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密级: 论文编号: 中国农业科学院 学位论文 亚洲 棉 短 纤维发育突变体蛋白质差异分析 of of of of - I - 摘 要 棉纤维分化、发育的过程是其产量和品质的形成过程,对该过程 的 研究有助于我们通过遗传工程途径人为控制棉纤维 的 生长发育 ,以 提高棉纤维 的 产量和品质, 因此 具有重要的 应用及 理论意义。而 蛋白质是生理功能的执行者,包含了多个维度的生物学信息,蛋白质本身的复杂性使基因组 学不能准确的预测其结构和动力学,需要对细胞生长过程中蛋白质的定位、结构和功能进行直接的分析研究。 本研究利用两种常见的植物蛋白质提取方法 三氯乙酸 对提取效果进行了比较分析。我们发现 使用三氯乙酸 易使蛋白酶失活,潜在的蛋白种类更加丰富,但粗蛋白难以溶解,杂质含量较高,不易获得高浓度的蛋白质溶液,产率较低。而 利用饱和酚 法获得的蛋白质溶液含量和纯度高,操作简单,同时获得的蛋白质种类相对于 三氯乙酸 电点分布更广,因此更适宜于含干扰物质较多的棉花胚珠蛋白 质的提取。 利用饱和酚法对四倍体棉种和二倍体棉种进行了全蛋白的提取,通过 对 粗蛋白产率的 比较分析,我们 发现在相同发育时期两棉种 总 蛋白含量 十分 接近, 而且含量 变化曲线 也非常 相似。 利用胶电泳 获得的 图谱 可知 ,除一些高丰度的组成型蛋白外,图谱差异还是比较明显,反映出了不同的遗传背景,可以作为区分棉种的特征之一;由于 辨率的限制,棉纤维突变体和野生型中没有发现明显的差异蛋白,对于蛋白质组的分析无法提供足够的信息。 通过一系列田间表型及农艺性状的比较分析,我们确定亚洲棉 其突变体 者在表型上非常的接近。除在 植株 色素的表达方面有所不同外,最大的差别体现在短纤维的有无。随后我们利用体式显微镜、扫描电镜及石蜡切片技术对不同时期胚珠表皮细胞进行了细微观察分析,最终确定亚洲棉 纤维起始的时间在开花后五天左右。 我们通过蛋白提取 、 二维电泳凝胶图谱的制备、蛋白点群的构建、凝胶图谱的评估,对开花后 5 天 花胚珠蛋白质组进行了比较分析,经过统计学和人工观测的筛选,共找到差异点 59 个,其中野生型包含特有点 5 个、优势点 14 个,突变体包含特有点 14 个、优势点 26 个。这些蛋白点是经过了科学严格的筛选,稳定可靠 、 重复性好,能够真实的反映出野生型和突变体的差异。同时我们猜测,短绒的起始主要与一些负调控机制有关。 本实验结果为我们进一步利用差异表 达 蛋白克隆功能基因,揭示 植物 细胞分化起始的复杂机制提供了依据。 关键词: 棉纤维发育突变体 , 表型 , 蛋白质组 , 双向 电泳 - he of of on us of by in is a of It is so we by of of of in is to be of of of by On us of I of in a a we as in We of by we of of of we as a to be of to of of we as of we of . by of 2of by we 9 in of 4 in of 4 of in 6 in be We to of to - of - 目 录 第一章 引言 . 1 纤维分化起始的时间及空间顺序 . 1 维分化起始的超显微结构分析 . 2 素对棉纤维分化的影响 . 3 纤维起始分化的分子生物学研究进展 . 4 维起始分化途径 . 4 录因子在棉纤维分化起始中的作用 . 6 与棉纤维起始分化的特异表达基因 . 7 花起始分化期高丰度转录产物 . 8 纤维分化起始研究展望 . 10 物蛋白质组学的研究进展 . 10 白质组学研究的历史和背景 . 10 白质组学在植物遗传和育种研究中的应用 . 11 研究的目的和意义 . 13 第二章 棉花胚珠蛋白三氯乙酸丙酮法与饱和酚提取法 的比较分析 . 14 料与方法 . 14 验材料 . 14 白质的提取 . 14 白的定量分析 . 14 果与分析 . 15 白产量、浓度及纯度的比较 . 15 胶电泳分析 . 17 维电泳分析 . 17 结与讨论 . 18 第三章 棉纤维发育突变体的蛋白质含量变化测定及 胶电泳图谱分析 . 20 料与方法 . 20 验材料 . 20 蛋白的提取 . 21 花种子水溶性蛋白的提取 . 21 胶电泳 . 21 染 . 22 果与分析 . 23 纤维发育过程中蛋白质含量的变化 . 23 胶电泳表达图谱分析 . 24 结与讨论 . 26 第四章 亚洲棉纤维突变体表型分析及短纤维起始时间 的确定 . 28 料与方法 . 28 试材料 . 28 - V - 验方法 . 28 果与分析 . 30 间表型观察 . 30 维品质测定 . 31 珠形态学观察 . 31 结与讨论 . 34 第五章 棉纤维突变体胚珠全蛋白的提取及双向电泳分 析 . 35 验方法及步骤 . 35 花胚珠全蛋白的提取(饱和酚法) . 35 向电泳 . 37 胶的固定、染色以及图像采集 . 38 果 与分析 . 39 D 图谱的制备 . 39 胶的匹配 . 41 白凝胶图谱的评估 . 42 异蛋白的比对结果 . 48 结与讨论 . 54 第六章 全文结论 . 56 参考文献 . 59 附表一:差异蛋白点的 % . 64 致谢 . 66 作者简介 . 67 - 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 开 花 后天数 OD 吸收值 生型 突变体 氯乙酸 ,4硫苏糖醇 丙烯酰胺凝胶电泳 二烷基硫酸钠 A 烯酰胺 B N,叉丙烯酰胺 羟甲基氨基甲烷 , N, N, N甲基乙二胺 2二维电泳 血清白蛋白 聚乙烯吡咯烷酮 代十六烷基三甲胺 氧核糖三磷酸 聚合酶链式反应 达序列标签 守结构域 单重复序列 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 - 1 - 第一章 引言 棉花纤维是第一大天然纤维作物 , 世界上最重要的纺织原料之一,具有重要的经济价值。棉纤维是由胚珠表皮细胞发育而成的 , 经历 了 四个重叠的发育阶段:起始分化期 、伸长或初生壁合成期、次生壁形成期和脱水成熟期 。一般来讲,胚珠表皮细胞有两次起始高峰,第一次在开花当天,起始分化的表皮细胞形成了经济价值较高的长绒;第二次出现在开花后4 6天,形成了贴着种皮的短绒(图 每 一根棉纤维由单一细胞形成 , 无细胞分裂且纤维素含量高 , 这使得棉花纤维成为研究植物细胞分化、伸长以及细胞壁合成的理想材料。 同时棉纤维分化、发育的过程也是其产量和品质的形成过程。胚珠表皮细胞分化直接决定着单位种子上着生的纤维数目,进而影响衣指、衣分和产量;纤维细胞分化的时间则影响着纤维长度 、 整齐度和短 绒率。因此分离、鉴定具有纤维细胞专一性且受发育程序调控表达的基因,将有助于我们通过遗传工程途径人为控制棉纤维生长发育,并提高棉纤维产量和品质具有重要的理论意义。本文对近年来棉花纤维分化起始的研究进展进行了综述与讨论。 纤维分化起始的时间及空间顺序 左:长绒的起始 ( 扫描电镜照片 ) 右:短绒的起始(石蜡切片图片) 图 长绒与短绒的起始 of 维细胞开始分化的时间通常 难以确定,因为在细胞形态上发生变化之前,细胞内部已经发生一系列生理生化变化。 根据杨佑明等( 1999)的观察,开花前 5 天( 胚珠表面出现光滑的、半圆球形突起的纤维原始细胞 , 因而认为在 有纤维细胞发育达到起始期。为什么开花前已经起始的纤维细胞不立即伸长, 这种现象定义为时间窗,即已分化的纤维原细胞进入了一种定时状态,也就是具备了发育形成纤维的能力,但其进一步的发育需要适当的刺激 , 在整株的条件下,这种刺激显然与开花有关。 第一章 引言 - 2 - 和 出短绒将在 4 生,也有人认为短绒发生在 5 10间。 徐楚年等( 1987)认为,纤维突起首先出现在珠柄的脊突处,而 3 至 4 天后才在珠孔端出现突起。因此,珠柄上部的脊突纤维最长、最密,而合点端和中部的纤维较短、较稀,愈近珠孔纤维愈短、愈稀,珠孔附近直到开花后数天还未见有纤维突起。这些结果表明胚珠上纤维细胞的起始在纵向上表现出一定的顺序。至于起始的纤维细胞在胚珠的横向上则呈随机分布。 (1975)推测在珠孔区可能含有纤维分化和伸长的抑制物质;另一种推测是在珠柄上产生一种激素,促进了纤维的伸长并且这种刺 激可以沿着表皮细胞的极线移向珠孔端。柏长青( 1992)和张天真( 1992)则认为这种纤维发育顺序可能是内源激素分布不均或胚珠表面细胞对激素的敏感性不同造成的。杨佑明等则认为刺激纤维细胞突起的物质不是胚珠内部产生的,而是来自其他部位,起始的纤维细胞集中分布的部位可能接近刺激物质向胚珠运输的通道或卸载位点。 维分化起始的超显微结构分析 1976)观察了开花前 16 天到开花当天胚珠的亚显微结构 。 开花前 24小时,表皮细胞产生大量小液泡,其中充满电子密集的酚类物质,主要为邻苯二酚。开 花前16 小时,表皮的柱状细胞分为明暗两类不同的表皮细胞,暗细胞是由液泡向细胞质中释放前期所累积的电子致密酚类物质所致,使其粘于各种细胞器膜的表面,从而造成整个细胞的黑暗。 为,暗类型的表皮细胞可能是正在分化的纤维原始细胞。这类细胞的酚类物质从液泡中外渗,与胞内蛋白质相互作用,进而抑制了吲哚乙酸氧化酶的活性,使细胞内的 含量提高到足以刺激纤维细胞的分化。但 1986)发表的另一篇试验论文对 利用高密度电子的泄漏区分表皮发生起始的细胞与不起始的细胞是否具有一般性提出了质 疑。 发表 )发现酚类物质的泄漏仅仅偶尔出现,并且与表皮细胞的分化类型没有相关性。 纤维分化过程发生了细胞核、细胞质及细胞器内一系列物质的变化。核仁是细胞内最显著的部分,主要含有 蛋白质以及许多酶类(如碱性磷酸化酶,核苷酸酶,6主要功能是合成核糖体 组装核糖体大亚基以及控制 核进入细胞质(如 ),这关系到纤维伸长时需要新合成的蛋白质(杜雄明 等 , 2000)。 胚珠在受精之前,表皮细胞的 分化起始 已经决定,但经正常受精后的 第三日,纤维伸长明显加快,受精对于核仁物质的增加和纤维发生是一种刺激,未受精的胚珠纤维发生推迟,细胞核仁变小。 分化前,少数表皮细胞内有非常明显的大核仁,非纤维细胞尽管核稍有增大,但核仁都较小( , 1984)。而且纤维原始细胞内出现许多网状或环状的粗糙内质网,液泡附近内质网还有高尔基体,它们的分泌泡均与液泡膜融合。高尔基体复合物的数量显著的增加,可能是参与细胞壁多糖的合成以及液泡的形成。胞间连丝则分布在细胞侧壁,基部胞壁加厚,胞间连丝消失 (杨子荣, 1991;徐楚年, 1995)。总之 ,纤维原始细胞分化、突起过程中,出现了细胞特化以及物质合成和能量代谢旺盛的标志。 短绒的分化和伸长时间随棉种或品种的不同而变化,短绒细胞细胞壁相对较薄,液泡内中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 - 3 - 积累有色素物质,变得较暗;而长纤维细胞具有厚的细胞壁,内有一圈细胞质和一个大的中央液泡,液泡内不存在色素物质,变得更加透明。干燥时长纤维变得扁平,中央液泡消失;而短绒纤维则保留着一个深颜色的中央核心。短绒成熟脱水后,由于其纤维基部壁厚,次生细胞壁与相邻的无纤维细胞紧密结合插入表皮细胞层内较深,牢固附着在种子上,轧花时不易被轧掉。短绒的细胞中核仁始终很小 ,而核仁的大小又是核糖体合成增强的标志,具有小核仁和高度过早液泡化可能是产生短绒的原因之一。 1995) 采用速冻固定 电子显微镜对棉纤维进行微细结构的研究,首次直接提供了棉纤维细胞扩散生长的细胞形态学和生化证据。 素对棉纤维分化的影响 温度、激素、基因型等因素都直接影响棉纤维分化。基因型与纤维分化和发育有密切关系,纤维细胞突起时 间 在品种间有很大差异,铃期越短则纤维分化越早。基 因 型不仅影响着棉纤维的分化和发育进展,而且还影响着棉纤维分化的数目。棉花原产于亚 热带温度是制约棉纤维分化的主要因素,低温会对纤维分化和发育产生不利影响。 一种化学复合物 995)。棉纤维的起始依赖于多聚腺嘌呤 1996)从开花当天到 2以抑制纤维的起始。这里重点阐述激素对棉纤维分化的影响。 植物生长调节物质明显改变生殖发育起始时间,也影响细胞的分裂与伸长。激素对棉花胚珠和纤维有很大的影响,基因型决定纤维的表达,而具体的发育过程则是由激素、环境等因素共同 决定的。激素对纤维发育的影响主要从两个方面进行研究,一是从棉铃或胚珠中分离和鉴定内源激素 ; 另一方面则是施用外源激素(外源激素处理完整植株或用于胚珠与器官的离体培养),观察表型的变化。 现已证明,赤霉素( 生长素( 973,989)是纤维分化的重要因子 。 在没有激素的情况下,受精胚珠培养 1后,也能产生纤维,但如果在培养基中加入 纤维量增加。人们对开花当天或开花前 1未受精胚珠进行离体培养,在含 培养基中胚珠可以产生纤维,而开花前 1 天的未受精胚珠在含有 成抑制剂的培养基中,即使加入 不会产生纤维( 1995)。因此 刺激纤维的分化,但它对纤维伸长的刺激不如生长素。生长素单独使用很少能够促进纤维分化,但却有效的促进纤维伸长。 1973)认为 够促成核仁物质的合成并抑制核仁的液泡化,生长素 能促进核仁的增大,但在高浓度时则失去促进作用,而且 纤维的起始有加性作用。 脱落酸( 抵消 作用,很可能是抑制了核仁物 质合成。激动素对纤维的伸长没有多大影响,但能克服 于 1976)提出一种解释,认为 起的抑制作用是由于苹果酸代谢受到干扰,他们还证明 棉花未受精胚珠苹果酸合成酶的活性提高。显然, 通过抵消 作用来抑制酶活性的增加。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 - 4 - 油菜素( 认为是参与细胞伸长的重要激素,在体外利用 理棉花胚珠,能促进纤维的伸长,而用 种抑制 内合成的化合物 )处理棉胚珠,则会抑制纤维的起始。 ( 2005)推断 纤维起始和伸长 过程中都是必需的,不过这些激素调控棉纤维分化与伸长的内在机制仍然是未知的。 乙烯( 为一种重要的植物激素,在棉纤维初级细胞壁的合成以及快速伸长过程中所起的作用已经被肯定,但对纤维起始发生 的 贡献还没有足够的证据。 表 能参与激素合成及信号转导通路的基因 he of R A3 O AA d BA TH 胞分裂素( 棉花胚珠中是很丰富的,并且在开花后突变体中的含量非常高。( 1997)利用 较了 棉纤维突变体胚珠中 +8K 的含量变化发现 ,高浓度的 以降低 棉纤维发育的影响。而低浓度的 可以恢复 抑制作用。 同时在 , 胚珠中的 量要显著高于突变体中的含量。因此 能具有双重的功能,它在开花前是纤维起始的一个信号 ,起始后则对纤维的发育负调节。目前还不能确定,为什么纤维分化突变体胚珠 中会积累但已经知道细胞内是通过降低 化酶介导的降解,提高 水平从而降低了 愈创内酯衍生 I 类 (以 促进纤维的分化。 (1995)在亚洲棉胚珠培养中加入并观察了它对一些酶活性的影响。结果表明,加入 开花前 1 日胚珠的 化酶活性降低,但在伸长阶段 (花后 15 日 )增加,次生壁增厚阶段也增加。然而,联苯酚氧化酶活性在纤维分化和伸长阶段则相反。这说明 通过调节联苯酚和 化酶水平来促进纤维分化和伸长。 纤维起始分化 的 分子生物学研究 进展 维起始分化途径 目前,对棉纤维细胞起始分化的分子机理知之甚少,纤维细胞的起始是在特定的信号刺中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 - 5 - 激下迅速发生的,

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