【毕业学位论文】（Word原稿）棉铃虫Bt毒素受体蛋白—氨肽酶N1基因克隆及其在昆虫细胞系的表达-农业昆虫与害虫防治硕士论文

I 摘 要 棉铃虫 世界性重要农业害虫。 虫晶体蛋白（ 其对靶标昆虫的高度特异性和对人畜无害，使其相关基因成为目前应用广泛的基因。 随着转 因棉花种植面积的快速增长， 转入的抗虫基因在棉花体内持续表达，使得棉铃虫在整个生长周期都受到 虫蛋白的高压选择，存在产生抗性的风险，因此，棉铃虫的抗性问题不容忽视。通过对棉铃虫对 生抗性的机制的研究，可以为棉铃虫的抗性治理提供 理论指导，并为棉铃虫的防治提供新的思路。 本论文利 用 法分别扩增 了 对 素敏感 （ 96和 对其具有 抗性 ( 棉铃虫 五龄幼虫 的中肠氨肽酶 , 因的去信号肽片断 ，比较了它们的碱基和氨基酸的差异，并成功地将其在昆虫杆状病毒表达系统里进行表达。主要结果如下： 基因克隆与 测定 结果，鉴定认为棉铃虫 氨肽酶 N (因家族的 1 个成员 ， 其列具有 2982 个核苷酸 ， 编码产生 993 个氨基酸的蛋白质。其 C 端有一段 25 个氨基酸组成的片段具 有亲脂性和跨膜特性。 利用 件比对 96 系的序列得知：抗性品系有 3 个碱基缺失，即 36失， 16 个碱基发生突变，即 579A T， 803C T， 854G A， 1250C T， 1460T C，1486A T， 1497C T， 1647G C， 2135T C， 2231G A， 2586T C， 2597A T， 2615A G，2703G C， 2831G T， 2859A C，导致 1 个氨基酸缺失，即第 45 位的苏氨酸缺失， 5 个氨基酸发生突变，即 194 苏氨酸丝氨酸， 550 缬氨酸 异亮氨酸 ， 861 异亮氨酸苏氨酸， 902 丙氨酸脯氨酸， 954 苏氨酸脯氨酸。其中 194 苏氨酸丝氨酸位于与 素 合的活性区，与棉铃虫对 性存在潜在的密切关系。 861 异亮氨酸苏氨酸，苏氨酸残基提供潜在的新磷酸化位点，用于翻译后修饰，此位点突变会破坏它邻近的半胱氨酸残基形成二硫键能力，打破受体的三级结构，可能导致抗性产生。 将 隆入 达系统中杆状病毒转移载体 多角体基因启动子的下游，筛选出重组质粒 转化大肠 杆菌 体内进行重组，经抗性和蓝白斑筛选，获得杆状病毒重组载体 染粉纹夜蛾（ 胞（ 获得含 因的重组杆状病毒，重组病毒感染 胞后，得到表达的蛋白。析和点杂交显示，目的基因得到了表达。 这些结果将为分离、纯化受体蛋白，探索受体蛋白与 素的相互作用提供基础，为进一步研究抗性机制奠定基础。 关键词 棉铃虫，氨肽酶 N（ ），受体，杆状病毒表达系统，表达 is of to no to so to As t in H. of is So . t be on of . t t In 1 (in . t (96CR 6-S in . in as PN of ,982 93 5 6-S . A in 79th , 803CT, 854GA, 1250CT, 1460TC, 1486AT, 1497CT, 1647GC, 2135TC, 2231GA, 2586TC, 2597AT, 2615AG, 2703GC, 2831GT, 2859AC, in 36194 550 861 902 954 5In in 94th . is a 61 of of in It B e+, of of of to t to on . t. , 录 第一章 文献综述 . 1 言 . 1 t 的杀虫机理 . 2 体蛋白的种类及作用 . 4 结构特征及作用 . 6 铃虫体内 分布、与 结合模型及与抗性的关系 . 9 表达及功能研究 . 11 状病毒载体表达系统 . 11 论文研究的目的与意义 . 13 第二章 研究内容和技术路 线 .究内容 . 14 究技术路线 . 14 第三章 因的克隆及序列分析 .料与试剂 . 21 验方法 . 17 提取 . 17 转录 . 17 增 . 17 物的回收纯化 . 18 接 . 19 化 . 19 粒 提取 . 20 测 . 20 列测定 . 21 果与分析 . 21 信号肽序列的克隆 . 21 信号肽序列及序列分析 . 23 同抗性水平 信号肽序列及序列分析 . 24 论 . 26 第四章 表达及鉴定 .料与试剂 . 27 验方法 . 29 酶切重组和供体质粒 . 29 收 . 30 连接 . 30 化 . 30 粒 提取 . 31 酶切鉴定 . 31 制作 . 31 . 32 单 菌落 . 32 取基因组 . 32 定 . 32 转染 . 33 白鉴定 . 33 白鉴定 蛋白的纯化 . 34 果与分析 . 34 组转移载体 构建及鉴定 . 34 组杆状病毒的鉴定 . 36 组杆状病毒转染 胞 . 36 因在昆虫 胞中的表达 . 37 论 . 37 第 五 章 全文结论 .考文献 . 40 致谢 .者简历 .V 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 苄青霉素 氨肽酶 N 状缘膜囊 43状病毒表达系统 血清蛋白 云金芽孢杆菌 化 乙 锭 大霉素 基 磷脂 酰肌醇 丙基 代半乳糖苷 那霉素 kb 碱基对 道尔顿 化硝基四氮唑 OD 光度 酸盐缓冲液 合酶链式反应 丙烯酰胺凝胶电泳 环素 XD溴 4氯 3吲哚 D半乳糖苷 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 文献综述 言 苏云金芽孢杆菌 (目前全世界产量最大、使用最广的生物杀虫 剂。它的主要活性成分是一种或数种杀虫晶体蛋白 (又称内毒素（ (黄大昉 ,2001)。 敏感昆虫有强烈的毒性，而对高等动物和人无毒。现在 翅目和鞘翅目的昆虫，此外，研究还发现 膜翅目、同翅目、食毛目的多种害虫及植物病原、线虫、螨类和原生动物也有控制作用（ et 1998）。 由于 生的杀虫晶体蛋白对昆虫具有专一、高效和对人畜安全等优点，使其相关基 因成为目前应用广泛的抗虫基因。自 1987 年，比利时和美国的科研人员分别将 因转入烟草和番茄以来，先后获得了棉花、玉米、马铃薯、烟草、水稻、番茄等 40 多种能够高剂量表达 转基因植物，我国也先后将 因转入了烟草、甘蓝、棉花、玉米和水稻等作物 (黄大昉， 2001)。转 因棉花在我国于 1997 年 开始 商业化 种植 ，到 2005 年种植面积 已达到 330 万公顷 ，占棉花总播种面积的 66%（ 2006） 。 棉铃虫 属于鳞翅目，夜蛾科，实 夜蛾亚科，棉铃虫属，是世界性重要农业害虫。主要分布在北纬 50 度至南纬 50 度的亚洲、大洋洲、非洲及欧洲各地，它也是我国棉区的重要害虫之一。它具有寄主范围广、繁殖潜能大、种群能远距离迁移和对环境适应能力强等特点，条件适宜时常大面积暴发成灾，造成棉花、玉米、花生、豆类、蔬菜、花卉的严重损失，其中以棉花遭受的损失最大。 20 世纪 90 年代以来，我国北方棉区连续几年大暴发，仅1992 年因棉铃虫危害，我国棉花平均减产 30%左右，直接经济损失达 100 亿元，严重制约了棉花的生产 (郭予元， 1998)。究其原因，除自然条件适宜、繁 殖能力强等因素外，棉铃虫对化学农药的高抗性，特别是对拟除虫菊酯的高抗性是棉铃虫暴发的一个重要原因。由于抗药性的迅速上升，导致了棉花的严重减产，很大程度上挫伤了棉农植棉的积极性，种植面积锐减，使国民经济遭受了巨大的损失。同时，由于化学杀虫剂的大量施用，给环境带来了负面影响，破坏了自然界的生态平衡，给人类的身心健康带来了威胁，严重阻碍了农业的可持续发展。 转 因抗虫棉的杀虫活性高、有效持续时间长并且对整个植株都有保护作用，可显著降低农药的用量，且与其它防护措施的兼容性好，作为棉花害虫综合防治技术体系的基础设 施，具有很高的经济价值 (张少燕， 2002)，在国内外已经得到广泛的应用。 但是由于转入的抗虫基因在棉花体内持续表达，使得棉铃虫在整个生长周期都受到 虫蛋白的高压选择，存在产生抗性的危险。一旦棉铃虫对 基因棉花产生抗性，不仅会威胁各种 剂、转 因棉花和其他转物的使用寿命，而且会导致杀虫剂的大量使用，对环境造成负面影响。自 1985 年 物制剂产生抗性以来，国内外已发现 10 余种昆虫对 以产生抗性。 1990 年， 田间发现小菜蛾 剂产生抗性 。2001 年在澳洲新南威尔士（ 昆士兰州（ 田间抗性监 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 2 测中发现棉铃虫能够在 素的选择下存活下来。 2004 年， 道粉纹夜蛾温室对 剂产生抗性 。 室内筛选实验表明，多种昆虫 可以对 虫剂和转因棉花产生高度的 抗性，包括印度谷螟 (et 1994)， 干果斑螟 铃薯甲虫 et 2002） ， 北美杨叶甲 纹夜蛾，甜菜夜蛾 芽夜蛾 et 995），欧洲玉米螟 倦库蚊 棉铃虫 (梁革梅， 2000； et 2003)等。 许多学者曾从生物化学、分子 生物学、组织病理学等方面研究了 素的作用机制（ et 1998;et 003），及昆虫中肠环境对 性的影响等 （ et 1990; 邵宗泽 ,2001， 2002） 。 毒素杀虫作用的高度特异性暗示了在昆虫的中肠上皮 刷状缘 膜细胞 （ 上有特异的结合受体。活性毒素与昆虫肠体上的受体发生不可逆结合后，如何最终使细胞膜穿孔以及孔的特征，现在还是不很清楚，可谓是众说纷纭，有待于进一步的研究。但 比较公认的一点是：与受体结合后活性毒素的部分结构在受体的帮助下插入昆虫中肠上皮细胞的细胞膜而非直接作用于细胞器，并导致穿孔，也就是说 杀虫作用与昆虫肠体上的受体蛋白有着密不可分的关系 （ et 2005）。 t 毒素 的杀虫机理 尽管已经发现的 素有 100 多种，但是仅有几种被证明有防效，如 过 X 射线衍射分析， 三级结构已被分析，发现被激活后它们的 结构在总体上非常相似。它们都是由三个典型结构域 (成，即结构域，结构域，结构域。估计所有的 有与 类似的三级结构（ Li et 1991,1996; et 2001; et 2001）。结构域位于肽链的 N 端，由 7 个两性疏水的螺旋组成，是毒蛋白的毒性区域，其主要功能可能插入细胞膜内形成孔洞，其中 4 和 5可能是参与了孔洞的形成（ et 999; et 2001）。结构域位于肽 链的中间，是一个高度可变区，结构为三个反向平行的折叠，并形成三个裸露的环象结构，主要功能是决定毒素与不同昆虫受体特异性结合。结构域由二个反向平行的折叠形成包囊着 C 端的夹层结构组成，也是一个高度可变区，主要作用是毒素蛋白的杀虫专一性 (et 2000)，凝集素状结构识别受体分子的 (et 999;et 2000)，参与离子通道传导，并保护活化的活性多肽 N 端不被蛋白酶进一步降解 (Li et 1991)。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 3 图 构图（ 1991,1996） . 991, 1996） 素 被昆虫取食后，在昆虫体内 碱性 （ et 2005）、 专一性 蛋白酶（ et 2006） 的作用下，原毒素被分解成具有杀虫毒性的毒蛋白，后者和昆虫中肠上的毒素受体蛋白结合， 引起毒素构象的改变， 使得肠壁破损，形成孔洞，使得中肠的碱性内含物进 入血腔，血淋巴 升高，从而导致感病幼虫麻痹而死亡。而有些研究表明： 蛋白影响钾离子通道的运输，而不影响钠离子通道的运输。因此， 蛋白引起细胞膜在特异的位置 (离子通道 )上形成小孔，使离子通道失去作用，打破离子运输的平衡，从而引起细胞溶解而导致昆虫幼虫死亡 (et 2006)。值得指出的是，不同的 蛋白可能会影响不同的离子通道 (et 2006)，其细胞膜上具亲和性的受体也很可能就是离子通道上的某种组分。 素杀虫机制的另一种可能性是 蛋白与位于细 胞膜上的受体结合，引起受体构象的改变，使该运输系统出现异常，丧失了运输能力，甚至将细胞内的物质逆运而出，等效于细胞膜成孔，从而造成昆虫死亡 (et 1998)。 目前， 素蛋白插入完整细胞膜形成孔洞的机理还不清楚。毒素与膜的结合及毒素插入细胞膜前后的电生理变化等实验证实， 素结构域的螺旋结构中的短的多肽参与了孔洞的形成，这与预测的结果相符。 素作用后，昆虫中肠细胞膜两侧形成了强的势能，并且这种势能可能与孔洞的形成有关。 2001 年， 用多层薄片状脂质体 和双层平面脂质体膜模拟毒素与中肠细胞膜的结合试验，结果显示， 素的溶解是毒素和脂质体共同作用的结果，而多种 素的进一步作用是受体调节的结果。所以，推测 通过在膜上形成离子通道或孔洞起作用的。但是，毒素和细胞膜相互作用的分子机理还没有研究清楚。 昆虫体内细胞膜上 素造成孔洞的结构目前还不清楚，但是，人工合成膜体外模拟试验显示，毒素与膜结合后，毒素蛋白构象发生变化，即螺旋结构富集的结构域与结构域、分离，中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 4 包括 4 和 5 螺旋的发卡结构随后插入细胞膜，形成孔洞 (et 2001)。 体蛋白的种类及作用 虽然 蛋白抗性机制目前有不同看法，但受体蛋白及其与抗性的关系一直是大家研究的热点。已有许多学者对许多昆虫的 素受体蛋白进行了研究。 目前文献报道的 素受体蛋白主要包括以下几类：氨肽酶 N(钙粘蛋白 (族、碱性磷脂酶 (肌动蛋白 (糖脂 ( 肽酶 N (次在烟草天蛾 1994)中被发现为 结合蛋白，其分子量为 120合在 120残基 ， 的结合位点，主要依据为： 结合受 特异性抑制，而不是其他糖类；导致 能结合的结构域的突变，将检测不到 120et 2001)。随后多种昆虫的 分离和鉴定，且不同的昆虫 数量可能不一样。 120 为 受体蛋白已在 烟芽夜蛾 (et 1995)、舞毒蛾 et 1995）、小菜蛾、粉纹夜蛾 (et 1994)中被发现和鉴定（ et 995, et 996;et 995;et 997）。梁革梅（ 2005）利用 交证明棉铃虫中肠 主要受体蛋白为 120 170且 120白具有 性，是通过 定，可以利用 其从膜上解离下来。 et 2005）利用亲和层析法纯化棉铃虫中肠上 受体蛋白为 124 162 者均具有 性。 在烟芽夜蛾中除 120， 170被克隆和鉴定，还有 130 140过可能为 170降解产物（ et 995; et 997）。 2001 年 发现在烟芽夜蛾中存在与原来 同的 110 个 110蛋白质原来没有被鉴定为一种 它与澳洲棉铃虫 H. 样，含有不同的 守序列，根据澳洲棉铃虫的 列设计的烟芽夜蛾 增，得到与澳洲棉铃虫 89同源性的产物； 交表明该蛋白不能被大多凝集素识别，说明它缺失 125I 标记 突变体，该突变体改变了 结合位点，结果表明该突变体不能与120 170合，却能与 110 合，以上试验结果表