的制备 . 22 菌粒载体的制备 . 23 组噬菌粒的制备 . 23 效 感受态 细胞 的制备 . 23 菌体随机肽库构建 . 24 因特异性肽库质量的测定 . 25 因特异性肽库容量的测定 . 25 因特异性肽库随机性的测定 . 25 基因特异性肽库的淘选 . 26 噬菌体单克隆的制备 . 26 菌体 . 26 菌体阳性克隆的测序 . 26 位蛋白的抗原性印证 . 26 然表位与模拟表位的竞争抑制试验 . 28 2 结果 . 28 因随机片段及噬菌粒载体 . 28 因特异性肽库的容量 . 29 因特异性肽库随机性的测定 . 29 菌体的 应 . 30 位的序列 . 30 位原核表达产物的 应 . 30 然表位对模拟表位的竞争抑制 . 32 3 讨论 . 33 位 其它分离株相当区域的表位进行比较 . 33 拟表位与天然表位 . 36 机肽库与基因特异性肽库 . 36 响基因特异性肽库容量的因素 . 37 菌体载体与噬菌粒载体 . 37 克隆抗体与多克隆抗体 . 38 结 论 . 39 参考文献 . 40 致 谢 . 47 作者简历 . 48 中国农业科学院硕士学位论文 绪 论 - 1 - 第一章 绪 论 引 言 在抗原分子表面具有特殊立体结构和免疫活性的化学基团称为抗原决定簇（ 由于抗原决定簇通常位于抗原分子的表面，因而又称为抗原表位（ 戴和平等，2002），是 具有刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞并能够与抗体或细胞识别的部位 。正确而详细地绘制抗原表位图谱对疾病的诊断、定点改造蛋白质分子以降低蛋白质药物的免疫原性，设计无毒副作用的人工疫苗以及免疫治疗剂等有重要的意义。例如， 基于多个表位的疫苗可以避免由于病毒的变异而造成的免疫失败， 又很容易与野毒株区别开来，为疾病的净化提供条件。 猪繁殖与呼吸综合征（ 猪繁殖与呼吸综合征病毒（ 起的一种重要的经济病，以妊娠母猪流产、死产、弱胎、木乃伊胎等繁殖障碍及各年龄阶段猪的呼吸道症状和高死亡率为特征 。自 1987 年首次爆发以来，仅十余年的时间就遍布了全球，给养猪业带来了巨大的经济损失。尽管世界各养猪大国对 予了足够的重视，但是到目前为止人们对 构蛋白及非结构蛋白的功能 、病毒的致病机制、病毒的持续感染机制、机体对病毒的免疫机制等缺乏深入的研究，并由于这些方面的欠缺而导致对疾病的控制不利，致使目前 是威胁各国养猪业的一个极重要的传染病。每年用于预防接种、治疗、扑杀的费用数以亿计，因其影响畜产品的贸易所造成的间接损失更是不可估量的。 内外研究现状 原表位的研究 基于表位的疫苗研究 ： 从一定意义上说，表位疫苗是缩微的 亚单位 疫苗。 亚 单位疫苗或多肽疫苗是 利用体外表达的重组蛋白或多肽（或直接从病毒粒子中分离出保护性的病毒亚单位蛋白）制成， 它们除含有抗原表位 及其侧翼序列外，还有其它很多与抗病原大分子免疫无关的序列。而表位疫苗利用定位精确、氨基酸序列较短的抗原表位，既能够有效地被免疫系统识别、递呈，又能诱发机体产生特异性体液和细胞免疫应答；同时较短的序列很容易合成，易于在载体中插入多个表位构建基因工程多表位疫苗；对于载体的选择来说，较小的外源表位基因片段对载体的克隆能力要求较低，易于进行分子操作。一般免疫系统识别、递呈抗原时仅需要十几个氨基酸，与抗体结合仅需要几个氨基酸，或者说关键的氨基酸只有 3 et 1995; et 1997; Wu et 2001; et 2001）。 对于具有 高度变异性的病毒（如口蹄疫病毒、流感病毒等），应用的疫苗株可能因其与当前的流行株不匹配而不能提供有效的免疫保护，然而基于多表位的疫苗含有广谱的表位信息，可以避免因病毒变异而造成的疫苗免疫失败 （ et 2001） 。 在各分离株中高度保守的表位序列（特别是中和表位），在疫苗的研制中具有重要的参考价值（ 国农业科学院硕士学位论文 绪 论 - 2 - et 2002）。 目前已有较多关于多表位疫苗的报道。基于病 毒、寄生虫或细菌抗原表位的疫苗能够诱导接种动物产生特异性抗体，使病毒或寄生虫的载量有所下降。 1999） 将 淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（ 合入狂犬病病毒 疫小鼠后，用致死剂量 的保护率可达 70。 2001） 用串联的 联后，免疫小鼠、兔等可产生微弱的抗体应答和 利用合成的 -H 疫猪后可以检测到中和抗体 （ et 2001） 。利用 禽流感 个 对禽流感病毒的攻击也可以产生一定的免疫保护（彭金美， 2003）。在细菌学方面，有人利用 展示 肉毒梭菌（ 现在小鼠体内能诱导产生特异性抗体 （ Wu et 2001）。而 对于寄生虫病的控制来说，利用虫体作为疫苗显然是不合适的，一般采用亚单位（表位）疫苗进行接种。欧阳理等（ 2002）通过筛选噬菌体肽库得到日本血吸虫（ 模拟表位，免疫小鼠后 有明显的免疫保护，成虫的载量减少 活性虫卵的载量减少 因此，表位的鉴定对于预防寄生虫病来说也是极为重要的。由此可见 不仅天然表位可以诱发机体产生抗体，模拟表位也可以作为表位疫苗，用于预防病原微生物感染。 2001） 用呼吸道合胞体病毒 （ 的 4种模拟表位免疫小鼠，可以检测到中和抗体的产生。用 现免疫小鼠的病毒载量明显低于对照组。 利用噬菌体展示的 果发现免疫组病毒载量低于对照组，甚至随后检测不到病毒， 且不出现临床症状 （ et 2001; et 2001） 。 除可诱导免疫保护外，表位疫苗还可以作为标记疫苗（ 与野毒相鉴别。2002）将鼠肝炎病毒（ 细胞表位插入到鸡新城疫病毒（ 于 47用重组 以检测到 此，可以作为标记疫苗来区分野毒株与疫苗株。 然而，利用表位多肽单独进行免疫，往往不能取得理想的 效果。但可以通过将表位蛋白耦联到载体蛋白（如 （ et 2001） ，或者将表位进行串联（一般重复 2或多个中和表位串联再与载体蛋白耦联，另外也可以配合一些免疫佐剂使用，如铝胶佐剂或弗氏佐剂（ et 2000； et 1999； et 2000； Yu et 2000)。 在 提高 可以加入 et 2002）。 基于表位的 诊断研究 将 表位用于诊断目的，一般采取两种策略，一是使用高度保守的优势表位，二是将多个表位联合使用。但目前使用表位作为诊断试剂的报道还很少。 （ 2002）利用噬菌体展示技术鉴定出雌激素受体的模拟抗原表位，合成的模拟表位多肽可以代替天然蛋白进行定量免疫组化试验。常用的亚单位（多肽）诊断试剂主要是先用计算机软件分析各毒株中主中国农业科学院硕士学位论文 绪 论 - 3 - 要结构蛋白中比较保守的优势抗原区，进行克隆与表达，然后利用表达的蛋白作为 南等（ 2000）曾利用原核表达的蛋白抗原用于风湿性疾病的 印迹诊断。 别抗原表位的方法 抗原表位有两种分类方法：一是根据细胞抗原受体不同，分为 细胞抗原表位。另一是按结构不同，分为连续性抗原表位和不连续性抗原表位，前者又称线性表位，是由肽链上顺序连续的氨基酸组成；后者又称构象型表位，是由那些一级结构上不连续的氨基酸残基，经过肽链的折叠在空间聚集在一起而形成的一定的空间结构（沈倍奋， 2001）。 以其表面的 与蛋白抗原表位 （ 抗原决定簇 ）结合，此过程与抗原 相同。 抗原表位的预测法 ：该法适用于已知一级结构的蛋白质和多肽抗原线性表位的预测。现已被广泛应用，并具有较好的预测效果。主要有以下几种（ 吴敬等 , 2000）： 亲水性方案（ 白质抗原氨基酸残基可分为亲水性残基和疏水性残基两类。在机体内，疏水性残基一般埋在蛋白质的内部，而亲水性残基位于表面，因此蛋白的亲水部位与蛋白的抗原表位有密切的联系。现在多种生化分析软件（如常用的亲水性算法都以 过软件分析蛋白质的氨基酸序列即可对其抗原性有一个大致的认识。但是从对一些已经精确定位的抗原表位来看，亲水性部位与抗原表位并无很好的一致性，如 17 et 2001），该部位的亲水指数接近于 0。因此说，高亲水性部位不一定是表位，表位也不一定是亲水性强的部位。 可及性方案 （ 表面可及性，指抗原表位一般位于蛋白质分子的表面，易于与抗体相结合。 可塑性方案 （ 指蛋白抗原构象不是刚性不变的 ， 其多肽骨架有一定程度的活动性 ，活动性强的氨基酸残基即可塑性大的位点 ， 易形成抗原表位。 二级结构预测方案 （ 认为 折叠结构多出现在蛋白质抗原的表面 ，利于与抗体结合 ， 较可能成为抗原表位。而 螺旋、 拐角结构规则较难结合抗体，一般不作为抗原表位。 助于暴露在蛋白质表面（ 国农业科学院硕士学位论文 绪 论 - 4 - et 1997; et 1998）。通过对 构的分析，发现血清型的差异主要集中在暴露于蛋白质表面的 et 2001）。在各氨基酸中，认为脯氨酸在表位中扮演着重要的角色，脯氨酸的 种氨基酸构象有助于 折叠的稳定 （ et 1997）。 1996）在鉴定链球菌抗原表位时，利用人工合成一系列的 9肽与链球菌感染病人的阳性血清进行 现 3个含有脯氨酸重复的序列的 不含脯氨酸重复的序列 的 外，研究表明，在 蛋白羧基端的一个表位中，脯氨酸是该表位的关键氨基酸，如果这个脯氨酸被其它氨基酸替换后，该表位将不能被相应的抗体识别 （ et 2000） 。 用上述各种方案单一的来预测表位，其准确率均不高，最好将多种方案综合考虑。概括而言，作为 利于与抗体结合。另外，具有一定柔韧性，因为抗原与抗体结合时蛋白构象有一定的变化。用软件预测出的抗原表位需用实验进一步验证。在实际应用中，常用 的区域，经克隆、表达，检测表达产物与抗体的反应性，但常因表位预测不准或表达产物没有糖基化、不能正确的折叠而不与抗体反应。 化学“切割”法或酶解法 ：将纯化的蛋白质多肽用某种化学试剂或蛋白酶切割成若干小片段，经 分离开来，然后转印到硝酸纤维素膜上，再用单克隆抗体或高免血清进行 测小段多肽与抗体是否有反应，有反应的多肽片段中就含有抗原表位。使用这种方法需要知道蛋白质的一级结构，并且事先清楚切割片段的大小。在实际工作中可以将蛋白质序列输入用工具栏 中的“ “ 以列出几种试剂（或酶）的切割位点和切割片段的数量，例如： 以从甲硫氨酸（ M）处将多肽切割成若干小片段。 肽探针扫描技术（ 术 ）： 术 是指合成连续的重叠的短肽，与相应的抗体反应，分析检测结果以确定阳性反应片段。这一技术要求有明