【毕业学位论文】（Word原稿）清宫液II号抗炎机理与临床药效研究临床兽医学硕士论文

密级 论文编号 中国农业科学院 学位论文 清宫液 抗炎机理与临床药效研究 on I F on I I 摘 要 清宫液 是中国农科院兰州畜牧与兽药研究所自主研制的用于治疗奶牛子宫内膜炎的纯中药制剂，为了解其临床实际治疗效果、评价抗炎效果和探索抗炎机理而进行本研究。 在实验室条件下建立鼠耳肿胀模型、足跖肿胀模型、毛细血管通透性增加模型、肉芽肿模型分别考察清宫液 对急、慢性炎症的抗炎效果以及对炎症组织内前炎性因子前列腺素 用炎性刺激剂细菌脂多糖刺激体外培养 的巨噬细胞来建立起体外炎症模型，用化学方法和生物学方法检测清宫液 对炎症环境下巨噬细胞合成炎性介质 影响，进而探索清宫液 的抗炎机理。用清宫液 对奶牛子宫内膜炎病例进行临床治疗，验证了对子宫内膜炎的具 体 疗效。 实验结果：腹腔注射 个剂量的 清宫液 都能极显著地抑制二甲苯引起的小鼠耳肿胀（与对照组比较， p 效果相似，但比清宫液 注射低剂量组效果好，差异极显著（ p 没有明显区别。 清宫液 注射高剂量组与清宫液 注射低剂量组相比较，二者有显著差异（ 表明清宫液 低剂量组也可以较好的抑制染料渗出，效果与氢化可的松相近。 清宫液 高剂量组与清宫液 低剂量组差异极显著（ p 二者在抑制角叉菜胶引起的肿胀方面没有明显的区别。 清宫液 低剂量组与模型组比较差异极显著（ p 而且平均数也很接近，表明二者抗炎效果近似。高低两个剂量组之间也不存在显著差异（ p 表现出了相近的抗炎效果。 鼠炎足组织中 测定结果 以吸光度表示 含量，测定结果如表 19。 表 19 各实验组 量 in 宫液 高剂量组 清宫液 低剂量组 氢化可的松 对照组 模型组 雌 鼠 鼠 平均 鼠 均 国农业科学院硕士学位论文 第二章 抗炎模型实验 34 测得的染料渗出量统计如表 20，并进行 t 检验 。 表 20 各实验组 量统计 结果 in 物数 （只） 给药剂量 （ g/重） 量 (x 清宫液 高剂量组 20 宫液 低剂量组 20 化可的松对照组 20 型组 20 宫液 高剂量组与模型组比较，差异极显著（ p ，二者抗炎效果相近。 清宫液 高剂量组与清宫液 低剂量组相比较差异不显著，高剂量和低剂量之间没有在抗 出方面表现出较大差别。 芽肿实验 宫液 高剂量组纸片肉芽肿实验结果，见表 21。 表 21 清宫液 高剂量组肉芽肿质量 he of I 鼠编号 肉芽肿（含纸片） 质量（ g） 小鼠体重 （ g） 肉芽肿质量 （ g） 雌 鼠 1 国农业科学院硕士学位论文 第二章 抗炎模型实验 35 8 0 鼠 平均 鼠 11 2 3 4 5 6 7 8 9 0 鼠 平均 清宫液 低剂量组 纸片肉芽肿 实验结果，见表 22。 表 22 清宫液 低剂量组肉芽肿质量 he of I 鼠编号 肉芽肿（含纸片） 质 量（ g） 小鼠体重 （ g） 肉芽肿质量 （ g） 雌 鼠 1 0 鼠 平均 11 2 3 4 国农业科学院硕士学位论文 第二章 抗炎模型实验 36 鼠 15 6 7 8 9 0 鼠 平均 模型组纸片肉芽肿实验结果，见表 23。 表 23 模型组肉芽肿质量 he of in 鼠编号 肉芽肿（含纸片） 质量（ g） 小鼠体重 （ g） 肉芽肿质量 （ g） 雌 鼠 1 0 鼠 平均 鼠 11 2 3 4 5 6 7 8 9 0 鼠 平均 国农业科学院硕士学位论文 第二章 抗炎模型实验 37 以上实验结果统计为表 24，并进行 t 检验。 表 24 纸片肉芽肿统计结果 he of of 物数 （只） 给药剂量 （ g/重） 肉芽肿质量（ g） 清宫液 高剂量组 20 宫液 低剂量组 20 型组 20 宫液 高剂量组与模型组比较差异极显著（ p 二者没有明显的差别。 4 讨论 鼠耳肿胀 实验 本实验 建立的 是引起炎性肿胀的动物模型。肿胀是炎症部位的一种基本变化，并且是急性炎症的标志性变化之一。对肿胀这一病理变化的抑制程 度可以在很大程度上 反映 抗炎药物对急性炎症的作用。用致炎剂滴于小鼠耳部引起小鼠耳的肿胀，在一个较短的时间内测定用药组与对照组致炎耳 与 未致炎耳重量，计算并比较肿胀率，确定抗炎效果。 致炎剂通常选择可迅速引起水肿的化学物质，如巴豆油、二甲苯等，有时也可以使用混合致炎剂，如 2巴豆油、 20无水乙醇、 73乙醚和 5%蒸馏水的混合液。在用致炎剂致炎后 要在一个较短的时间内测定耳肿胀率，时间过长可能会由于动物体内的各种抗炎介质的参与而影响了对药物的考察。 本实验中将二甲苯滴于鼠耳后，在 20引起了明显的肿胀变化，测 量时左耳的重量明显要大于右耳，在梁爱华等研究白前与白薇的药理作用和杨亚斯等研究参苏液的抗炎作用时，他们所建立的鼠耳肿胀模型中模型组鼠耳肿胀度分别达到 爱华等， 1996；杨亚斯等， 1995），而在本实验中模型组的鼠耳肿胀度要高于这两个数值，因此，可以认为炎症模型是基本成功的。梁爱华等和杨亚斯等在实验中采用了鼠耳重量增加值作为抗炎的考察指标，而本实验则是用鼠耳肿胀率作为考察指标，肿胀率是肿胀相对鼠耳重量的比率，能够更加客观的反映鼠耳的肿胀程度，避免了不同小鼠之间耳大小、轻重等因素给实 验数据带来的误差。 清宫液 在 剂量下经腹腔注射给药后表现出了十分明显的抑制肿胀的效果，中国农业科学院硕士学位论文 第二章 抗炎模型实验 38 而在 剂量下清宫液 同样表现出了 十分明显的抑制效果，因此可以认为，作为治疗奶牛子宫内膜炎 的中药制剂清宫液 在抑制炎性肿胀方面具有明显的作用，在临床治疗过程中可以有明显的抗炎效果，下文的临床实验可以验证这一点。根据实验结果， 剂量已经可以取得理想的抑制肿胀的效果，因而可以依据这个剂量适当调整临床的实际用药量，以最低的用药量达到最好的治疗结果。此次实验的用药最低剂 量是 在实验中表现出良好的抗炎作用，其结果优于实验最初的设计，低于该剂量的其他剂量是否仍可以达到相同的抑制肿胀的效果，本实验没有研究，在后续实验中应该设计更低的用药剂量来进一步确定清宫液 的最低有效剂量，为奶牛临床治疗提供更准确的依据。 在实验中，灌胃给药的治疗效果也十分理想，这说明不论是灌胃还是腹腔注射都可以取得良好的抑制炎症肿胀的效果。在临床中，清宫液 的用药方式通常是子宫灌注，本实验的结果证明不同的用药方式可以取得相近的效果，提示在临床中可以尝试用不同于子宫灌注的方式来治疗子 宫内膜炎，不必单一局限于子宫灌注这一种方式，可根据临床治疗中的不同情况适当变换用药方式，以 便 达到最有利的治疗目的。 灌胃还是腹腔注射这两种给药方式在高剂量上抑制肿胀的结果并不完全一样，但在 t 检验的统计结果中并没有表现出明显差别，且均优于低剂量，因此，在清宫液 的其它抗炎药理实验中，不论采用哪一种用药方式都应该可以取得相似的结论， 可以不必过多地考虑用药方式的差异 影响的实验结果的可信赖程度，为后面的实验中选择给药方式提供了一定依据。但同时，我们也注意到，虽然从 t 检验的结果上清宫液 注射高剂量组与清宫液 灌胃高剂量组之间没有明显的差异，但相同剂量下腹腔注射的小鼠的肿胀率要低于灌胃给药，这可能是由于腹膜面积大，吸收力强于胃粘膜，使得注射入腹腔的药物在腹腔中的被吸收速度要高于灌入胃中的药物，从而快速进入血液，达到血药高峰，可以更有效地抑制耳部肿胀。 氢化可的松是一种经过论证的具有明显的抗炎效果的化学药物，本实验将氢化可的松作为抑制肿胀的阳性对照药品，在实验中表现出了良好的抗炎效果。其他三个用药组与氢化可的松相比较，在抑制二甲苯诱导的耳肿胀方 面数据相近，没有明显差别，其中清宫液 注射高剂量组、清宫液 灌胃高剂量组的鼠耳肿胀率还要低于氢化可的松组，这说明清宫液 具备良好的抗炎作用，功效近似于 略好于氢化可的松。将与氢化可的松相比较的结果作为参考，临床中，在确定疗效的基础上可以更好的确定用药剂量。 在三个用药组组内进行比较时我们发现，相同的用药条件下，不同性别的小白鼠表现出了不同的抗炎结果。虽然在三个用药组中清宫液 对雌、雄小鼠的急性炎症都有良好的抑制作用，但雌鼠的肿 胀率均低于同组雄鼠，差异极显著。其中清宫液 注射高剂量组的雌雄之间的差 别 最为明显，相差一倍以上。而清宫液 注射低剂量组中的雌鼠的耳肿胀率甚至还要低于清宫液 注射高剂量组的雄鼠。在模型组中，雌鼠的耳肿胀率也同样低于雄鼠，但差异并不显著。这表明清宫液 在不同性别的动物体内存在不同的抗炎效果，其抗炎效果与性别相关联。雌性动物可以分泌雌激素，雌激素本身具有一定的抑制 炎症的作用。炎症发生时，在不给予任何治疗的情况下，雌激素本身可以发挥一定的抗炎作用 （如模型组结果） ，但作用并不十分显著。而当清宫液 经灌胃或注射进入体内后，药物在发挥本身基本抗炎作用的同时，可能与雌激素产生了一定协同作用，使抗炎效果增强并明显高于同组的雄鼠。这个结果刚好适合清宫液 的临床用药要求。在给患子宫内膜炎的母牛用药后，如果药物能够与母牛体内的雌中国农业科学院硕士学位论文 第二章 抗炎模型实验 39 性激素产生协同作用，则可以成倍地提高药效，更为有效和快速地治疗子宫内膜炎。依据这个实验结果，我们可以考虑在临床用药中调整用药时间和剂量，提高药效。在以 后的研究中，可以考虑进一步确定清宫液 的药效与 雌激素 或 性别 的关系，确定协同作 用的程度，为治疗用药提供更准确的参考。 细血管通透性增加 实验 在机体出现炎症的病理变化时，尤其是急性炎症， 组织受 致炎物质 损伤后 ， 微循环很快发生 变化，血管口径的改变，内皮细胞收缩 、 直接内皮损伤 、 白细胞介导的内皮损伤 、 新生毛细血管壁的高通透性 都 可引起血管通透性 等 的增加 ，并且 在对某些刺激的反应过程中均发挥作用。毛细血管通透性增加是多数炎症必然要出现的一个变化，是炎症的特征之一。 有效地抑制毛细血管的通透性是治疗炎症的一个重 要方面。 在实验动物体内，用不同的致炎因素引起局部炎症反应，然后经静脉给予特定染料，在一定时间后测定染料在炎症部位的渗出量，并根据炎症部位着色的深浅反映毛细血管通透性的大小。将大鼠背部剃毛后皮内注射组胺、 5滴二甲苯，然后立即经舌下静脉、股静脉或尾静脉输入染料，一定时间后处死动物，可用测量着色面积的方法来比较血管通透性的大小，也可以将染色皮肤浸入水 4h 以上，过滤后用分光光度计比色，比较染料的渗出量。通过毛细血管通透性增加模型可以考察在炎症发生过程中，不同的药物对致炎因 素引起的血管通透性增加有无拮抗作用。本实验以醋酸诱发小鼠的腹部炎症，经尾静脉注射染料后，用比色法检测染料在炎症部位的渗出量，从而验证清宫液 的抗炎作用。 醋酸在腹腔中可引起腹膜炎，其表现之一就是提高腹腔血管 。 尤其是毛细血管的通透性，增加炎性渗出。伊文思兰做为一种染料，在由尾经脉注射入小鼠血管后会随小鼠血液循环迅速遍布全身，当小鼠腹腔毛细血管通透性升高时，伊文思兰即可轻易透过毛细血管壁进入腹腔，在一定时间内通过测定伊文思兰的渗出量即可考察毛细血管的通透性高低。 本实验中模型组渗出染料的吸光度为 高于一些文献（ 许俊然等， 1995；谢金鲜等，1998） 的实验结果 ,可能是由于本实验中使用的冰醋酸浓度 比 较高 ,导致毛细血管通透性增加较多 ,使染料渗出增多 ,但 本实验 染料渗出量还是在一个正常的可控制的范围内 ， 因而实验结果依然可信 . 从 t 检验的结果来看， 小鼠清宫液 高剂量（ 灌胃给药可以明显地抑制由醋酸引发的毛细血管通透性增加，从而抑制醋酸引发的炎症。低剂量（ 灌胃给药同样可以抑制醋酸引发的炎症，因此，清宫液 在这两个剂量上具有明显的抑制毛细血管炎性通透的作用。临床中 可以依据这两个剂量调整合适的用药量。由于低剂量已经表现出了很好的抗炎效果，因此以后可以设计更低用药剂量来在毛细血管通透性增加模型中验证清宫液 到可以抑制毛细血管通透性增加的最低剂量，为临床用药提供参考。 清宫液 高剂量组与清宫液 低剂量组在抑制醋酸引起的炎症上差异极显著，在证明两个剂量都有效的同时可以推测清宫液 在抑制毛细血管通透性增加方面呈剂量依赖关系，其抗炎效果随着用药剂量的增加而出现明显的增强。参考其半数致死量可以确定一个清宫液 的有效剂量范围，作为临床用药的参考。 中国农业科学院硕士学位论文 第二章 抗炎模型实验 40 清宫液 高剂量抑制毛细血管通透性增加的作用明显好于可的松，有显著差异。而清宫液 低剂量组在染料渗出的测量结果上虽与氢化可的松组由较大差别，但统计结果显示二者并没有显著差异。高剂量和低剂量的抗炎作用分别强于和弱于氢化可的松，氢化可的松是公认的有效的标注抗炎物质，与其比较的结果使我们可以了解到不同剂量的清宫液 对醋酸诱导的炎症的治疗有效程度，为临床实际用药时分析药效提供参考。 跖肿胀 实验 肿胀是急性炎症的一个主要指标。通过对肿胀这一病理变化的抑制效 果可以检验药物在抗炎方面的效果。在制造 足跖肿胀模型时，既可以以小 鼠为实验动物，也可以以 大 鼠为实验动物，将一定量的致炎剂注入后肢足跖或踝 部 皮下，造成足跖或关节肿胀，在一定时间内测定足跖或关节的周长、厚度、或整个足跖、关节的容积、重量，比较用药组和对照组足跖或关节的肿胀率或肿胀抑制率，从而考察药物对足部肿胀炎症的治疗作用。可引起足跖炎性肿胀的致炎剂比较多， 如 角叉菜、右旋糖酐、琼脂、鸡蛋清、甲醛、酵母液、白陶土 ， 以及组织胺、 55前列腺素 。 在炎症发生过程中，致炎因子能够激活细胞膜磷脂酶 2， 此酶将膜磷脂的酯键水解，释放出花生四烯酸（ 通过脂肪酸环加氧酶的作用生成前列腺素（ 物质。前列腺素物质具有很强的生物活性，其中， 有 很强的致热和致痛作用。在小鼠足跖肿胀模型中，在通 过由足部重量增加的程度来反映药物对肿胀的抑制作用的同时，考察 对 合成 是否 有 抑制作用。 小鼠足跖肿胀度的讨论 肖宏安等 （肖宏安等， 1994） 在研究口康散的药理作用时使用了角叉菜胶致小鼠足跖肿胀的 炎症模型，其空白组的足肿胀度为 本实验中模型组足肿胀度经过计算为 个实验鼠足肿胀度比较接近，但本实验的足肿胀程度略高，这可能是由于本实验的选用的小鼠体重（平均 肖宏安等选用的小鼠体重（ 22g）大所造成的，。从肿胀程度来看，本实验制造的模型达到了制造炎症 肿胀 的目的。 小鼠足跖肿胀是模拟炎症肿胀病理变化的一种模型，在此模型中，清宫液 通过灌胃给药后，在高剂量下很好地抑制了角叉菜胶引起的足跖肿胀，与模型组具有明显的差异，抗炎效果十分理想。同时，低剂量灌胃组也表现出了很好 地抗炎效果，与模型组差异极显著，这两个剂量都具有对肿胀的有效抑制作用，在临床中应该可以起到对子宫内膜炎的抗炎作用。由于低剂量抑制水肿的作用明显，因此可以进一步考察更低的用药剂量在抑制炎症水肿方面的作用，找到抑制有效抑制肿胀的最低剂量，为临床用药提供参考。 高剂量和低剂量的清宫液 在抑制足跖肿胀上与氢化可的松的药效相近，差异不显著，三者在抑制肿胀方面功效比较接近，由于氢化可的松是一种十分有效的抗炎物质，因而可以肯定高低两个剂量的清宫液 在抗炎方面有良好的效果，可以在临床中对奶牛的子宫内膜炎起到有效的治 疗作用。 中国农业科学院硕士学位论文 第二章 抗炎模型实验 41 足跖 出的讨论 于组织源性炎性介质，它具有扩张血管、增加毛细血管 微经脉通透性、松弛平滑肌、致敏痛觉神经末梢和引起发热的作用。角叉菜胶、硅胶、酵母多糖等炎症刺激剂均可刺激合成。考察清宫液 对 作用可以从细胞因子的水平探讨清宫液 的抗炎机理。本实验中的模型组检测 吸光度达到 明在小鼠足跖肿胀模型中确有炎症反应而渗出，与文献（ 王文魁等， 2000） 相符。 清宫液 与模型组存在明显差别，表明该剂量可以有效地抑制炎症组织中 且与氢化可的松的抑制效果存在显著差异，明显好于氢化可的松，在临床中应该可以十分有效地减少组织中的 量，降低由 来的炎症反应，加快炎症恢复。 清宫液 低剂量也有较好的抑制炎症组织 成的作用，证明低剂量依然有很好的抗炎效果，可以在临床用药中从抑制 成方面有效降低子宫内膜炎发生过程中的炎症反应，低剂量清宫液 与氢化可的松的作用效果相 近，差异不显著，二者处于同一水平，但从平均数来看，抑制效果稍好于氢化可的松，应该可以达到临床用药的要求。由于高低两个剂量都对 抑制明显有效，因而可以将更低的剂量用于小鼠足跖肿胀模型，以探求对该模型有抗炎作用的最小剂量，作为临床用药量的调整依据。 小鼠足跖肿胀模型中同时考察了清宫液 在抑制足肿和 成两个方面的作用，从实验所得数据分析，不论是单独观察一个指标还是二者同时考察，高剂量和低剂量的清宫液对炎症都能很好地抑制，且抑制效果都是随剂量的加大而增强，抑制水平与氢化可的 松相当，甚至高于氢化可的松。因此可以认为，清宫液 具备良好的抗炎作用，在临床应用于治疗奶牛子宫内膜炎时可以收到一个很好的疗效。 芽肿 实验 肉芽组织增生是炎症的一个防御性的病理变化，是在致炎因子、炎症介质的刺激下，炎灶内出现单核 纤维细胞、血管内皮细胞、上皮细胞等的细胞成分的增殖分化，在 慢性炎症 以及 炎症后期表现比较明显。 肉芽肿模型是模拟慢性炎症的增生性变化，将棉球、纸片、巴豆油、塑料环、琼脂等异物埋入动物局部皮下，引起与临床炎症相近似的肉芽增生变化，以便观察药物对肉芽肿重量的影响，判断其对慢性炎症的效果。 慢性炎症是常见的病理变化，由巨噬细胞和纤维母细胞等细胞引起的肉芽组织增生则是其较为明显的特征。滤纸片作为一种异物进入动物皮下后会引起局部组织的防御性炎症反应，产生肉芽，滤纸片附近肉芽组织越多，炎症反应越明显。 高剂量清宫液 的连续灌胃给药能够明显起到抑制肉芽组织增生的作用，与模型组的差异极显著。高剂量在对抗慢性炎症方面表现出良好的效果，可以用于治疗慢性子宫内膜炎。低剂量清宫液 与模型组也有极显著的差异，同样表现出了良好的抗炎效果，在临床中也应该可以对慢性炎症有好的疗效。 以这两个剂量为参考，在临床中处理慢性子宫内膜炎时可以根据实际情况给出合适的用药剂量，以求尽快治疗子宫内膜炎。高剂量和低剂量都对滤纸片引起的中国农业科学院硕士学位论文 第二章 抗炎模型实验 42 肉 芽肿有抑制作用，且二者差异不显著，因而在低剂量下或更低的剂量下 清宫液 就可以治疗慢性子宫内膜炎。 由于肉芽肿是慢性炎症，其肉芽增生需要一定的时间，所以在本试验中为了准确地 验证 清宫液 的抗炎效果，采用了连续灌胃给药 18 天的方法。由于灌胃持续时间较长，虽然以 5天为一个疗程，但是药物本身和灌胃行为的刺激都可能对小白鼠的正常生理产生影响。本试验中使用的小白鼠接受长时间的 灌胃刺激，目测体重增长有所减缓，但精神状况良好。体重增长减慢和连续的药物刺激对药物吸收可能也有不利影响。在临床中针对慢性炎症治疗时应该考虑到药物刺激和用药时长的问题，争取以 最短的时间完成 治疗，减少药物刺激。 中国农业科学院硕士学位论文 第三章 抗炎机理研究 43 第三章 抗炎机理研究 1 材料 验动物与细胞系 c 小鼠，雌性，购自甘肃省医学科学院实验动物中心 饲料，购自 甘肃医学科学院实验动物中心。 鼠成纤维细胞（ 胞）株，中国科学院上海细胞库提供。 要试剂 硫代乙醇酸钠，生化试剂，北京奥博星生物技术责任有限公司， 生产批号 20040825。 磷酸缓冲液（ 于三蒸水中溶解 2.7 9.8 21.5 高压灭菌 。 养液， 司 产品，三蒸水配制， 滤除菌。 新生牛血清（ 兰州市民海生物工程有限公司。 胰酶（ 1:250），生化试剂，上海惠世生化试剂有限公司，以 成 液，过滤除菌。 细菌脂多糖（ 品， 5。 台盼兰 （ ， 司 产品，以少量蒸馏水研磨溶解为 4母液，用时以 释为 放线菌素 D（ 品，以三蒸水配制，过滤除菌。 四甲基偶氮唑盐（ 司产品，以 制为母液，过滤除菌，避光保存。 二甲基亚砜（ 分析纯，天津化学试剂二厂，生产批号 19991106。 一氧化氮测定试剂盒，南京建成生物工程研究所提供。生产批号 20041207。 其它试剂为国产分析纯。 要器材 96 孔细胞培养板， 司。 电子天平 ， 。 精密天平： 。 倒置显微镜， 。 显微镜， 二氧化碳恒温培养箱， 长沙医疗器械厂 ， 。 超净工作台， 北京半导体设备一厂 ， 月坛 型 。 细胞培养瓶，上海化玻一厂。 中国农业科学院硕士学位论文 第三章 抗炎机理研究 44 紫外 津 ， 120 。 酸度计， 上海雷磁仪器厂， 离心机， 上海手术器械十厂， 800 型。 酶标仪， 上海雷磁分析仪器有限公司 ， 2 实验方法 O 与 体外诱生 （ 1）选取健康、雌性、体重 18g 左右的 c 小鼠，第一天腹腔注射 硫代乙醇酸钠 二天追加 注射 代乙醇酸钠 。 （ 2）第三天拉颈处死小鼠，在 75乙醇中浸泡 1 （ 3）将小鼠置于超净工作台上，在无菌条件下剪开腹部皮肤，暴露腹膜。吸取 2液 注入腹腔，用酒精棉球按压腹膜轻轻按摩 1钟，然后吸出腹腔液，注入无菌离心管。此 步骤重复 3 次。 （ 4）将收集的全部腹腔液于离心机上 1500心 5上清。 （ 5）用 复洗细胞一次，将细胞沉淀用 1 10胎牛血清的 养液悬浮细胞， 细胞计数后将细胞浓度调整到 1106/入 96 孔细胞培养板，每孔 37 5养箱内培养。 （ 6）培养 2h 后用 去未贴壁细胞，贴壁细胞即为巨噬细胞，重新加入 10 养液。 （ 7）将巨噬细胞分为 5 组，分别为清宫液 高剂量组、清宫液 低剂量组、氢化可的松对照组、 型组和空白组，每组 3 个复孔，每孔所加溶液如表 25。 表 25 各组巨噬细胞培养液中所加抗炎物质与 度 of PS in of 炎药物终浓度（ g/ 浓度 （ g/ 清宫液 高剂量组 0 清宫液 低剂量组 0 氢化可的松组 0 型组 0 20 空白组 0 0 （ 8）按照表 25 所示先加入抗炎药物，然后加入 孔最终达到 1足 1体积以养液补足，放置 37 5 养箱内培养。 （ 9）每组每孔在培养 6h 和 24h 后分别收集 300待测 中国农业科学院硕士学位论文 第三章 抗炎机理研究 45 噬细胞培养上清液中 检测 取每孔上清液 100l，采用硝酸还原酶法，按照一氧化氮测定试剂盒的说明检测并计算上清液中 含量。 噬细胞培养上清液中 检测 成纤维细胞（ 胞）的培养 将购 买的 胞用 胰酶消化后重悬于含 10 养液中进行传代 ， 置 37 5 养箱内培养 。当细胞传代 3 代、细胞系稳定后，选取处于对数生长期的细胞用于实验。 宫液 药剂对 细胞毒性检测 （ 1）将传代的处于对数生长期的 胞在无菌环境下用 胰酶消化，消化后重悬于少量 10 养液中，用血细胞计数板在显微镜下进行细胞计数，调整细胞浓度为 5 105/ （ 2）台盼兰染色，计数细胞活力 95 。 （ 3）将细 胞接种于 96 孔培养板， 100l/孔，置 37 5 养箱内培养 20h 贴壁。 （ 4）吸弃细胞培养上清液，将细胞分为 清宫液 高剂量组、清宫液 低剂量组和 对照 组3 组，每组 3 个复孔，每组每孔分别加含 宫液 的 养液、 宫液 的 养液、不含清宫液 的 养液 200l。将细胞置 37 5 养箱内培养 20h。 （ 5）取出细胞培养板，在每孔中加 0l，继续培养 4h。 （ 6）小心吸弃细胞培养上清液，加 00l/孔，混匀进行溶解。 （ 7）溶解 5，将细胞培养板置于自动酶标仪在 492长测吸光度，以 表示 细胞毒作用。 检测 （ 1）依据文献的方法（ et 1988； et 1993），将传代的处于对数生长期的胞在无菌环境下用 的胰酶消化，消化后重悬于少量 含 10 养液中，用血细胞计数板在显微镜下进行细胞计数，调整细胞浓度为 5105/ （ 2）台盼兰染色，计 数细胞活力 95 。 （ 3）将细胞接种于 96 孔培养板 ， 100l/孔，置 37 5 养箱内培养 20h 贴壁。 （ 4）将细胞按照收集的待测样品分组，并增加对照组。吸弃细胞培养上清液， 每孔 加入含 2g/ 养液 100l。 （ 5）每组每孔相应加待测样品 100l，对照组加 养液 100l，置 37 5 养箱内培养 20h。 （ 6）每孔加 0l，继续培养 4h。 中国农业科学院硕士学位论文 第三章 抗炎机理研究 46 （ 7）小心吸弃细胞培养上清液，加 00l/孔，混匀溶解。 （ 8） 5于 自动酶标仪在 492长测吸光度，以 反应细胞毒作用。 3 实验结果 噬细胞培养上清液中 测结果 各样品在分光光度计 550测吸光度， 计算 量， 结果如表 26 表 26 各组在 激 6h 和 24 后的 量 he O h 4h in O 含量 (6h) () 量 (24h) () 清宫液 高剂量组 宫液 低剂量组 化可的松组 型组 白 组 培养 6 小时后进行检测的一组 清宫液 高剂量组 量高于空白组，差异极显著（ p 中国农业科学院硕士学位论文 第三章 抗炎机理研究 47 噬细胞培养上清液中 宫液 药剂对 细胞毒作用检测结果 用 胞检测不同浓度的清宫液 的细胞毒作用结果如表 27 表 27 以 测清宫液 细胞毒作用 he I 929 物浓度（ g/ 清宫液 高剂量组 宫液 低剂量组 照 组 表中数据进行 t 检验分析，各组间都没有显著差异，高剂量和低剂量的清宫液 对 利 影响。 宫液 对 生 影响 清宫液 对 激巨噬细胞产生 抑制效果如表 28，按照以下公式计算细胞毒作用。 细胞毒百分率（） 对照组吸光度 样品吸光度对照组吸光度 100 表 28 以 测的巨噬细胞培养上清液细胞 毒作用结果 he of 929 D 值 (6h) (x 6h 细胞毒 ( ) (24h) (x 24h 细胞毒 ( ) 清宫液 高剂量组 宫液 低剂量组 化可的松组 型组 白组 照组 养 6h 后进行检测的一组 空白组与清宫液 高剂量组比较差异极显著（ p 中国农业科学院硕士学位论文 第三章 抗炎机理研究 48 清宫液 高剂量组与清宫液 低剂量组比较差异极显著（ p 与氢化可的松组比较差异显著（ 清宫液 高剂量组与清宫液 低剂量组比较差异极显著（ p 养 6h 与培养 24h 的两组之间进行比较 在同剂量的相对应的两个组之间进行比较，只有两个清宫液 高剂量组之间差异极显著（ p 其它组间比较均无显著差异。 4 讨论 测结果的讨论 一氧化氮（ 一氧化氮合成酶催化 的的产物，是人类发现的第一个在机体内具有信号传导作用的气体分子（ et 1980； 1983； et 1996； et 1987），在 1992 年被 为“明星分子”（ 1992）。机体内重要的信使分子和效应分子，既具有免疫调节功能又有细胞毒作用，与炎症的发生密不可分。大量实验表明， 过度产生与一些细胞因子密切相关，并且会造成机体对有害物质的过度炎症。 炎症反应的许多环节发挥复杂的调节作用。炎症反应时，致炎物或炎症介质（如白三烯 ）可诱导或增加局部 合成和释放，而 般地 说，组织中诱生型 酶（ 炎症反应中被诱导产生，生成大量 进炎症反应，诸如血管扩张充血、水肿、细胞毒性以及细胞因子依赖过程的中介作用等。相反地，由内皮细胞中原生型 酶（ 产生的 通过激活微血管中的中性粒细胞，阻止细胞粘附