【毕业学位论文】（Word原稿）牛结核病DNA疫苗的研究预防兽医学博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 博士学位论文 牛结核病 on on 国农业科学院博士学位论文 摘 要 I 摘 要 牛结核病是 主要 由牛分枝杆菌引起的一种慢性消耗性疾病，在许多国家尤其是发展中国家仍广泛流行，该病不仅给畜牧业造成巨大的经济损失，而且严重威胁 着 人类的身心健康。因此，控制牛结核病对防治人类结核病意义重大。然而，至今仍没有一种疫苗可用于该病的预防。 本研究利用 术和重叠延伸剪接技术 (by 以牛分枝杆菌 菌株的基因组为模板 ， 扩增 因和 合基因，连接 到 真核表达载体 )中 ，称 、 称 、 称 、简称 、 简称 、称 和 称 。转染 细胞，检测目的基因的表达。以各重组质粒和 )及 疫 c 小鼠，免疫 3次，每次间隔 2 周， 1 免后每周以 牛分枝杆菌 纯化蛋白衍生物（ 包被抗原，间接 法检测血清抗体水平 ； 以 牛分枝杆菌 刀豆蛋白 A（ ， 为刺激原， 检测脾淋巴细胞增殖情 况。 3 免 2 周后以 剂盒检测脾细胞分泌 的 情况。结果表明， 除 外，其他 各重组质粒免疫后小鼠血清抗体水平持续上升，与 )对照组和 照组相比差异显著 （ p 下同。 In p 组别 一免疫一周 一免疫两周 二免疫一周 二免疫两周 ) 别 三免疫一周 三免疫两周 三免疫三周 三免疫四周 ) 国农业科学院博士学位论文 第二章 牛结核病单价及二价融合 苗的初步研究 30 00 . 40 . 81 . 21 2 3 4 5 6 7 8 ( We e k ) E 6p C A H M D N A + )P 疫小鼠血清抗体动态变化图 1he of of 表 1图 1知，小鼠免疫后除 外其他 苗免疫组的抗体水平均呈现上升趋势。一免 8 周后 的抗体水平稍低于 和 ； 低于 ； 和 ，因此小鼠经三次免疫后三种双价融合基因 苗免疫组的血清抗体水平与单基因 苗免疫组无明显差别，并不比单基 因 苗组高（ p 及空载体和 自始至终都维持在较低的水平。从一免后 2 周开始除 外，其他重组质粒免疫组血清抗体水平与空载体对照组和 照组相比均出现极显著差异（ p 疫小鼠脾淋巴细胞增殖试验 分别于一免 2 周，二免 2 周和三免 2 周后处死小鼠，无菌分离脾细胞，制备脾细胞悬液，调整细胞浓度为 1107/入 96 孔细胞培养板中，以牛型 为刺激物， 检测其增殖活性，结果见表 1图 1 表 1激后免疫鼠脾淋巴细胞增殖情况 (X1I in X 组别 一免疫 两周 二免疫两周 三免疫两周 Bb ) 国农业科学院博士学位论文 第二章 牛结核病单价及二价融合 苗的初步研究 31 图 1激后小鼠脾脏淋巴细胞增殖情况（ X 1he in X 从脾淋巴细胞增殖实 验的结果（表 1图 1看，经 激后各重组质粒免疫组T 淋巴细胞的增殖水平始终高于对照组。 激值（ ）在二免 2周时处于较高水平，三免后均稍有下降；而 始终呈上升趋势；+）组和 始终处于较低水平。一免 2 周后各组之间均无明显差异（ p 二免 2 周后各重组质粒组与两对照组相比差异显著（ p 二免后各重组质粒免疫组的 与对照组相比差异显著（ p 疫小鼠脾淋巴细胞 分泌情况 三免 2 周后免疫小鼠脾淋巴细胞用牛分枝杆菌 激，收集上清，根据试剂盒制作标准曲线（图 1并检测各组诱生的 水平，结果如表 1图 1 图 1鼠 标准曲线 1of pg/ 1000 500 250 125 0 00 . 511 . 522 . 53一免两周 二免两周 三免两周 E 6p C A H M D N A 3 . 1 ( + )P B 第二章 牛结核病单价及二价融合 苗的初步研究 33 表 1疫鼠脾淋巴细胞经 激后 诱生情况 (Xpg/1 in PD Xpg/图 1 激后小鼠脾淋巴细胞分泌 的量 1he of by PD a： b: c: d: e: f: g: h: )组 i: a： b: c: d: e: f: g: h: ) i: 分析结果表明，经 生后各 苗免疫组小鼠脾淋巴细胞分泌的 的量均 极显著 高于两对照组（ p ,下同。 In p 图 2疫小鼠血清抗 2he of in 组为 组， 组分别为 )组和 组别 一免疫一周 一免疫两周 二免疫一周 二免疫两周 A 别 三免疫一周 三免疫两周 三免疫三周 A B C D E F G 00 . 20 . 40 . 60 . 811 21 . 41 . 61 . 81 2 3 4 5 6 7 ( 第三章 牛结核病融合及多价组合 苗的研究 54 ) 表 2免疫小鼠血清抗 白抗体的 测结果（ ）（ X he of PD in X 图 2疫小鼠血清抗 体动态变化图 of PD in 别 一免疫一周 一免疫两周 二免疫一周 二免疫两周 A 别 三免疫一周 三免疫两周 三免疫三周 A 0 . 10 . 20 . 30 . 40 . 50 . 60 . 70 . 80 . 911 2 3 4 5 6 7 ( 第三章 牛结核病融合及多价组合 苗的研究 55 图 2鼠 血清 抗 白 态变化趋势图 2he of in 2鼠 血清 抗 态变化趋势图 2he of PD in 组免疫后，以 白为包被抗原进行检测时的小鼠血清抗体水平均高于以牛分枝杆菌 一免三周开始各疫苗组即与两对照组表现出极显著差异 (p 免疫小鼠血清 类检测结果显示各疫苗组 有所波动，但一直大于 两对照组 比值始终保持在 右，表明各组 苗主要诱导小鼠产生 0123451 2 3 4 5 6 7 ( 511 . 522 . 533 . 51 2 3 4 5 6 7 ( 第三章 牛结核病融合及多价组合 苗的研究 56 00 . 511 . 522 . 5一免两周 二免两周 鼠脾淋巴细胞增殖水平的测 定 分别于一免两周，二免两周和三免两周后处死小鼠，无菌分离脾细胞，制备脾细胞悬液，调整细胞浓度为 1107/入 96 孔细胞培养板中，以 白和牛分枝杆菌 为刺激物，检测其增殖活性，结果见表 2图 2 表 2白刺激后免疫鼠脾淋巴细胞增殖情况 (XI in X图 2白刺激后小鼠脾脏淋巴细胞增殖情况（ X in X 表 2分枝杆菌 激后免疫鼠脾淋巴细胞增殖情况 (XI in X组别 一免疫两周 二免疫两周 三免疫两周 A . 41a 别 一免疫两周 二免疫两周 三免疫两周 A 国农业科学院博士学位论文 第三章 牛结核病融合及多价组合 苗的研究 57 y = O D 450pg/分枝杆菌 激后小鼠脾脏淋巴细胞增殖情况（ X 2he in X 经 白刺激后，各疫苗组的 始终高于两对照组，一免后各疫苗组的 差异不明显（ p 二免和三免后 C、 D 组 明显高于其他各组（ p 除 A 组 与 疫组（ E 组）相似外，其余 苗免疫组的 。 经牛分枝杆菌 激后，各疫苗组的 也始终高于对照组。一免后各疫苗组差异不明显（ p 二免和三免后 E 组 高于其他各组，而 C、 D 组的 也高于 A、 B 组（ p 疫小鼠脾淋巴细胞 分泌情况 每次免疫两周后小鼠脾淋巴细胞用 白和牛分枝杆菌 激，收集上清，根据试剂盒制作标准曲线（图 2并检测各组诱生的 水平，结果如表 2图 2 图 2鼠 标准曲线 2of of pg/ 1000 500 250 125 0 00 . 511 . 522 . 5一免两周 二免两周 三免两周 第三章 牛结核病融合及多价组合 苗的研究 58 020040060080010001200一免两周 二免两周 三免两周pg/疫鼠脾淋巴细胞经 白刺激后 诱生情况 (Xpg/ in Xpg/图 2白刺激后小鼠脾淋巴细胞分泌 的量 he of by 2疫鼠脾淋巴细胞经 牛分枝杆菌 激后 诱生情况 (Xpg/ in Xpg/组别 一免疫两周 二免疫两周 三免疫两周 A 1092 1084 别 一免疫两周 二免疫两周 三免疫两周 A 31 21 130 1107 18 国农业科学院博士学位论文 第三章 牛结核病融合及多价组合 苗的研究 59 y = 4 5 0pg/分枝杆菌 激后小鼠脾淋巴细胞分泌 的量 2he of by 白诱生后，各 苗和 疫组小鼠脾淋巴细胞分泌的 水平均呈上升趋势，显著高于两对照组，且 C 组始终高于其他各组。一免后各组差异不很明显（ p 二免后 C、 D 组 水平极显著高于其他组（ p 三免后除 A 组稍低于 疫组（ ，其余 苗组均高 于 疫组， C 和 D 组分泌的 水平相当，且明显高于A、 B 和 E 组（ p 经牛分枝杆菌 生后，各疫苗组 水平也均呈上升趋势，显著高于两对照组。一免后 E 组分泌的 的量即已明显高于其他各组，而各 苗组则无明显差异。二免和三免后 C、 D 组的 水平显著上升，明显高于 A、 B 组，但仍低于 疫组，且 C、 A 组小鼠脾细胞分泌的 的量略低于 B 组。 疫小鼠脾淋巴细胞 泌情况 每次免疫两周后小鼠脾淋巴细胞用 白和 牛分枝杆菌 激，收集上清，根据试剂盒制作标准曲线（图 2并检测各组诱生的 平，结果如表 2图 2 图 2鼠 准曲线 of of pg/ 1000 500 250 125 0 0200400600800100012001400一免两周 二免两周 三免两周pg/ 第三章 牛结核病融合及多价组合 苗的研究 60 表 2疫鼠脾淋巴细胞经 白刺激后 生情况 (Xpg/in Xpg/图 2白刺激后小鼠脾淋巴细胞分泌 量 he of by 2疫鼠脾淋巴细胞经 牛分枝杆菌 激后 生情况 (Xpg/in Xpg/组别 一免疫两周 二免疫两周 三免疫两周 A 125 别 一免疫两周 二免疫两周 三免疫两周 A 16 100200300400500600一免两周 二免两周 三免两周pg/ 第三章 牛结核病融合及多价组合 苗的研究 61 050100150200250300一免两周 二免两周 三免两周pg/分枝杆菌 激后小鼠脾淋巴细胞分泌 量 2he of by 析结果表明，各疫苗组小鼠脾细胞在经 白诱生后产生的 平均呈现递增趋势，且显著高于两对照组。一免后各组分泌的 平稍有差异，但不明显，二免后 C 组的 平显著高于其他各组（ p 三免后则极显著高于其他组（ p 而 D 组也高于多价 苗免疫组（ A、 B 组）和 疫组（ E 组），且除 A 组外，其他 苗组均高于 疫组。 经 牛分枝杆菌 生后，一免两周时除 极显著高于其他各组外 （ p ，其他组无显著差别，二免和三免后， C、 D 组的 平显著高于 A、 B 组 （ p ，但它们均极显著低于 疫组 （ p 。 毒小鼠肺组织荷菌数 攻毒三周后，无菌采取小鼠肺脏 ， 研磨后倍比稀释，接种于含改良罗氏培养基的试管斜面上，37 保湿培养 3 周 后 进行菌落计数，结果如表 2 表 2鼠肺组织荷菌数（ X 2X 由表 2以看出， 以 1106 击三周 后， （ E 组）和各 苗组小鼠肺脏荷菌数明显低于两对照组，融合基因 苗组（ C、 D 组）荷菌数虽稍高 于 ，但三者无明显差别，且明显低于两多价 苗组（ A、 B 组）， B 组荷菌数比 A 组稍高，但两组别 荷菌量 A (a104 B (a104 C (b104 D (b104 E (b104 F (104 G (104 中国农业科学院博士学位论文 第三章 牛结核病融合及多价组合 苗的研究 62 者差异不显著。 鼠肺脏间接免疫荧光试验 攻毒后免疫小鼠肺组织内的 现为蓝绿色荧光斑点，结果如图 2 图 2A, B, C, D, E, F, G 组和正常小鼠对照组 (H 组 )肺组织免疫荧光结果 （ 200） A a B a C a D a E a F a G a H a 中国农业科学院博士学位论文 第三章 牛结核病融合及多价组合 苗的研究 63 of (200) H) A 组为 价疫苗组 A: of 组为 价疫苗组 B: of 组为 基因融合组 C: of 组为 基因融合组 D: of 组为 疫组 E: CG 组为 )空载体组 F: of ) 组为 疫组 G: BS 组为攻毒小鼠肺脏 H： 毒三周后小鼠肺组织经间接免疫荧光检测，结果表明两对照组（ F、 G 组）荧光斑点明显多于其他各组。 C、 D 组（融合基因 苗组）和 E 组（ ）仅可见少量荧光， A、 价 苗组）荧光斑点数量较 C、 D 组多。 鼠肺脏组织学病变 （ 色 ） 击三周后对免疫小鼠肺组织进行 色以观察病变程度，结果如图 2示。 中国农业科学院博士学位论文 第三章 牛结核病融合及多价组合 苗的研究 64 图 2A, B, C, D, E, F, G 组和正常小鼠对照组 (H 组 )肺组织 色结果 （ 200） 200） A 组为 价疫苗组 A: of 组为 价疫苗组 B: of 组为 基因融合组 C: of a B a C a D a H E a G F 中国农业科学院博士学位论文 第三章 牛结核病融合及多价组合 苗的研究 65 D 组为 基因融合组 D: of 组为 疫组 E: CG 组为 )空载体组 F: of ) 组为 疫组 G: BS 组为小鼠正常肺脏组织 H： 毒小鼠肺组织 色结果表明两对照组（ F 和 G 组）小鼠攻毒后肺脏病变严重，分别表现为血管炎，肺泡腔大量纤维素渗出和纤维素性肺炎，融合基因 苗组（