【毕业学位论文】（Word原稿）核果类果树胚珠培养及子叶再生体系构建果树学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 核果类果树胚珠培养及子叶再生体系构建 I 目 录 第一章 绪论 . 1 果类果树远缘杂交 . 1 缘杂交概述 . 1 究进展 . 1 缘杂交存在的问题及解决办法 . 2 培养研究进展 . 5 培养在果树育种中的作用 . 5 培养研究进展 . 5 响胚培养成苗率的因素 . 6 培养存在的问题 . 7 珠培养研究进展 . 7 珠培养的意义 . 7 珠培养研究现状 . 8 珠培养存在问题 . 8 胚子叶不定芽诱导研究进展 . 8 定芽诱导研究的作用 . 8 胚子叶再生研究现状 . 9 胚子叶不定芽诱导的影响因素 . 9 究目的与意义 . 10 第二章 核果类果树远缘杂交研究 . 12 料和方法 . 12 交组合的选配 . 12 粉的采集 . 12 粉 . 12 果率的调查及杂种胚败育时期的确定 . 12 果与分析 . 12 同杂 交组合亲和性的比较 . 12 种胚败育发育情况分析 . 13 种胚败育时期的确定 . 14 论 . 15 果类果树远缘杂交不亲和及败育发生分析 . 15 挽救技术用于远缘杂交育种 . 16 三章 杏、桃及杂种胚的胚珠 培养研究 . 17 料与方法 . 17 料 . 17 植体制备及培养程序 . 17 养基筛选 . 17 珠培养研究 . 17 果与分析 . 18 特杏胚珠培养 . 18 及杂交种胚珠培养 . 22 论 . 26 挽救技术用于果树杂交育种 . 26 珠培养影响因素分析 . 27 第四章 杏、桃及杂种胚的幼胚子叶不定芽诱导 . 29 料与方法 . 29 料 . 29 法 . 29 定芽诱导 . 29 胚子叶不定芽后期培养 . 30 计方法 . 30 果与分析 . 31 特杏幼胚子叶再生 . 31 及杂交种幼胚子叶再生 . 37 定芽后期培养 . 39 论 . 42 响幼胚子叶不定芽诱导的几个因子 . 42 定芽生长与发生特点 . 44 第五章 全文结论 . 45 论 . 45 珠培养 . 45 胚子叶诱导 不定芽 . 45 要创新点 . 45 果类果树四级培养体系的建立 . 45 考文献 . 47 致 谢 . 55 作 者 简 历 . 56 I 摘 要 桃、李、杏等核果类果树具有丰富的种质资源，早熟品种选育取得了显著的成绩，远缘杂交研究在种质创新与品种选育方面意义深远，而早熟品种与远缘杂交种都存在胚败育问题以及 桃、杏存在外植体再生困难的问题，制约着果树种质创新与育种研究的进程，研究并建立胚珠培养程序及桃、杏高效再生体系，有望解决缘远杂种胚及早熟品种胚的早期败育问题，同时为核果类果树组培快繁及遗传转化等相关研究提供技术支持，针对目前胚珠培养及再生研究在果树育种等相关研究中存在的局限性，试验以不同早熟桃品种、杏及桃杏、杏李胚珠为试材，研究了远缘杂种胚败育的发生，探讨了胚珠培养及幼胚子叶再生的相关影响因素，建立了凯特杏、桃早期胚珠培养程序，并对胚珠培养获得幼胚子叶进行不定芽诱导，建立了杏、桃幼胚子叶再生及后期培养整 个培养程序，最终获得了健康正常的不定芽植株，主要研究结果如下： （ 1） 盛 花 后 25d 的凯特杏胚珠（ ），尚未可见胚；生长培养中， 养基较 宜于胚珠生长，珠被划伤有利于胚珠的生长发育；以 基本培养基， 合诱导能力强；试验采用诱导方式获得了可见胚， 诱导出胚率为 80%。 盛花后 25d、 35d 取样的凯特杏胚珠，培养后获得幼胚子叶， 诱导不定芽 的适宜 ，诱导出芽率分别为 盛花后 50间取样的材料，适宜 度为 ，出芽率分别为： 而盛花后 60d 取样的材料，适宜 ，出芽率为 不 定芽主要发生在子叶的近轴面、胚轴连接处及子叶近轴端两侧。 在 25进行 21d 暗培养，盛花后 35d、 50d、 55d 和 60d 材料出芽率分别为 4下 28d 暗培养， 35d、 50d、 55d 和 60d 依次为 （ 2）不同桃品种间，胚珠培养成胚率有差异，盛花后 28d、 40d、 48d 的不同品种 ，均表现为早红 2 号最高，千年红次之，曙光最低；其中早红 2 号盛花后 28d 成胚率达 盛花后 48d 的早红 2 号 胚珠培养获得的幼胚子叶 ，在 度 下 ，诱导率为 盛花后 48d 的千年红、早红 2 号、早露蟠桃，在 的 度下处芽率分别为： （ 3）通过以上研究， 建立了凯特杏、桃早期胚拯救四级培养体系，即胚珠培养，获得可见胚（一级培养）；幼胚生长培养（胚培养），获得健壮幼胚（二级培养）；幼胚子叶再生，获得不定芽（三级培养） ；不定芽组培苗快繁（四级培养）。 关键词： 核果类果树 胚珠培养 幼胚子叶 不定芽 he as in in in be by or in as in in in of at of be by of a of at as of in of of as （ 1） 5to F=0)H T of is in of As of BA AA to up 0%. 5 5 of up of 0 5 of 0 in of In of of 5 1 5d、 50d、 55d、 60d 8 of (2)of of of of at 8d、 40d 8d of 8d 8d of 8d （ 3） As as to of to of of 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 乙酸 哚丁酸 动素 S 培养基 H H 培养基 T T 培养基 d ,3,N2， 35花后天数 中国农业科学院硕 士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 果类果树远缘杂交 缘杂交概述 植物的远缘杂交是指植物分类学上种、属及其以上分类单位之间植物的杂交，包括同属植物的种间杂交和不同属植物的属间杂交以及更高分类阶元之间的杂交，是实现种、属间基因转移的一条重要途径 ，在植物育种中得到了广泛应用（沈德绪 ， 1995； 2003； 1978）。植物远缘杂交可将近缘种、尤其是野生种的优良性状结合到栽培种上，以获得那些在栽培种中不存在但在其远缘物种中仍具有的优良性状，达到改善作物性状与品质、实现种质创新和品种改良的目的。果树可以通过远缘杂交 ， 打破种属间的隔离 ， 把两个物种经过自然界长期进化积累起来的有益特性 ， 在人工条件下进行重新组合 ，目前为止， 国内外已通过远缘杂交培育出许多优良品系。 我国是多种果树的起源中心，其中核果类果树中的桃、李、杏等树种，栽培 历史久远，种质资源丰富。如何充分利用现有资源，开创新的途径，加强种质间的基因交流，增加种质资源的遗传多样性及加快种质创新，对于实现我国果树的良种化，加快果树育种进展以及资源开发以及果树事业的可持续发展具有重要的意义。随着果树育种工作的不断深入，种内的遗传资源利用日益枯竭，同时也发现某些优良性状的基因库贫乏，仅仅利用种内资源进行常规育种难以取得很大突破，已远远满足不了目前果树育种的需要，而采用远缘杂交 ( 技术综合利用现有栽培种的优良性状和野生种的良好抗性等特性，拓 宽果树遗传资源范围，作为育种的一种方式，已成为种质创新的一条有效途径，在果树物种进化及新物种的产生方面具有重要的研究意义。 目前，远缘杂交已在一些果树种、属间杂交获得成功，在种质创新等方面取得了很大成绩。由自然杂交产生的远缘杂种也有很多，如东北的苹果梨，品质好、丰产而且抗寒，被认为是秋子梨和沙梨的天然种间杂种。福建的木萘，果形似桃，但果面不披绒毛，肉质似李，品质优良，可能是李与桃的种间自然杂交种。栽培的食用香蕉，有许多类型，是野生的“尖叶蕉”和“长梗蕉”杂交种。但由于远缘杂交不亲和性及杂种的不育性等障碍，使 得果树远缘杂交仍存在较大的难度。进一步研究果树远缘杂交不亲和的机制，探讨克服杂交不亲和性及杂种不育性的有效措施，有助于人们更有效地利用远缘杂交技术获得更多的远缘杂种，从而达到进一步丰富果树种质资源、扩大遗传多样性的目的。 究进展 核果类果树栽培种的桃（ ） 、李 ()、杏 (产于我国，同属于 蔷薇科（ 李属（ 分别属于桃亚属（ 李亚属（ 杏（ 亚属， 不仅 2n=16，而且无论是在植物学性状、生物学性状、染色体结构上，甚至在 构上均证明有很密切的关系，例如 2003）从桃上获得的一套 记可以覆盖整 个 李属（ 物的整个 基因组，为核果类果树远缘杂交的成功奠定了理论的中国农业科学院硕 士学位论文 第一章 绪论 2 可能性。 原产我国的李、杏在自然界中有着广泛的分布，常是交错混生，因此有自然交配的可能性和条件。 1985 1988 年全国李杏资源调查中收集到了一些李杏属间植物类型，张加延等（ 这些似李非李、似杏非杏的品种划为一个 新种，命名为李梅杏 (也有报道在杏属和樱属中存在新组合（李朝銮等， 1998），这些自然杂种的出现对于研究物种进化，亲缘关系以及演变过程提供了依据。 桃、李、杏是我国人们喜爱的传统夏令水果，营养丰富，美味可口，不但可以鲜食，还可以加工成多种食品，深受消费者的欢迎。在三个树种中，桃的风味浓厚，营养丰富， 李树和杏树抗寒性强，果实成熟早， 但生产和育种中存在的突出问题是桃的耐贮运性差，杏丰产性与耐贮运性不好，李风味不够，以及这些品种的抗病虫性。限制这些树种育种水平提高的主要因素是 这些果树 栽培种的 已有育种工作遗传背景狭窄， 尤其是桃以自花授粉为主， 使得这些树种的种质创新和育种工作很难取得突破性进展，充分利用现有资源，开创新的途径，是目前桃李杏研究的出发点，而远缘杂交技术为这个问题的解决提供了突破口。 核果类果树中有关桃、李、杏之间远缘杂交已有很多报道， 美国的 其是育种家 李杏杂交种上做了大量的工作，获得了称之为 杂交种。著名的园艺学家布而班克 (1962)以杏（ 中国李 (行种间杂交，创造了十几个有价值的种间杂种，其中有些结出硕大而品质风味良好的果实，有些则开花较迟，能避春霜和抗病等。 1989)在桃育种中应用 山桃（ 光核桃（ 交产生了新的类型，果肉无纤维，果实略扁，叶子为红色。 990)用桃品种 (巴旦杏 (交获得了 3 个果实。 美国培育出的杏李杂交品种味帝、 恐龙蛋等在我国种植也取得一定区域的成功。 国外研究中以前苏联研究学者的报道 较多，研究的领域多集中在改善果实品质及提高果树抗寒、抗病以及自花结实能等方面 ( et 996； et 1995；et 1988； et 1981； et 1978； et 1974； 974； )。 核果类远缘杂交不仅在种质资源创新和新品种选育等方面取得巨大成功，而且在新基因发现等方面取得了可喜的成绩，例如利用桃与杏杂交，杏与扁桃杂交获得 了永久性连锁群体。 国内的学者在这方面也进行了探索， 我国的龙圆黄杏 (曾烨等， 2001)及金皇后（王玉柱等，1998）均为李与杏的杂交种， 研究涉及到了果树远缘杂交亲和性（ 马瑞娟等， 2005；曹后男等，2003； 李玉晖， 2003； 马锋旺 ， 1996； 李锋等， 1995；俞明亮等， 1995；王广善， 1991； ）及杂种后代的遗传特性（刘孟军， 1998；刘保， 1993；王善广， 1991）等，相应地培育了一些远缘杂交新品种（ 王发林等， 2003； 曾烨等， 2000），并在栽培和生产中得到了广泛应用。 缘杂交存在的问 题及解决办法 由于不同物种间 亲缘关系的疏远，生殖隔离的存在， 复杂的遗传基础，染色体同源性差异，杂交父母本在受精前后的过程中缺少同源性遗传信息，双亲在生理上不协调，胚与胚乳不亲和，花器官形态、发育的差异等原因，使得远缘杂交很难成功，即存在不亲和现象。亲缘关系愈远的种属间杂交，不亲和现象就愈明显。 这种不亲和可分为受精前不亲和与受精后不亲和，也即是受精前障碍与受精后障碍， 其表现有杂交不亲和与杂种不育 。 对于果树来说，远缘杂交亲本之间的中国农业科学院硕 士学位论文 第一章 绪论 3 不亲和，已成为远缘杂交育种工作的主要障碍之一。 针对上述问题，各国的植物遗传育种学 家进行了大量的研究工作，如对物种间存在的杂交不亲和及杂种不育机理的认识以及对克服方法等的研究，这些工作对上述问题的解决，将大大有助于果树远缘杂交育种工作的进行。 解决这两种不亲和 需根据不亲和发生的特点有针对性的解决，主要包括体外授粉 (in 授精 (胚挽救技术；体外授粉授精 精 技术用于克服受精前障碍，胚挽救技术用于克服受精后障碍（ 李玉晖等， 2003）。 交不亲和性 （ 1）杂交不亲和现象及原因 果树的远缘杂交，理论上是可进行的，但又不 像种内杂交那样容易做到。研究认为，影响远缘杂交亲和性的因素，基本上是物种间遗传差异的反映（沈德绪， 1995），物种间亲缘关系越远，涉及到的影响因素越多，杂交成功的可能性越小。 在大多数情况下，远缘杂交受精过程或者完全不能进行，或者很难进行，即存在受精前不亲和现象。亲缘关系愈远的种属间杂交，这种不亲和现象就愈明显。影响远缘杂交不亲和性的因素主要有以下几种原因： 异种植物的柱头分泌物差异太大， 花粉不能在异种柱头上萌发； 花粉粒虽能萌发，但花粉管生长缓慢 或花粉管太短，甚至破裂，不能进入子房到达胚囊； 花粉管虽然能进入子房，到达胚囊，但不能受精； 或只有卵核或极核发生单受精。以上这些障碍发生在受精之前（ 称为受精不亲和，为配子体不亲和。 这些影响远缘杂交亲和性的因素，都是物种间遗传差异的反映。 自从胼胝质荧光染色法问世以来，人们可以通过研究自交和种间或更远关系的远缘杂交中胼胝质在花粉和雌蕊组织中的特异性，从而使得研究自交不亲和及远缘杂交不亲和现象的表达部分鉴定成 为可能。研究发现，远缘杂交授粉后柱头乳头细胞内会积累大量的胼胝质，是柱头对异源花粉的一种特异性拒绝反应，而且胼胝质反应的强度和杂交亲本亲缘关系有一定的相关性（孙晓梅风， 2002； 1997）。 雎薇等（ 1999）对草原樱桃与欧洲甜樱桃远缘杂交不亲和原因进行的研究发现，杂交授粉后花粉在柱头上虽少量萌发，但花粉管在柱头上横向生长，或盘绕扭曲不能进入花柱，个别进入花柱的花粉管先端，因沉积胼胝质而中途停止伸长，未能进入子房到达胚珠 ， 从而说明，这种杂交授粉后花粉管的不正常行为是导致草原樱桃与欧洲甜樱桃远缘杂交 不亲和的主要原因。 远缘杂交不亲和性的原因是极其复杂的，它的遗传机制并未完全揭开，为了进一步搞清这些原因必须从遗传学、胚胎学、细胞学、生理学和生物化学等方面继