【毕业学位论文】(Word原稿)茄科尖孢镰刀菌绿色荧光蛋白基因转导体系的优化及其定殖特性的研究-应用微生物学与基因工程

p 的 分类号： 单位代码： 10389 密 级： 学 号： 建农林大学硕士学位论文 茄科 尖孢镰刀菌绿色荧光蛋白 基因转导体系的优化 及其定殖特性的研究 学 科 门 类：理学 一级学科名称：微生物学 二级学科名称：微生物学 研 究 方 向：应用微生物学与基因工程 研 究 生 ： 指 导 教 师： 研究 员 、 博士 完 成 时 间：二 0 一一年四月 s of in 2011 独创性声明 本人声明，所呈交的学位（毕业）论文，是本人在指导教师的指导下独立完成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位（毕业）论文作者亲笔签名： 日期： 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位（毕业）论文的规定，即学校有权送交论文的复印件， 允许论文被查阅和借阅，学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在 年后解密可适用本授权书。 不保密，本论文属于不保密。 学位（毕业）论文作者亲笔签名： 日期： 指导教师亲笔签名： 日期： 目 录 中文摘要 . 1 . 2 第一章 前言 . 3 1. 茄科枯萎病的发生与危害 . 3 科枯萎病的分布 . 3 生原因 . 3 播危害 . 3 病规律 . 4 2. 茄科枯萎病的病原菌 . 5 3. 茄科枯萎病的防治 . 5 4. 其在丝状真菌中的研究概况 . 7 础理论研究概况 . 7 为标记物所具有的优点 . 7 丝状真菌研究中的应用 . 7 5. 本研究的目的及意义 . 8 第二章 茄科作物枯萎病原菌的分离与鉴定 . 10 引言 . 10 1 材料与方法 . 10 料 . 10 法 . 10 2 结果与分析 . 11 科作物枯萎病害调查及其发病症状 . 11 科枯萎病菌的分离与鉴定 . 12 原菌的分子鉴定 . 14 病性测定结果 . 16 3 讨论 . 16 第三章 番茄尖孢镰刀菌 . 17 引言 . 17 1 材料与方法 . 17 料 . 17 法 . 18 2 结果与分析 . 19 孢镰刀菌的原生质体制备 . 19 2.2 因的转化 . 19 化子的稳定性筛选 . 20 3 讨论 . 21 第四章 番茄尖孢镰刀菌 的生物学特性 . 22 引言 . 22 1 材料与方法 . 22 料 . 22 法 . 22 福建农林大学硕士学位论文 4 2 结果与分析 . 23 化子的菌体形态及生长速度 . 23 同 转化子生长的影响 . 24 化子对潮霉素的抗性水平分析 . 25 3 讨论 . 25 第五章 番茄尖孢镰刀菌在植株体内的侵染定殖 . 26 引言 . 26 1 材料与方法 . 26 料 . 26 法 . 26 2 结果与分析 . 26 株及组织发病症状观察 . 26 聚焦激光扫描显微镜检测标记菌 . 27 3 讨论 . 30 第六章 番茄尖孢镰刀菌在土壤中的定殖特性 . 32 引言 . 32 1 材料与方法 . 32 料 . 32 法 . 32 2 结果与分析 . 32 同土壤中转 因镰刀菌的数量动态变化 . 32 同土壤中转 因镰刀菌的荧光观察 . 33 3 讨论 . 35 第七章 番茄尖孢镰刀菌对土壤微生物群落结构的影响 . 36 引言 . 36 1 材料与方法 . 36 料 . 36 法 . 36 2 结果与分析 . 37 分析转 因镰刀菌对土壤微生物群落结构的影响 . 37 3 讨论 . 40 第八章 结论与展望 . 41 1 结论 . 41 2 展望 . 41 参考文献 . 42 个人简历 . 46 致 谢 . 47 福建农林大学硕士学位论文 1 中文摘要 近年来，茄科病害不断持续发生，由尖孢镰刀菌引起的枯萎病，对茄科作物危害最大，防治困难。本文从福建省各地区采集了枯萎病植株及根际土样本，分离了其中的致病真菌，经鉴定为尖孢镰刀菌。对番茄枯萎病菌 进行 因转化，得到了稳定遗传的转化子。在此基础上，对转化子在植株及根际土内的定殖特性进行了研究。主要研究结果如下： 从福建福州等四个地区采集样本，分离并鉴定了 147 株致病菌，经鉴定 106 株为镰刀菌属真菌，其中尖孢镰刀菌为优势菌群。 采取 导的方法构建了茄科尖孢镰刀菌的 化体系，尖孢镰刀菌原生质体制备是转化的关键步骤，影响其制备的因素主要包括酶系的选择、渗透压稳定剂的选择、菌丝菌龄等。结果显示最佳反应条件为：渗透压稳定剂选择 0.8 系为 20 mg/壁酶 与 崩溃酶的混合酶系； 菌龄为 12h 的新鲜菌丝； 28 ， 70 r件下酶解 消化 2-3 h。 对所得转化子进行生长速度等生物学特性的研究，标记后的菌株在菌丝形态、生长速度及 多数转化子能够稳定遗传，荧光稳定，有利于下一步研究。 运用共聚焦激光扫描显微镜跟踪观察标记菌株在番茄植株内的侵染过程，表明根部是致病菌株侵染主要位点，标记菌株能够在根茎部很好的定殖，致病力较强。 研究了 因标记菌株在不同土壤中的定殖特性，结果表明，标 记菌株能够在不同性质的土壤内定殖，随着时间的延长其定殖密度逐渐下降。 析表明，引入的标记菌株对不同土壤脂肪酸生物标记影响不相同，但种类上基本呈增长趋势，各土壤的细菌特征性脂肪酸都占绝对优势。 关键词： 茄科枯萎病；尖孢镰刀菌；绿色荧光蛋白；生物学特性；定殖 福建农林大学硕士学位论文 2 n of At of f sp of in as 147 06 of FP so .8 -1 20 mg/mL 2h of 8 ,0 r -3 h. of of pH on of to of of by in of of in in as on to by of 建农林大学硕士学位论文 3 第一章 前言 1. 茄科枯萎病的发生与危害 科枯萎病的分布 全世界茄科植物大约 80 属 3000 种，分布范围广泛，遍及温带及热带地区；我国共有 24 属 105种 35 变种 1。包括枸杞属、天仙子属、曼陀罗属、烟草属、番茄属、辣椒属等。茄科蔬菜包括茄子、辣椒、番茄、马铃薯等，在蔬菜中占有重要地位，是百姓生活中必不可少的蔬菜美食，因此培育优良的茄科蔬菜品种对于满足社会生产、生活等方面的需要，具有重大的理论 和实践意义 2。 由尖孢镰刀菌引起的枯萎病，对茄科作物危害最大，防治困难，作物受害面积大，给农民生产增收带来很大困难，造成重大经济损失，成为影响茄科蔬菜生产的一个重要病害 3。 尖孢镰刀菌(一种世界性分布的病原真菌，存在于各种土壤中，甚至在极端环境也可分离到4。例如，辣椒枯萎病在国外早有报道， 20世纪 50年代在我国由俞大绂首次报道，目前已广泛分布于陕西、甘肃、广西、四川、湖南、北京、浙江、山西等省 5。而番茄枯萎病在我国南方地区分布较多，影响较大，例如在广西、 广东、福建等省，但是在北方寒冷地区如黑龙江省也逐渐流行开来 6。尖孢镰刀菌的寄主范围也十分广泛，目前已报道的被尖镰孢菌严重为害的作物有香蕉、番茄、辣椒、棉花、萝卜、西瓜、黄瓜、草莓、鹰嘴豆、甘蔗、 郁金香 等多种植物。 生原因 近年来，随着农业产业结构的调整，同时为了适应人们对膳食结构的调整及优化，我国茄科作物的种植面积不断扩大，在给广大农民带来巨大的经济效益的同时，茄科作物病虫害也越来越严重。 当前，国内茄科作物的主要种植品种包括了辣椒、番茄、茄子、马铃薯等，为农业主栽品种。这几种作物常见病害有： 灰霉病、黄萎病、枯萎病及青枯病等，主要病原菌有真菌、细菌，还有病毒导致的病害。但这些病害中，尤以枯萎病致病菌导致的病害最为广泛、损失最为严重。一些种植户由于管理不善或其他原因导致了枯萎病的发生与快速蔓延，造成了较大的经济损失。分析有以下几个主要原因： 连作致病，我国农村大部分地区的茄科种植户相对稳定，连作通常在 3萎病菌在病残体和土壤中腐生，连年繁殖积累导致病原不断增加。而发病率也不断攀升，有的田块达到 80以上。 种子带菌， 枯萎病原菌以菌丝体或厚垣孢子随病残体在土壤中或附着在种子上越冬。带 菌的种子和带有病残体的有机肥是无病区的初始感染源，病原菌从幼苗移栽伤口侵入到维管束内并繁殖蔓延，引起作物萎蔫。 虫害导致，部分田块的土壤中存在有一定量的线虫等地下害虫，病原菌从害虫危害后的伤口侵入根部从而导致感染。 肥水管理不当，施肥水平较高的大棚其枯萎病发病率明显高于施肥水平较低的大棚，原因是植株根系处于高肥水土壤环境中，生长缓慢，加之低地温形成根腐伤口，病原菌随水传播。同时肥料结构对该病的影响也较大，氮、磷肥施用过多，而钾肥和有机肥的施用不足，造成营养生长过旺，植株机体的抗病性降低，雨天后放晴及气温升高 ，多方面因素导致了感病机率增加 7。 播危害 随着生产集约化程度的提高，茄科作物保护地的种植面积逐年扩大且存在重茬，导致茄科病害日趋严重，其中枯萎病最为普遍，严重影响了蔬菜品质及产量，直接影响了农户的经济收入。 自本世纪初（ 1905）发现番茄枯萎病以来，在世界上大部分国家均有发生 8。如今的番茄枯萎病福建农林大学硕士学位论文 4 已成为其主要病害之一，发病规模越来越大，有的地方发病率达到 80，病株率在 10 减产10 给番茄生产带来巨大威胁 9。辣椒枯萎病是由半知菌亚门尖孢镰刀菌辣椒专化型（ f 染引起的。在发病地区，该病的发病率一般为 15 严重时可达70 有时甚至导致绝收，造成了严重的经济损失。该病在国外早有报道 10， 20世纪 50年代在我国由俞大绂最早鉴定 11。以后，北京李明远等（ 1987） 12、浙江葛起新（ 1991） 13等也有记述。目前陕西、甘肃、广西、四川、湖南、北京、浙江、山西等地已相继有此病的报道。保护地茄子的土传病害较为严重，有些病害的病菌在土壤中存活时间可长达 3用化学药剂很难控制，如枯 萎病、黄萎病等非常顽固，难以防治。一旦条件适宜，可能会造成大流行。而老菜区，发病率逐年提高，严重地块发病率在 50 甚至绝收，给生产带来巨大损失 14。 枯萎病是种土传病害，主要危害植株维管束，一般在作物花期或结果期开始发病，症状自下而上逐渐显现，该病传染性强，但病程较为缓慢，一般 15同种蔬菜作物的具体表现症状有差异 ：番茄枯萎病在开花结果期始发，发 病初期仅茎的一侧自下而上出现凹陷区，致一侧叶发黄，变褐后萎焉枯死；也有的从植株距地面近地叶序始发，逐渐向上蔓延。剖开病茎，维管束变褐 ，湿度大时，病部产生粉红色霉层，即病菌的分生孢子梗和分生孢子，无乳白色粘液流出，有别于青枯病 15,16；茄子枯萎病，病株叶片自上而下逐渐变黄枯萎，症状多表现在一、二层分支上，有的同一叶片仅半边黄，另一半健康如常，该病易于黄萎病混淆，需要 17；甜椒、辣椒枯萎病，发病初期根部或根颈处常发生水渍状褐色斑点，嫩芽和嫩叶生长缓慢，色泽暗，发病轻的在晴天中午萎蔫，早晚和阴天恢复正常，可持续 2期根颈处及主根、侧根基部皮层干裂，容易剥落，植株下部叶片大量脱落，茎基部皮层发生水渍状腐烂，茎秆和 叶片迅速凋萎。发病后期，病株侧根很少，植株很容易被拔起。相对湿度较大时，病部长出丰茂的白色菌丝或蓝绿色霉状物。茎基部近地面段干腐或出现纵向枯死的长条斑。折断茎秆可见根颈部维管束变褐，外部也常呈褐色。病株地下部根系也呈水浸状软腐，皮层极易剥落，木质部变成暗褐色至煤烟色 18 病规律 番茄枯萎病以菌丝体，厚垣孢子随病残体在土壤、粪肥或附着在种子上越冬番茄种子带菌，成为下一年的初次侵染源，病菌主要从根部、根茎部的伤口侵入，然后在维管束中大量繁殖，阻塞导管并产生毒素。毒素在植株体内上下扩散。植株在导管被 阻和毒素的双重作用下使整株枯死。带病种子的调运是本病远距离传播的途径。田间病菌的传播主要靠流水和带菌土壤。土壤潮湿，连作，耕作时伤根，生长势弱，氮肥施用过量或缺少钾肥的地块均易发病。而枯萎病株的空间分布格局亦是该病原菌种群的重要属性之一，由物种的遗传特性和生态环境条件决定。 番茄枯萎病喜高温高湿。发病程度与土温关系很大。发病最适土温为 26 ，最高为 33 ，21 以下病害受抑制。暴雨过后，天气晴朗，气温回升有利于病害的扩展蔓廷，特别在酸性较大的土壤，病害扩展更快。就番茄生育期看，发病高峰期出现 于植株生长中后期；从季节看，夏植番茄和 911冬末初春播种移栽， 319。辣椒枯萎病由镰刀菌引起，只危害辣椒和甜椒。病原菌主要以厚垣孢子在土壤中越冬，在土壤中可进行较长时间的腐生生活，据报道，该病菌在土壤中存活年代为 6菌主要借助灌溉水或雨水传播，也可随病土借风吹到别处。辣椒枯萎病的发生的最适温度为 24 ，高于 35 或低于 17 均不利于其发育。排水不良、畦面凹凸不平、干湿不均的地块发