【毕业学位论文】（Word原稿）五指山猪近交系EG细胞建系影响因素研究动物遗传育种与繁殖硕士论文

I 密级 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 五指山猪近交系 胞建系影响因素研究 on on 文 摘 要 本实验以五指山小型猪（ 交系为实验材料，先后由 18 头妊娠母猪采集了 200 枚早期胎儿，分别从不同饲养层、条件培养基、是否添加生长因子、传代过程中所用消化液等方面对其 胞的建系影响因素进行了研究；并对传代获得的 胞集落进行了鉴定。 （ 1）从 26 28d 的新鲜猪胎儿可以获得大量的 猪胎儿成纤维细胞（ 经传代培养后即可纯化。实验过程中， 至 10 代以上，可以在体外长期培养并可冷冻保存。本实验对 的 行了核型分析，结果表明其在体外培养核型正常。 （ 2）采集 儿 53 枚，其中 33 枚以经丝裂霉素 C 处理的 胞作为饲养层；其余 20 枚采用未经丝裂霉素 C 处理的 胞共培养的方式进行培养。在使用同种培养基的条件下，比较不同饲养层对猪的 胞分离培养与传代的影响。结果表明， 胞适合用作猪 胞分离培养、传代的饲养层；而采用 胞 共培养的方式只适于原代分离培养，传代后，仍需以 胞制备饲养层才能维持 胞的未分化状态， G 细胞的传代培养。 （ 3）采集 儿 35 枚，其中的 15 枚用 件培养基 进行培养 ；其余 20枚以高糖 15%必需氨基酸 +巯基乙醇 +100IU/霉素 +100 g/霉素 常规培养基进行培养，研究 件培养基对猪 果表明，以 胞作饲养层 ，使用 件培养基与常规培养基在猪 胞分离培养、传代后均可获得细胞集落，而且使用 件培养基培养产生的集落数多，细胞生长速度快。因此， 件培养基适于猪 胞的培养传代。 （ 4）采集 儿 78 枚，其中的 43 枚用常规培养基（培养基）进行培养；剩余 35 枚在添加 种生长因子的培养基（培养基）中进行培养。研究不添加生长因子对猪的 胞分离培养与传代的影响。实验结果表明，以 胞作为饲养层，在两种培养基中都能得到可以传代的 胞集落。但在培养基 中原代 落出现时间晚，生长速度较慢，传代时间间隔长， 胞形态扁平；而在培养基中原代 落很快出现，生长速度较快，传代间隔短。两种培养条件下获得的 胞都具有胚胎干细胞的形态和特征。结果提示，以 胞作为饲养层，不添加生长因子的培养基也可以维持 胞的培养、传代。 （ 5）采集 儿 34 枚，分离胎儿 胞为饲养层，以常规培养基进行培养。在 胞传代过程中，分别用 其进行消化传代，比较两种消化液对传代的影响 。 结果表明， 用两种消化液消化传代都能够获得新的可传代的胞集落。因此，两种消化液均可用于 胞的传代培养。 （ 6） 对培养 获得的 3 4 代的细胞集落进行鉴定，结果表明分离培养的 胞形态多样，集落内细胞排列紧密，集落边缘清晰， 色呈强阳性， 疫荧光染色为阳性， 外悬浮培养可以形成简单类胚体，具有胚胎干细胞的诸多特征。 关键词 ：猪，原始生殖细胞，胚胎生殖细胞（ 胞） 00 8 to on of EG (1) 6 28d be by 10, it EF be in 196 . EF 5 by (2) To of on G in 53 33 of TO 0 TO EF 0, EF of G TO (3) To of on G in 35 15 of 0 in 5%EM - 100IU/00 g/ G TO be to G (4) To of on G in 78 35 of in ) 3 in ). be G TO G be in (5) To of on G 34 TO On by G be at It be to G (6) 3 G of in in in of as So it G G 录 文 献 综 述 . 1 一、胚胎干细胞的生物学特性 . 1 二、国内外研究现状 . 2 三、胚胎干细胞建系的技术路线 . 6 四、胚胎干细胞的应用价值与前景 . 12 五、本论文的研究意义 . 15 实验一 不同饲养层对猪 胞分离培养与传代的影响 . 16 实验材料 . 16 实验方法 . 18 结果与讨论 . 20 实验二 条件培养基对猪 胞培养传代的影响 . 23 实验材料 . 23 实验方法 . 23 结果与讨论 . 24 实验三 无生长因子对猪 胞培养、传代的影响 . 26 实验 材料 . 26 实验方法 . 26 结果与讨论 . 27 实验四 不同消化液对猪 胞传代的影响 . 30 实验材料 . 30 实验方法 . 30 结果与讨论 . 31 实验五 胞的鉴定 . 33 实验材料 . 33 实验方法 . 33 结果与讨论 . 34 结 论 . 37 附 图 . 38 参考文献 . 41 致 谢 . 48 作者简历 . 50 表清单 表 1 不同饲养层条件下 胞的培养情况 21 表 2 不同培养基条件下 胞的培养情况 24 表 3 无生长因子对 胞生长的影响 27 表 4 不同消化液对 胞进行传代的情况 31 图 1胞 38 图 1纯化后的 38 图 1 38 图 1培养在 养层上 的 胞集落（ 8d） 38 图 1与 培养的 胞传至 养层上形成新的集落（ 6d） 38 图 1与 培养的 胞传代后发生分化 39 图 2用 件培养基培养传代获得的 胞集落（ 7d） 39 图 3无生长因子培养基培养获得的 胞集落（原代 7d） 39 图 3添加生长因子培养基培养传代后的 胞集落 （ 6d） 39 图 4用 化传代后形成的集落（ 4d） 39 图 4用 化传代后产生的 落（ 3d） 39 图 5莲花状 胞集落（ 10d） 40 图 5树枝状的 胞集落（ 11d） 40 图 5色为阳性的 胞集落 40 图 5表达 性的 胞集落 40 图 5疫荧光染色为阳性的集落 40 图 5胞分化为上皮细胞和成纤维样细胞 40 略语表 性磷酸酶 性成纤维细胞生长因子 鼠肝细胞 CM 件培养基 d 交配后日龄 化抑制因子 s 氏培养液 甲基亚砜 鼠交配后日龄 EB 胚体 EG 胎生殖细胞 ES 胎干细胞 牛血清 纤维细胞生长因子 源动物胎儿成纤维细胞 细胞团 血病抑制因子 鼠胚胎成纤维细胞 生牛血清 s 氏磷酸缓冲液 猪胎儿成纤维细胞 始生殖细胞 代小鼠胎儿成纤维细胞 细胞因子 段特异性胚胎表面抗原 鼠胚胎成纤维细胞系 指山猪 中国农业科学院硕士学位论文 文献综述 1 文 献 综 述 胚胎干细胞 (者 ES 由动物早 期胚胎的内细胞团 (胎儿的原始生殖细胞 (体外分离培养而获得的一种具有发育全能性或多能性的细胞。 根据其来源分为胚胎干细胞 (胞 )和胚胎生殖细胞（ 胞）。 胞是从早期胚胎内细胞团 (离培养出来的具有发育全能性或多能性的干细胞，而 胞是从胎儿原始生殖细胞 (离培养出来的具有发育全能性或多能性的干细胞， 一般将二者统称为胚胎干细胞。 一、胚胎干 细胞 的生物学特性 1、 胚胎干细胞具有与早期胚胎相似的形态特征 ， 即胞体小、核大、胞浆少， 有一至二个核仁 ；且具有正常的二倍体核型。 2、 胚胎干 细胞 具有 高度的发育潜能和分化潜能 (全能性或多能性 )。 全能性 (指 胚胎干 细胞在解除分化抑制的条件下具有发育为包括生殖腺在内的构成机体的各种组织和细胞的潜力，即 胚胎干 细胞能发育成完整动物个体的能力；多能性 (则是指 胚胎干 细胞具有发育为多种组织的能力 ， 参与部分组织的形成（ et 1997）。 胚胎干 细胞在体外可被诱导分化为包括 内、中、外 三个胚层的所有细胞；若将 胚胎干 细胞注射到 分化产生出由三个胚层细胞组织构成的畸胎瘤。 3、胚胎干 细胞 可以在体外 无限扩增。在不同的生长条件下， 胚胎干 细胞具有不同的功能状态。在体外适宜条件下，如 在饲养层上或含有分化抑制因子的培养基中， 胚胎干 细胞 可以稳定传代，长期培养， 保持高度未分化状态和发育潜能性。这为胚胎干细胞研究和应用提供了无限的细胞来源（ O1999）。 4、 胚胎干 细胞 具有生殖系 嵌合能力和 种系传递功能。若把胚胎干细胞注射到受体胚胎 内 ，混合后再 植入假 孕母体子宫， 胚胎干细胞可广泛参与宿主胚胎各组织器官的生长发育， 获得包括生殖系在内的嵌合体后代 ， 其遗传特性可进入种系并遗传给下一代， 称之为种系传递 ( et 1984） 。 5、 胚胎干 细胞具有可操作性。在体外，可以对 胚胎干 细胞进行遗传操作选择，如导入异源基因、报告基因或标志基因， 或者利用同源重组的方法插入 (或删去 ) 某个 特定基因 ， 诱导基因突变，基因打靶或导入额外的原有基因使之过度表达 （ 增加功能）等。理论上， 胚胎干 细胞经遗传操作选择后一般仍能保持其 扩增和发育的全能性或者多能性，因此可以通过遗传操作选择 生产 转基因动物或基因有缺失、突变或过量表达的杂合或纯合个体进行各种基因功能的分析（ 1986）。 6、胚胎干 细胞 具有 体外 培养细胞所有的特征 ，可以在体外培养扩增，还可以对其进行遗传操作选择和 冻存等 而不失去 其多 潜能性 。 冻存的细胞可以随时解冻，继续培养而不失其原有特性。 中国农业科学院硕士学位论文 文献综述 2 二、国内外研究现状 （一）国外 1981年，英国剑桥大学的 功地建立了小鼠 试验结 果表明，小鼠 1%，其生殖系嵌合率为 20% （ et 1981）。同年，美国加州大学旧金山分校的 样得到了小鼠 1981）。 小鼠的 体系已基本成熟完善。小鼠 其它动物及人类胚胎干细胞的分离培养开辟了道路， 从此进入了胚胎干细胞研究的新纪元。 此后，人们分别建立了 仓鼠、猪 、牛、绵羊、山羊、兔、水貂、鸡、鱼、 灵长类等多种动物以及人类的 胞或类 胞系。 但 迄今为止， 除小鼠 外，其他动物所分离的 胞都未能证实具有生殖系嵌合能力。 1、小鼠 自 1981年小鼠的 多实验室致力于 们通过不同途径分别建立了 1983年， 不同品系和孤雌生殖的小鼠胚胎及具有不同遗传背景的胚胎建立了各种 et 1983）。1984年， S)、对硫代鸟嘌呤 (T)和乌本苷 (O)有抗性的成纤维细胞系 饲养层上，获得了984）。 同年， 饲养层培养 建立了 et 1984）。 1987年， 取代饲养层细胞维持已成系的小鼠 小鼠上建立了非饲养层培养系统（ et 1987） 。 1988年， 1988）。 1990年， et 1990） 和 et 1990） 分别在无饲养层条件下，向培养基中添加 外， 993) 和 1997)分别用免疫磁珠法从混合细胞中分离小鼠 高了 后，还有许多实验室陆续报道建立了小鼠的 2、猪 胞研究概况： 1990 年， 离得到猪的类 胞系，但所得到的类 胞没有进一步分化的能力（ 1990b） 。同年， 1990）、 1990） 、 1990） 也分别报道成功地建立了猪 类 胞系。 为，在初次分离培养时，饲养层中加入猪子宫成纤维细胞，能够促进胚胎贴壁和细胞克隆的形成。因为猪子宫成纤维细胞与囊胚之间存在内分泌协同关系。 1994 年， 得了能参与嵌合体形成的猪类 胞系，但未证明能否参与生殖系嵌合（ 1994）。 1998 年， 培养机械分离的 6 7d 的 立了猪的 胞系，并产生转基因嵌合体猪（ et 1998）。 3、牛 1992年， 离出 传至 4代后丢失（ 1992）。 加有硒、胰岛素、转铁蛋白和 5% 文献综述 3 的培养液，共得 15个细胞系。将此 得类胚体。用这种细胞核移植到去核卵母细胞中体外培养至囊胚，再移植到假孕牛子宫内，最后得到 4头牛犊（ 1993）。 1994年， 立了牛的类 et 1994）。 1997年， 过分离培养 7利用转基因技术得到了生殖系嵌合牛（ 1997）。 1998年， 立了牛的类 et 1998） 。 2001年， 传至 150代（ et 2001）。 4、羊 胞研究概况： 1987 年 ， 用绵羊皮肤成纤维细胞和羊胚胎成纤维细胞作饲养层，对 7 日龄和 8 日龄绵羊囊胚进行 胞分离培养，只培养出了内胚层样细胞，而无 et 1987）。 绵羊 胞进行分离培养，结果只得到上皮样细胞（ et 1990b）。 1991 年， 分离克隆出了绵羊的 胞（ et 1991）。 1994 年， 人从绵羊中分离获得生长缓慢，能传至四代的类 胞集落（ et 1994）。 1996 年 ， 别 建立了绵羊和 山羊 的类 胞系（ 1996）。同 年 ， 建立了绵羊的类 胞系， 进行核移植得到 4只羔羊（ et 1996）。 5、灵长类动物 胞研究概况 ： 1995 年， 人以小鼠胚胎成纤维细胞 （ 饲养层，从恒河猴囊胚获得第一个灵长类的 胞系。 对该胚胎干细胞培养传代一年后，依然保持未分化状态，核型正常 (且具有 胞所有的特征（ et 1995）。 1996 年，建立了 8 个狨猴的 胞系，其中两株在体外培养超过一年，仍维持正常的二倍体核型和未分化状态（ et 1996） 。 2002 年， 利用恒河猴的卵母细胞孤雌激活后发育形成的胚胎建立了胚胎干细胞系（ et 2002）。 6、人 1984年， et 1984）和 et 1984）两个小组分别报道从人的畸胎瘤获得了可在体外分化为神经及其它细胞类型的克隆细胞系 。 1989年， 步表明人类胚胎干细胞建系的可行性（ et 1989）。 1994年， 分离获得了可增殖传代的类 并 传至二代（ et 1994）。 1998年 ， 美国 用 体外受精 (术收集 发育至囊胚期的人胚 成功地分离 获 得 了 人类 其中 一 株传 32代 ， 具有正常的核型， 保持多潜能未分化状态， 并能成功地被冷冻和解冻（ et 1998） 。 2000年，澳大利亚 新加坡大学的 且在体外分化实验中成功地得到了神经祖细胞（ et 2000）。 同年， 体外培养获得 et 2000）。 7、其他动物 993)， 994)， 996)分别 建立了兔的类 胞系。 人于 1992 年从水貂囊胚中分离出类 胞系（ et 1992）， 1993 年又利用桑椹胚建立了水貂的 胞系（ et 1993）。 1988)， 990a)建立了仓鼠的 1996年， 次建立鸡的胚胎干细胞系，并获得嵌合体鸡 （ et 1996） 。 2000年， 文献综述 4 等也 建立了鸡的 et 2000） 。 1993）， 1996） 建立了青鳉鱼的 （二）国外 胞研究概况 起源、迁移及增殖 目前， 有证据表明 由后肠胚层和尿囊基部向胚内迁移，最终经背肠系膜分两部分到达左、右两侧生殖嵴。 用碱性磷酸酶 ( 记 且在 此可很容易地和它周围的 此，可以用 小鼠为例， 天 (7 7原肠中期），此时 个体积较大的 于胚外中胚层 ；0 50个 位于原条的末端近尿囊蒂处 ； 8肠胚形成后期 )在后肠内胚层和尿囊基部，出现不足 100个 后肠开口的边缘并与之结合， 大约有 150个 ； 部分细胞埋藏于后肠中 (通常在中胚层 )； 部分 12 13雄性 )或减数分裂期 (雌性 )。此时， 形态上亦不同于迁移的细胞，细胞表面 特性发生了明显改变。而没有到达生殖嵴的 入周围其它器官， 如肾上腺和肾（ 997） 。 一般认为在后肠形成以前， 移主要是通过形态改变而被动进行的；从后肠到生殖嵴则是一个主动迁移的过程 。大部分 约 6 。 以小鼠为例， 00个（ 8加到 25000（ 个。迁移中的 性的伪足 ，大量的 有极性的细胞质， 旦到达生殖嵴，它们就呈卵圆形。在所有的脊椎动物和很多非脊椎动物中， 值得一提的是禽类的 在哺乳动物 在 系列细胞外信号在不同的时间和不同的空间表达，并一起参与了 及到一系列不同功能分子的联合作用来共同完成，其中包括胞外基质（ 、细胞因子 （ ）、生殖嵴的趋化作用、生殖细胞间及生殖细胞与体细胞间的相互作用。 （ 1）趋化性：在胚胎发育过程中，生殖嵴释放某种趋化物质吸引 鼠胚胎生殖嵴的细胞产生一种可扩散的转移生长因子 ，而 的 受体，故可沿该生长因子的浓度梯度进行迁移。另一种趋化因子是 )，通过 的趋化作用可调控 巢”。 中国农业科学院硕士学位论文 文献综述 5 （ 2）接触引导作用：在迁移过程中，周围的细胞和基质影响 连蛋白和纤连蛋白引导 （ 3） 10.5 背系膜还未完全形成时即开始从后肠迁移，几乎是直接从后肠进入背正中线，然后进入发育中的生殖嵴，这表明 光鹏等， 1998； 李臻等， 1999； 傅文玉等， 2001）。 1、小鼠 早在 70年代 ， et 1973） 和 1977） 分别对小鼠 1982年， et 1982） 。 直到 1992年， et 1992）和 et 1992）体外长期培养小鼠 立了小鼠胚胎生殖细胞（ 系 ，并 发现在适宜培养条件下， 其形态、生长行为和发育潜能与 次证实 作 胚胎干 细胞建系的材料， 从此揭开了用哺乳动物 培养胚胎干细胞的序幕。 1994年，明 形成的两种性别的生殖系嵌合体，都能产生功能性配子而生出后代（ et 1994）。 57杂 交鼠胚胎分离到多个 et 1994） 。 2003年， 无血清培养系统建立了小鼠 et 2003）。 2、 猪 1997年， 4 25并获得嵌合体猪（ et 1997） 。 1998年， 25 27儿分离到 培养在 建立了 获得的 后用转基因的 到了转基因嵌合体猪（ et 1998）。 1999年， 5 28立了 et 1999）。 2000年， et 2000）。 3、人 1998年， 美国 霍普金斯大学的 9周胎儿生殖嵴和肠系膜为材料，以 细胞系具有正常的核型，表达高水平的端粒酶活性和灵长类 分化发育为含内、中、外三个胚层的组织（ 1998）。同年， 从 5 9周龄胎儿生殖嵴和肠系膜中分离 et 1998）。 4、其他动物 胞研究概况： 1990年， 分离到牛、猪、兔的 et 1990）。 1994）， 1994）， 1998） 采集牛 1998）， 2000） 建立了山羊的 1998） 建立了兔的 1994）建立了大鼠的 1999） 分离 系。 中国农业科学院硕士学位论文 文