【毕业学位论文】（Word原稿）石油污染土壤微生物修复的研究农业微生物学博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 石油污染土壤微生物 修复的研究 I 摘 要 本文针对目前我国土壤石油污染的现状以及石油污染土壤微生物修复目前存在的主要问题，缺少高效石油降解菌株、降解微生物之间作用机制不清楚以及修复工艺不完善等，从分离筛选原油降解菌株入手，根据原油的主要组分对菌株进一步复筛并构建石油降解菌群，通过室内模拟石油污染土壤进行生物修复试验对菌群的石油降解效果进行验证， 采用传统培养方法、 平板法以及 术从 微生物生态学 的角度，对石油污染土壤微生物修复 过程中菌群 其它土壤微生物的变化进行 研究，试图探索生物修复过程中微生物间的 变化规律 ，本研究的主要结果如下： 1）从石油污染样品中 分离得到石油降解菌株 260 株，构建 了石油降解菌群 5 天内石油降解率可以达到 比单一菌株在相同条件下降解率提高了 气相色谱分析表明菌群以有效降解原油中的不同组分。 2） 经鉴定菌群 四株菌分别 为红平红球菌（ 人苍白杆菌（ 铜绿假单胞菌（ 紫红红球菌 （ 3）通过 室内石油降解条件的优化，菌群 最适 为 710，最适 N 源为 适P 源为 各菌株间最佳接种配比 1:1:20:1， 最佳 石油降解条件为 1000机盐培养液中 g、 g、 种比例为 石油浓度为 该条件下 其降解率可达到 83%以上 ，并且更有利于 原油中饱和烃和芳烃的降解。 4） 模拟石油污染土壤修复试验结果表明，在 接种菌群 添加营养液的条件下，经过 102天的生物修复， 石油降解率达到 82%， 石油的降解起到了关键作用。 5）采用 技术研究表明，该菌群可以在石油污染土壤中较好定殖； 微生物生态学研究结果表明， 在修复的前期（ 0 至 21 天），优势菌群以 主；在修复的中后期（ 22 至 102天），菌群数量开始下降， 土壤中微生物群落发生改变，其 代谢能力发生了变化。 本研究不仅为石油污染土壤生物修复提供了菌种资源，而且 为 今后如何 构建微生物菌群提供了 一条捷径和新的 思路， 为 优化石 油污染微生物修复工艺提供了理论依据。 关键词 ： 土壤 ，石油 污染， 微生物菌群， 生物修复， 平板法，变性梯度凝胶电泳（ to of in of in as of of of so in 9 by of on of 9 by of 9 by in to of as 1) 260 9 9 9 2) 9 3) 9 in pH 10, 2of :1:20:1. of g 1g , 000mL 3%, 4) of of 2% in of 9 02 of 9 in 5) of 9 in of 9 in a of 9 at of to 1), in to at 2 to 02), of of a of in of as 录 摘 要 . I . 文缩略表 . 6 第一章 引言 . 1 油及石油污染土壤的现状 . 1 油 . 1 油污染土壤的来源 . 1 油污染土壤的危害 . 2 油污染土壤对土壤微生物的影响 . 3 油污染土壤治理方法概述 . 4 油污染土壤生物修复的研究进展 . 4 生物对石油的降解 . 4 油污染土壤的生物修复技术 . 7 响石油生物降解的因素 . 9 壤微生物分子生态学研究方法概述 . 14 生物分子生态学主要研究方法 . 14 . 18 研究的目的意义及技术路线 . 23 研究的目的和意义 . 23 究内容和技术路线 . 24 第二章 石油降解菌株的分离及石油降解菌群的构建 . 26 料与方法 . 26 料 . 26 法 . 27 果与 讨论 . 28 . 28 离结果 . 29 油降解率的测定 . 30 同石油烃降解菌株的筛选结果 . 30 面活性剂产生菌的筛选 . 30 油降解微生物菌群的构建 . 30 群 . 31 结 . 33 图： . 34 三章 石油降解菌株的鉴定 . 35 料与方法 . 35 料 . 35 法 . 36 果与讨论 . 39 步鉴定结果 . 39 . 40 株全细胞脂肪酸分析结果 . 41 株 16. 43 结 . 47 图： . 48 第四章 石油降解菌群室内石油降解条件的优化 . 49 料与方法 . 49 料 . 49 法 . 49 果与讨论 . 51 . 51 株间不同接种比例的正交试验结果 . 53 佳石油降解条件的正交试验 . 53 群 原油组分的气相色谱分析 . 54 结 . 56 第五章 菌群 石油污染土壤生物修复试验中的应用 . 58 料与方法 . 58 料 . 58 法 . 59 果与讨论 . 59 油提取方法的重复性实验 . 59 油污染土壤菌群 . 60 结 . 61 第六章 菌群 石油污染土壤生物修复中的监测研究 . 62 料与方法 . 62 料 . 62 法 . 63 果与讨论 . 64 油污染土壤总 提取及 增 . 64 油降解菌群 . 65 结 . 69 第七章 石油污染土壤生物修复试验的分子生态学研究 . 70 V 料与方法 . 70 料 . 70 法 . 71 果与讨论 . 74 油污染土壤微生物修复不同时期细菌数量的测定 . 74 油污染土壤微生 物修复不同时期的基因多样性分析 . 75 油污染土壤微生物修复中的主要微生物种类及系统发育分析 . 80 油污染土壤微生物修复不同时期微生物代谢活性的变化 . 82 油污染土壤微生物修复不同时期微生物代谢功能多样性分析 . 83 油污染土壤微生物修复不同时期微生物代谢特征的主成分分析 . 84 结 . 88 第八章 结论与展望 . 90 论 . 90 望 . 92 参考文献 . 94 致 谢 . 113 作者简历 . 114 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 环芳香碳水化合物 in 光原位杂交 性梯度凝胶电泳 时荧光定量 术 脂脂肪酸谱图分析 肪酸谱图分析 基脂肪酸谱图分析 的不可培养状态 色荧光蛋白 聚焦激光扫描显微镜 段荧光显微技术 端限制性片段长度多态性 度梯度凝胶电泳 一碳源的利用能力 均颜色变化率 成分分析法 中国农业科学院 博 士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引言 油及石油污染土壤的现状 油 石油是原油和石油制品的总称 。 我们通常所说的石油是指直接从地下开采出来未经过提炼的天然烃， 亦 被称为原油，一般为黑色或黑褐色的粘稠液体 。原油 是积累的有机物质经过地质变迁而形成的， 主 要由链烷烃、环烷烃、芳香烃以及少量硫化物、氮化物、环烷酸类等非烃化合物组成的复杂混合物， 其中烃类占所有组分的 95徐玉林， 2004）， 其化学组成 、 颜色和物理性状 等 随产地的不同 而略有不同。有的石油样品可含 200300 种烃类，不同组分 的相对 分子量相差很大，从 16（甲烷）至 1000 左右，其物理状态 可为 气体、挥发性液体、高沸点 液体 以及固体。根据不同组分的不同性质，可以炼制出燃料、溶剂、润滑油、沥青等多种不同石油产品。 石油是现代社会的最主要能源之一，被称作 “工业的血液 ”“黑色的金子 ”。 同样石油工业在 国民经济中占有十分重要的地位，也是国家综合国力的重要组成部分，因此世界各国十分重视石油工业的发展。 全世界大规模开采石油是从 20 世纪初开始的， 1900 年全世界消费量约 2000 万吨，100 年来这一数量已增长百余倍 （陆秀群等， 2003） ， 现在，产油的国家和地区已有 150 多个，发现的油气田已有 4 万多个， 目前世界石油年产总量达 22 亿吨 ，其中 吨是由陆地油田生产的 。我国 目前 已在 25 个省和自治区中找到了 400 多个油气田或油气藏 ， 自 1978 年以来我国石油年产量突破一亿吨大关从而成为世界十大产油国， 现在 年产石油近 吨。 油污染土壤的来源 随着石油工业的迅速发展，全世界每年约有近 800 万吨石油污染物进入环境，其中我国每年有近 60 万吨 石油污染物 进入环境， 而这些污染物通过多种途径最终 仍旧 进入土壤环境 ，造成土壤的石油污染， 我国自 78 年以来年产石油污染土壤近 10 万吨 ，目前石油污染土壤面积达 500 万公顷 。 石油污染物主要通过以下五种 途径 进入到土壤 （李宝明， 2004；李慧， 2005） ： 1 1 2 1 原油泄漏和溢油事故 在我国的矿业生产过程中，还存在一些不合理的作业方式，在采油井洗井和检修时，都会有大量的原油洒 落在油井周围，造成了严重的环境污染和生态破坏。此外， 石油及其产品在运输、使用、贮存过程中的渗漏 和 溢油现象时有发生，甚至在原油开采过程中发生井喷事故，造成大量石油烃类物质直接进入土壤，由此引起的突发性泄漏往往造成数量多、浓度高、危害大的局部污染， 石油浓度 大 大超过土壤颗粒能够吸附的量，过多的石油存在于土壤空隙中，使小范围内的生态系统完全毁灭。 1 1 2 2 含油矿渣、污泥、垃圾的堆置 石油在开采、冶炼时产生大量的含油废弃物， 这类物质主要包括含油岩屑、含油泥浆等。这些含油废弃物往往堆积在厂矿周围，在堆放的过程中， 经过雨水的冲刷、淋洗便向周围土壤中浸入相当数量的油，致使土壤中石油 烃 类含量比非堆放区高出数倍。广东茂名市就曾因大量堆积含油矿渣使大片的农田污染，成为寸草不生的荒地。 中国农业科学院 博 士学位论文 第一章 引言 2 1 1 2 3 污水灌溉 使用含油污水灌溉农田是土壤受石油污染的主要原因之一。许多工业废水和生活污水都含有石油烃类 物质 ，另外石油开采、冶炼、加工和以石油为原料的化工部门排放的废水 也 都含 有 大量的石油烃类物质，长期使用这类污水灌溉农田必然导致土壤石油污染。 1 1 2 4 大气污染及汽车尾气的排放 石油炼化企业和工厂在生产过程中，都有部分石油中可挥发成 分进入大气，这些成分可与大气中颗粒物结合成降尘进入土壤。有研究表明，大气降尘污染区的土壤矿物油含量比对照区高出12 倍。此外，各种使用汽油、柴油的车辆在行进中排出的尾气中也含有大量未燃烧的石油成分，这些成分也会以沉降物的形式进入土壤。 因此，公路两侧土壤中往往含有较多的石油污染物。 1 1 2 5 药剂污染 油类经常作为各种杀虫剂、防腐剂和除草剂的溶剂或乳化剂等，当使用这些农药时，油类就同时进入土壤，增加了土壤中的石油烃含量使土壤污染。 油污染土壤的危害 在石油污染物进入土壤后，由于其特殊的物理 和 化学性质 以及 难以去除 并 残留时间长 的特点 ， 因此 对土壤和生态环境造成一 系列 的危害， 给 污染地区的生态、作物以及人类健康 带来 负面影响。 主要表现在以下 四个方面： 1 1 3 1 石油污染对土壤理化性质的影响 石油类物质进入土壤，能够改变土壤有机质的组成和结构，引起土壤有机质的碳氮比（ C/N）和碳磷比（ C/P）的变化。由于石油密度比较小，粘着力强且乳化能力低， 因此在土壤中容易与土粒粘连，堵塞土壤孔隙，影响土壤的通透性 （夏立江等， 2001） 。 1 1 3 2 石油污染对作物的危害 不同作物受石油污染的影响是不同的，石油污染对 作物生长发育的不利影响主要表现为：发芽出苗率低，各生育期推迟，贪青晚熟，结实率 下 降，抗倒伏、抗病虫害的能力降低等。此外，石油中富含反应基，能与无机氮、磷结合并限制硝化作用和脱磷酸作用，从而使土壤有效氮、磷含量减少，影响作物的吸收， 石油 还 会粘着在植物的根表面，形成粘膜，阻碍根系的呼吸与吸收，引起根系腐烂，影响作物根系的生长，甚至造成作物的死亡 ，使作物减产 。 另外，石油类物质进入土壤后，经过土壤生态系统的一系列作用，在土壤、作物各部分都有残留，影响粮食质量，使粮食的品质下降。例如沈抚污灌区由于长期使用含油污水进行 灌溉，生长的大米常伴有难闻的气味，其中油残留量严重超标，并由此引起大米中其它营养成分的变化 （吴维中等， 1982） 。 1 1 3 3 石油污染物中有毒物质对人的危害 石油是多种组分的混合物， 而且石油中各种馏分物 (组分 )的毒性也是不一样的 （马志华，2002） ， 其中毒性较大是石油中的多环芳烃 （ ，多环芳烃具有致癌性、致突变性和致畸性等作用 （ 1992） ，而低沸点的燃料油及润滑油类能引起人体的麻醉、窒息、化学性肺炎和皮炎等 （朱孟龙， 1999） 。作物和粮食对石油污染物有吸收残留效应，这些有毒 物质可以通过食物链 间接影响人体健康。另外，石油中不易被土壤吸附的污染物成分可以随地面降水渗透到地下水，污染浅层地下水环境，影响饮用水的质量，最终危害人体健康。 中国农业科学院 博 士学位论文 第一章 引言 3 表 1见 化合物致癌性比较 （王连生， 1995） he of 物质名称 致癌活性 物质名称 致癌活性 萘 - 苯并 (a)芘 + 苊 - 苯并 (e)芘 - 芴 - 苯并 (k)荧蒽 + 菲 - 晕苯 - 蒽 - 茚并 (1,2,3-c,d)芘 * 芘 - 二苯并 (a,h)蒽 + 荧蒽 + 苯并 (b)荧蒽 + 屈 + 注 “-”:不致癌 ;“+”:弱致癌 ;“+ +”:致癌 ; “+ + + +”:很强致癌 ; * :已由动物试验验证致癌 1 1 3 4 土壤的石油污染给国家带来巨大经济损失 土壤的石油污染不仅给环境和生态系统带来巨大的危害，同时也给国家、公司和企业造成 无法挽回 的经济损失。 1998 年中国石油天然气集团公司所属的石油、炼化企业共发生污染事故 151次 ,污染事故赔罚款总额 元 ,各石油、炼 化企业共交纳排污费 元 （中国石油天然气集团公司， 1999） ， 2005 年仅胜利油田就因石油污染被东营市环保局处以 9 亿元的罚款。 （中国石油化工股份有限公司， 2006） 油污染土壤对土壤微生物的影响 微生物是土壤生态系统中的重要成员。它们可以分为细菌、放线菌、真菌、藻类和原生动物等。由于土壤类型、植物群落和气候条件等因子的影响，土壤微生物的分布类型和生理活性也存在着一定的差异。土壤微生物类群的特性和数量与土壤肥力和植物生长有密切关系。在土壤以及生物圈的物质循环和能量流动中，土壤微生物起着关 键作用。它们参于的主要生态化学过程有：有机化合物和动、植物及微生物残体的分解；固氮作用；腐殖质的分解与形成；磷、硫、铁及其它化学元素的转化，以及碳、氮、磷的生物地球化学循环等。 在生态系统中，作为分解者的微生物，细菌以占绝对优势的生物量起到重要作用，成为生物修复研究工作中的主要对象。 微生物种群结构与多样性都是表征生态系统群落结构的重要参数，其对环境污染物的反应表现为多种形式。有的表现为遗传适应，有的表现为生理适应，有的则表现为种群结构的变迁，即以具抗性种取代敏感种。 石油污染物进入土壤后对生态环境的 影响 首先表 现为对土壤微生物的影响， 石油及其产品进入土壤能够导致土壤微生物种群数量的改变、群落结构和组成的变化及群落多样性的变化。 有调查表明，石油污染地区土壤中的嗜油微生物数量（细菌、放线菌、真菌）与对照土相比有不同程度的增长。这是由于石油污水长期灌溉，使得土壤中形成了土著嗜油微生物区系，其中微生物类群以细菌为主，细菌的生物量总是占绝对优势 （李宝明， 2004） 。 国内外许多学者应用传统的微生物培养技术和前沿的分子生物学技术对石油烃污染土壤中微生物的生态过程进行了大量的研究。这些研究的大多数结论表明石油污染能够导致土壤中微 生物多样性的降低，不同种群在数量上的变化，群落结构和组成改变 的 同时石油烃降解菌群逐渐成为群落中的优中国农业科学院 博 士学位论文 第一章 引言 4 势菌群。在研究土壤石油烃污染对微生物影响的同时 ，也扩展了对石油降解微生物的认识，发现了许多以前没有发现的降解菌种 （李慧， 2005） 。 油污染土壤治理方法概述 鉴于石油对土壤造成污染后产生的严重危害，世界各发达国家纷纷制定了土壤修复计划。如荷兰在 20 世纪 80 年代就已花费了约 15 亿美元进行土壤的修复工作，德国在 1995 年约投资 60亿美元净化土壤，美国 20 世纪 90 年代用土壤修复方面的投资达数百亿甚至上千亿美 元。 在石油 污染 土壤修复技术方面， 80 年代以前，还仅限于物理和化学方法 。 物理方法包括挖掘填埋法、气提吹脱法、电解法、洗涤法和隔离控制法等，主要为热处理法，即是通过焚烧或煅烧，可净化土壤中大部分有机污染物，但同时亦破坏土壤结构和组分，且所用的燃料和设备价格昂贵因此很难实施。化学方法包括氧化剂氧化法、光化学氧化法、热分解法、萃取法和化学棚法等，主要为化学浸出和水洗也可以获得较好的除油效果，但所用的化学试剂的二次污染问题限制了其应用。 80 年代以来，环境以及人类社会的可持续发展越来越受到人们的重视，因此石油污染土壤的生物修复技术越来越引起人们的关注。所谓生物修复是利用生物的生命代谢活动减少土壤环境中有毒有害物 质 的浓度，使污染土壤恢复到健康状态的过程 （陈玉成， 1999） 。 石油污染土壤的生物修复，是指利用微生物及其他生物，将存在于土壤中的有毒有害的石油污染物现场降解成二氧化碳和水或转化成为无害物质的工程技术系统，它是传统的生物处理方法的延伸 （金樑， 1999） 。在自然界中，存在许多能够以石油或其化工产品为碳源和能源的微生物。1993） 曾报道过降解 石油 烃的微生物存在土壤中，但一般情况下，降解烃的微生物只占微生物群 落的 1%。生物修复由于能够治理大面积污染而成为一种新的可靠的环保技术，已得到世界环保部门的认可，并引起了工业界的关注，预计生物修复服务和产品平均每年增长 15%，生物修复在治理土壤污染方面的作用已越来越突出。生物修复的类型主要包括微生物对 污染 土壤的修复、植物对污染土壤的修复及微生物 中微生物对污染土壤的生物修复是近年来科学家研究的重点。 油污染土壤生物修复的研究进展 生物对石油的降解 1 3 1 1 微生物降解石油污染物的优势 动物、植物、微生物都具有降解污染物的能力， 但微生物在污染物降解中的作用最大。这是因为微生物具有种类多、分布广、个体小、繁殖快、比表面积大、容易变异的特点。微生物的降解酶系具有氧化还原作用、脱羧作用、脱氨作用、水解作用、脱水作用等各种化学作用能力，所以对能量的利用比高等生物体更加有效。微生物高速度的繁殖和遗传变异性使它的酶体系能够以最快的速度适应外界环境的变化，从而显示出其在环境治理上的高效性和多样性。 1 3 1 2 环境中降解石油的微生物 能降解 石油 烃的微生物非常多，有 100 余 属， 200 多个各种 （ 顾传辉等 ， 2001），不同报道中微生物的数量略有出入 。 降解石油烃类化合物的细菌主要有：无色杆菌属（ 不中国农业科学院 博 士学位论文 第一章 引言 5 动杆菌属（ 产碱杆菌属（ 节杆菌属（ 芽抱杆菌属（ 黄杆菌属（ 棒杆菌属（ 微杆菌属（ 微球菌属（ 假单孢菌属（ 分枝杆菌属（ ；放线菌中有放线菌属（ 、诺卡氏菌属（ 真菌 主要 有：金色担子菌属（ 假丝酵母属（ 、红酵母属（ 掷孢酵母属（ 曲霉属（ 毛霉属（ 镰刀霉属（ 青霉属（ 木霉属（ 被孢霉属（ 。 它们的细胞均含有改变了的脂肪酸组分和较多的核糖体，并常将烃类累积在细胞质膜上，它们也能合成较多的磷脂 。一般认为，细菌分解 原油比真菌、放线菌容易的多 ， 更能有效地降解原油。降解原油的微生物大量的存在于污染地区，比未受污染地区高出 12 个数量级。 （ 1998） 利用 制性酶切片段多态分析 (一被烃类污染的含水土层的微生物区系组成进行了调查 ,结果表明 ， 在已确定的 104 个序列类型中 ， 94 个属于细菌 ， 10 个属于古细菌 。 （ 1999） 调查了铁还原条件下被石油污染的含水土层中氧化苯的微生物区系组成 ， 发现 优势 ， 并利用 16变性梯度胶电泳(较了污染土层和相邻地点未 污染土层的区系组成 ,发现了显著差异 。 1 3 1 3 微生物对石油烃的降解 石油中所含的各种烃类，从最简单的 合物至复杂的几十个碳原子的固体残渣，只要条件合适，大多数都能被微生物代谢降解，但难易程度和降解速度不同。一般的石油化学物质按照下列方式被降解 （任磊， 2001） 。 一般来说， 18 范围的直链化合物较易分解，烯烃最易分解，烷烃次之，芳烃较难，多环芳烃更难，脂环烃类对微生物作用最不敏感，至今只发现个别菌株能利用它。在烷烃中， 3化合物，如甲烷、乙烷和丙烷只能被少数具有专性的微生物所利用。 石蜡可被微生物降解，但 其碳原子 数 超过 30 个的组分较难降解，部分原因是因其溶解度小，表面积小的缘故。正构烷烃比异构烷烃易降解，直链烃比支链烃易降解。在芳香烃中，苯的降解极难，比烷基苯和其他多环芳烃化合物要慢的多。 1 3 1 3 1 烷烃的微生物降解 微生物对烷烃分解的一般过程是逐步氧化，生成相应的醇、醛和酸，而后经 终分解成 2O。最常见的氧化是烷烃末端甲基化；此外尚有两端甲基化形成二羧酸，次末端 氧化生成酮类的情况。末端甲基氧化过程如下： 乙酸在微生物代谢中被分 解为 下的少 2 个碳原子的脂肪酸按同样方式经 个碳原子，直至在氧的参与下全部烷烃分解完毕。 甲烷是最简单的烷烃。它不同于其它的气态碳氢化合物，具有两个方面的生物学独特性。第一，它是仅有的靠微生物活动所大量产生的气体；第二，甲烷的分解是由一些对较大分子碳氢化合物没有活性的微生物推动的。它们氧化甲烷以合成自身细胞物质，其氧化过程为： 石油产品 +微生物 +营养元素 +副产品 +微生物细胞生物量 H ( ) n H 3 中国农业科学