【毕业学位论文】（Word原稿）我国蚕豆根瘤菌的多相分类与系统发育研究微 生 物 学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 我国蚕豆根瘤菌的多相分类与系统发育研究 .） .） I 摘 要 本文采用数值分类、 16S 16S 序列测定分析、交叉结瘤和抗逆研究等实验技术，首次系统地对我国不同生态条件下蚕豆根瘤菌的遗传多样性和系统发育进行了研究。 从我国山西、四川、青海等 11 个省 24 个地区，进行蚕豆根瘤的采集。经过分离、纯化、回接确定了 73 株蚕豆根瘤菌代表菌株。采用 术对这 73 株蚕豆根瘤菌进行了多样性研究，同时和 14 株参比菌株进行了比较，其指纹图谱分析聚类后，供试的蚕豆根瘤菌在 70%的相似水平上分成 18 个群和 5 个独立分支；在此基础上选择 50 株供试菌株及 11 株参比菌株进行了138 项生理生化特性测定。去除全同性状后聚类结果表明：在 81%的相似水平上供试菌株分为 4个群，除群 2 含有参比菌外，其他 3 个群均由蚕豆根瘤菌组成，且各群都存在地区交叉；基于表型特征的测定结果，选取 25 株蚕豆 根瘤菌代表菌株与 11 株参比菌株进行了 16S 验菌株在 85%相似水平上聚成 4 个聚类群，聚类结果与数值分类的聚类结果有很好的一致性； 析结果表明，供试菌株在 70%水平上分成 6 个遗传群， 与 16S 映的多样性更明显，形成的遗传群较多， 可用于菌株的鉴别；测定了数值分类 3 个群的中心菌株 另外两个代表菌株 16S 全序列，与 15 株 已知菌的基因序列比对分析， 5 株蚕豆根瘤菌的序列与参比菌株 相似性达 可确认这些试验菌株蚕豆根瘤菌属于 豌豆生物型；选择 19 株蚕豆根瘤菌和 5 株参比菌株进行了抗逆性实验，发现分离自广西的菌株 在 3%平板上生长，在 条件下亦能生长，但长势相对较弱，其它菌株也表现出不同程度的耐受性。另外分离自山西的菌株普遍表现出耐低温的特性；选取代表菌株 六种豆科植物进行交叉结瘤试验，试验结果表明 蚕豆根瘤菌的宿主专一性较强，除与蚕豆自身结瘤外，只与豌豆结瘤，与菜豆形成白色的无效瘤。 关键词： 蚕豆根瘤菌 数值分类 遗传多样性 系统发育 4 1 by 16S 16S 3 8 at 0%; on 1 by 38 0 at 1% 5 as of 1 6S 5 at 5% in of 5 1 66S 6S of to of or to .) 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 录 第一章 文 献 综 述 . 1 言 . 1 根瘤菌分类历史的追溯 . 1 期的根瘤菌分类系统及分类地位 . 2 瘤菌多样性研究方法及进展 . 3 型多样性的研究 . 4 关遗传学的方法 . 6 瘤菌的最新分类系统 . 10 瘤菌多样性研究展望 . 15 实验研究背景 . 15 样地概况 . 15 豆概述及蚕豆根瘤菌研究近况 . 16 研究的目的和意义 . 17 第二章 实验材料和方法 . 18 试蚕豆根瘤菌的分离、纯化和确认 . 18 . 20 豆根瘤菌 快速提取及模板制备 . 20 . 22 值分类 . 22 状测定 . 22 据处理 . 26 6S . 27 . 28 6S 因 全序列测定及系统发育学分析 . 29 株交叉结瘤实验 . 30 豆根瘤菌抗逆性研究 . 30 第三章 实验结果及分析 . 31 果与分析 . 31 值分类结果与分析 . 33 类结果 . 33 心菌株的确定 . 34 别特征的选择 . 35 值分类各独立表观群的基本特征描述 . 37 结 . 37 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 6S 果与分析 . 38 6S 果及分析 . 38 析结果 . 40 6S 因 全序列系统发育学分析 . 43 叉结瘤实验 . 45 豆根瘤菌抗逆性实验结果 . 46 第四章 结论与讨论 . 48 论 . 48 论 . 49 态环境与根瘤菌生物多样性的关系 . 49 瘤 菌生物多样性与系统发育的关系 . 49 参考文献 . 50 致谢 . 60 附录 . 62 个人简介 . 79 缩略词表 . 80 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪 论 言 氮素是植物生长最重要的营养元素之一，是生物生存之必需。土壤中氮素的来源主要包括施用化学氮肥和土壤微生物的生物固氮作用，由于化学氮肥的高能耗和长期使用带来的经济 和环境压力，农业生产中化肥的施用始终是全球关注的焦点。据估计，全球每年生物固氮量达 世界工业氮肥产量的 （林稚兰等， 2000 ）。根瘤菌（ 一类广泛分布于土壤中的革兰氏阴性细菌，通过与豆科植物共生，引起豆科植物根部或茎部结瘤，将空气中的 化为植物可吸收利用的 而为豆科植物提供氮素营养，培肥地力，增加植物产量。根瘤菌与豆科植物共生固氮体系是已知固氮能力最强的生物固氮体系之一，每年固氮量占全球生物固氮量的 65%以上。据测定，一年生豆科植物如大豆、菜豆等的固氮量 约为 50 1002/ha/y，多年生豆科植物如三叶草、苜蓿等的固氮量可达 100 150 2/ha/y。豆科植物与根瘤菌共生体系具有固氮能力强、固氮量大、抗逆能力强的优点，可以提高土壤肥力和为人畜提供高蛋白质营养（陈文新， 2004）。因此研究根瘤菌与豆科植物的共生固氮作用，有利于实现农业、环境和生态的可持续利用与发展。 目前有关根瘤菌的研究主要有三个方面，一是有关根瘤菌的资源调查、保藏及分类研究；二是有关根瘤菌的固氮机理、固氮遗传及与豆科植物的共生关系方面的研究；三是根瘤菌的应用性研究。这三个 方面研究中，根瘤菌的资源调查、保藏及分类研究是所有有关根瘤菌的理论和应用研究基础。它不仅可以了解有关根瘤菌的生物多样性、发掘和保藏许多有重要应用潜力的优良菌种资源，而且可以通过利用各种研究手段搞清根瘤菌具体分类地位和系统发育学关系的同时，为完善整个微生物自然分类系统做出贡献，促使人们加深对整个生物系统的认识和理解。 近年来，对新的根瘤菌资源的不断发掘及现代分子生物学技术的发展和应用，使根瘤菌分类研究有了突破性进展。根瘤菌的新属、种不断建立，目前已经确定的根瘤菌有 48 个种，主要分布于 纲，此外在 纲也发现了根瘤菌 （ . et 2001； et 2001； et 虽然在确定根瘤菌新的种属时仍然需要做根瘤菌与不同宿主的交叉结瘤实验，但以“互接种族”为依据的传统分类已经被现代分类体系所代替。现代根瘤菌分类以系统发育（ 基础，通过对根瘤菌系统发育的研究，可以揭示根瘤菌及其相关细菌的亲源关系和自身的进化过程，从而为确定根瘤菌的系统分类地位提供科学依据。 根瘤菌分类历史的追溯 根瘤菌的发现最早源于 100 多年以前对豆科植物根瘤的发现和其作用的争论。 1838 年法国学者 据田间试验结果指出，像三叶草和豌豆这样的豆科植物与禾本科植物不同，它们可以从空气中取得氮素作为营养。 1886 年，德国学者 表研中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 2 究报告证明，栽种在灭菌盆钵中的豆科植物只有接种土壤浸提液后方能形成根瘤并可固定大气中的氮气（施莱杰， ）著， 1990）。 1888 年荷兰学者 次获得根瘤菌的纯 培养物， 1889 年波兰学者 先用根瘤菌纯培养物接种豆科植物获得成功 (俞大绂等， 1985)。 就根瘤菌的命名来看，也是几经更改。 1877 年 为，能形成根瘤的微生物是一种真菌，故将根瘤菌列为真菌属 ， 1886 年 为进入根瘤中的这些微生物与粘细菌关系更近，故定它们为一个新属 后又经过几次更改，到 1890 年 后 这个名字被广泛使用。直至 1970 年按照国际细菌命名委员会仲裁委员会第 34 条制定 意见确定了 合法名称地位（陈文新， 1988）。 期的根瘤菌分类系统及分类地位 早期对豆科植物根瘤菌共生的研究只涉及一些农业生产中少数豆科植物，对根瘤菌的分类主要依据“互接种族”。互接种族是指一个植物的分离物只与本属植物或少数其他属植物共生结瘤，即以一个根瘤菌将一些植物联系起来成为一个群（陈文新， 1988）。 然而近几十年来随着对根瘤菌 豆科植物这一共生体系的研究不断深入，“互接种族”这一概念早已名存实亡。 1932 年 人按“互接种族”提出了最早的分类系统，（见表 1 时他们列出了 22个植物属，分为 7 个互接种族，每族结瘤的菌按其优势寄主命名（ et 1932），共定出 6 个根瘤菌种，组成根瘤菌属，然后与色杆菌属和土壤杆菌属共同组成根瘤菌科。 表 11932) 根瘤菌分类系统 属 名 种 名 根瘤菌属 （ 三叶草根瘤菌（ 豌豆根瘤菌 (菜豆根瘤菌 (苜蓿根瘤菌 (大豆根瘤菌 (羽扇豆根瘤菌 (其它与豇豆族植物结瘤的根瘤菌 (后来，许多学者因研究对象范围和技术手段不同而对 类系统产生了意见分歧。 60年代以来，很多人采用不同的分类鉴定方法，积累了许多新的信息。这主要包括：数值分类、G+定、 交、血清学分析、胞外多糖成分分析、全细胞可溶性蛋白电泳分析等，尤其遗传方面的研究大大增加。 1984 年出版的伯杰氏系统细菌学手册第一卷中将根瘤菌科进行了修订，并提出了新的根瘤菌分类系统（见表 1 次提出的分类系统可以说是对根瘤菌分类工作的一个阶段性总结，它是以菌株的遗传特征和表型特征为基础进行种属划分的，同时也考虑了它们与宿主的共生关系，因此比以中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 3 前的分类系统更为合理，也更符合实际，较为客观地反映了根瘤菌间的亲缘关系。 瘤菌多样性研究方法及进展 生物多样性（ 指生物物种的多样化及其变异的深度及广度，是物种多样性、遗传多样性和生态多样性三个层次的综合表述。当今的生物多样性是地球 46 亿年生物进化的结果，是人类社会赖以生存和发展的物质基础。微生物是地球上出现最早的 生物，已有 46 亿年的生命历史（ ., 2002），而植物和动物却迟迟在大约 6 亿年前才开始出现，随着高级生命形式的出现，微生物的重要地位并没有被取代，相反，正是由于微生物多样性的存在才使得地球上的其他物种得以生存；尽管微生物的个体很微小，但其生物量却达到了地球上总生物量的50%左右。微生物的多样性是自然界生物多样性不可缺少的组分，但近年由于环境的恶化引起它们宿主的灭绝也间接的导致了某些种群的消失。目前已有 8%的真菌种群处于濒危状态，甚至一些处于特殊环境中的真菌已被其它物种所取代。因此对微生物多 样性的认识、保护是整个生物圈保护中必不可少的内容。 表 1984 年伯杰氏系统细菌学手册中根瘤菌的分类系统 科 名 属 名 种 名 生 物 型 根瘤菌科 瘤菌属 (豌豆根瘤菌 （ 野豌豆生物型 (三叶草生物型 (菜豆生物型 (苜蓿根瘤菌 (百脉根根瘤菌 (慢生根瘤菌属 (慢生大豆根瘤菌 (土壤杆菌属 (杆菌属 (瘤菌虽然极有可能具有共同的起源，但在长期进化过程中，由于受寄主的选择和环境的胁迫，分别向不同的方向进化，形成了丰富的物种多样性，通常以表型（ 遗传型（ 多样性来表达（陈文新， 1993）。 (1970)首次提出了多相分类的概念，从表型、遗传型和系统发育方面综合获取信息，多种方法相互认证、互为补充，从而比较全面地反映了生物多样性特征。因此多相分类技术被认为是现代细菌分类的重要里程碑之一，也是根瘤菌多样性研究工作中常常采用的技术手段。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 4 型多样性的研究 所谓表型是指生物所表现出的形态结构、化学组成及其生理功能等表型特征，来自于蛋白质及其功能、各种不同的化学分类指标以及大量其他的表达特征。根瘤菌表型 多样性的研究方法是指不含 析的物理化学分析技术，包含数值分类（ 全细胞可溶性蛋白电泳分析（ 多位点酶电泳分析（ 全细胞脂肪酸分析（ 清学反应类型测定（ 噬菌体反应类型（ 胞外多糖 分析等。表型分类即是根据根瘤菌表型的多样性研究来寻找菌株间的相似性。 数值分类（ 数值分类是数学上的多元方差分析理论与电子计算机结合的产物，借用计算机对表型数据进行相似性比较。其优点在于借助计算机分析，避免了人为分析的主观性，结果较为公正。聚类分析结果以相似性百分比表述，分析得出的树状图揭示了同一表观群内菌株的表型一致性，及存在于不同表观群菌株间表型性状的差异性。英国细胞学家 1957 年第一次将数值分类方法应用到细菌分类中（ 从此奠定了数值分类学在生物分类中应用的基础。自从 1964 年 次将数值分类应用到根瘤菌分类中以来，数值分类已被广泛应用于根瘤菌的表型多样性研究中，而且实践证明许多其它分群方法（包括遗传学的分群方法在内）的结果也往往与其分类聚群结果相一致（ et 1991; et 1995; . et et .2004）。 然而数值分类也存在 着不足之处，该方法需要进行多种性状的测试（通常为 100），因此比较费时费力。但由于能够定性和定量地反映供试菌的生物多样性的程度，并能提供菌株具体的表型性状鉴定特征，因此，在根瘤菌分类和多样性研究中，数值分类仍被广泛应用。 细胞可溶性蛋白电泳（ 生命的本质是蛋白质，蛋白质的种类决定生物的性状和功能。 法反映的是细菌在一定生长期内蛋白质基因表达产物的种类，关系密切的菌株在蛋白质组成上 有一定的相似性，所以该方法也是一种对大量菌株进行聚群的方法，并且在一定程度上反映了菌株之间的遗传类型。用 丙烯酰胺凝胶电泳对可溶性蛋白质的组成成分进行分析，可以得到反映生物基因组成的蛋白质图谱信息。根瘤菌的表型多样性也可以通过分析蛋白质电泳图谱的多态性反映出来。由于根瘤菌的蛋白质组成复杂，蛋白质多态性分析可以获得的信息量很大，进行比较后即可得到菌株蛋白质图谱的多样性特征。 1980）首次采用 术分析了大豆根瘤菌的全细胞可溶性蛋白多态性，发现不同血清型菌株的蛋白质带谱 存在差异。 随着凝胶扫瞄技术的建立和发展，凝胶分析软件的普遍应用， 已经发展到标准化和自动化阶段，在根瘤菌表型多样性分析中，该技术已经普遍用于揭示根瘤菌种间和种内的差异（ . et 1994；许晓东等， 1990 ； . et 2000）。 此方法局限在于它只能区分种或种以下水平的菌株，而且不能提供具体的表型性状的描述特征，也无法像数值分类那样有明确的相似性百分比标准来判断新的种群，且结果有时不太稳中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 5 定。因此在根瘤菌分类研究中，全细胞可溶性蛋白电 泳一般用于对大量未知菌进行初步分群（ . et ，并作为多相分类技术中的一项辅助手段验证其它方法的正确性。 位点酶电泳（ 多位点酶又称同工酶，是细菌许多生理代谢分枝途径中的关键酶，变异较丰富，能反映生物的不同个体、同一个体的不同组织或生长发育不同阶段的差异性。将这些酶的提取物通过电泳分离、并辅以各自特异底物显色反映，即可得出不同菌株之间同工酶基因表达产物的多态性。 自上个世 纪 80 年代以来，多位点酶电泳技术就开始广泛的应用于根瘤菌的群体多样性研究，该方法已被证明是一种对大量菌株进行初步分群的有效方法。近年来发表的几个新种 R. . et 991)、 R. . et 、 R. . et 1995) 和 M. et 1995 )均采用了 法对研究菌株进行初步分群。 对分 离自墨西哥的 126 株菜豆根瘤菌进行的 析表明，供试菌株的 获得 43 个多位点酶电泳图谱类型。 胞脂肪酸分析（ 脂肪酸是脂类和脂多糖的主要组分，主要分布于细胞膜上，已经鉴定出细菌有 300 多种不同化学结构的脂肪酸。不同属、种甚至不同的菌株之间其脂肪酸碳链的长度、双键的位置、取代基团等存在差异。目前，脂肪酸的提取、气相色谱分离以及数据处理等过程都已达到标准化和自动化，因此，在细菌分类鉴定中该技术被广泛应用。 . et 1994； . et 1996； et 1991)在研究了 123 株分属于 6 个快生型根瘤菌种的脂肪酸组成后，发现各种根瘤菌的脂肪酸组成不一致，提出脂肪酸甲基脂分析（ 鉴定根瘤菌种间差异的有效方法。 2001)研究不同血清型的大豆慢生根瘤菌时，测定了 9 个菌株的 中 5 个菌株的 成与 同， 2 个与 同 ， 另 外 2 个则 同。 对于一个新种来说，应该包括脂肪酸成分的描述资料，脂肪酸分析方法较为简便，但它要求菌株的培养和分析方法都必须在严格标准的条件下进行才能得到重复性好的结果。对于属的鉴定准确性在 99%以上，而对于种的鉴定来说，如果脂肪酸成分总相似性达到 30%，那么这一方法可以很好区分不同的种。但在某些情况下，不同的种也可能有同样的脂肪酸图谱。目前这一方法已作为一种快速有效的方法而经常应用于根瘤菌的多相分类研究中。 多糖分析（ 脂多糖分布在根瘤菌的外膜上，由磷脂和多糖直接连接而成。不同的根瘤菌菌株脂多糖的种类和排列不同，可通过凝胶电泳和银染技术反映出来。 稳定性和多型性是菌株鉴定和多样性评价的重要依据。 人 (1993)曾研究了 34株分离自苏丹的金合欢根瘤菌的 现有三种不同的 。 （ 2003）对来自中国的 198 株大豆快生根瘤菌的 性状进行了分析，充分揭示了中国大豆根瘤菌的生物多样性特征，并获得了 5 株具有良好共生效应的菌株。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 6 除了上述分析方法，血 清学分析及噬菌体敏感性分析也经常作为一种快速的分类坚定手段而应用于根瘤菌的分类中。 以基本表型特征为基础的细菌分类往往是不够精确的，通过表型分析比较可以综合地反映根瘤菌的表型多样性，但难以全面反映根瘤菌的全部遗传特征。遗传多样性是指生物种内基因的多样性，包括种群间和个体间的遗传变异。由于核酸是贮存、传递遗传信息的物质基础，分析核酸的变化可直接揭示有机体之间的亲缘关系，建立以系统发育关系为基础的分类系统，具有更加客观性和高可信度。在根瘤菌中，常用的遗传学分析方法有以下几种： 立在基因组水平上的指纹图谱分析 纹图谱分析 (细菌基因组中广泛存在一些短重复序列，如因外重复回文因子） (et 1982； et 1984)， 杆菌基因间重复共有序列）(et 1990)， . et 1992） 及 . et 1994)等，这些短重复序列具有一定保守性，随机地分布在细菌基因组中，长度小于 200究者根据它们序列的保守性设计出长度为 15 22 个碱基的引物（ . et 1991），可用于扩增细菌基因组中位于重复序列之间大小不同的 段（ . et 1996） ,扩增片段经常规的琼脂糖凝胶电泳分离，可产生重复性较好的具有 种特异性或菌株特异性的 纹图谱。高俊莲 (2001)等人用 合 术揭示了分离自黄芪的根瘤菌的遗传多样性特征， 供试菌株分成了 31 个遗传群，遗传多样性极为明显，并于最近发表了中慢生根瘤菌属的 2个新种： et 004）。因此， 根瘤菌多样性研究、分类聚群和鉴定中有用的技术（ . et 2003 ）。 纹分析技术 (扩增片段长度多态性，是近年来发展起来的又一应用于细菌分类的新技术。首先采用一对限制性内切酶（通常是一种寡位点与一种多位点酶结合）消化染色体 将专一位点接头连接到酶切片段上，再用两个分别与接头序列和酶切位点序列对应的引物进行选择性 增。扩增产物用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，经银染或放射自显影就可获得 纹图谱，然后将图谱扫描后的信息输入计算机，用相 关软件分析即可得到聚类树状图。 合荧光标记发展的 术（ . et 1999;et ， 使 应可以在测序仪器上完成，数据更加标准化，既便于不同菌株间 纹图谱的比较和建立参比菌株的 纹图谱信息库，也增加了稳定性和可靠性。 纹技术灵敏度高、重复性好、分辨率高、简单快速且无需事先了解被研究对象的列，指纹图谱的差异可以与菌株或相近种内基因的变化相对应。因此，可以在亚属、种和亚种水平对微生物进行分 类，尤其对区别高度相关的菌株具有很大的潜力（ . et 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 7 在根瘤菌研究中，张小平等（ 1999）采用 术，对分离自我国四川、津巴布韦和以色列的 133 株花生根瘤菌的 增片段长度多态性进行了分析，结果表明供试的菌株的纹图形具有菌株特异性。冯瑞华 (2000)采用 术和 16S 对我国云南省与西藏交界的高山地区的毛苜蓿根际土样分离的 291 株毛苜蓿根瘤菌进行了遗传多样性的研究，从 谱中，揭示出毛苜蓿根瘤菌有显著的遗传多样 性。 （ 2003）对 101 株山羊豆根瘤菌进行了研究，从 根瘤中分离根瘤菌，其 谱存在显著差异，而且在 结瘤的根瘤菌群内的差异更大。陈强（ 2004）采用 分离自我国四川省葛藤属的 23 株根瘤菌进行了 试菌株分属于 分成 7 个 传群，遗传差异明 显。 随机扩增 段的多态性分析（ 随机扩增 段的多态性分析技术创立于 1990 年（ . et 1990）它是利用随机排列的碱基顺序寡核苷酸单链为引物，对所研究的基因组 行扩增，扩增产物经电泳分离和染色后，检测 段的多态性。 由于随机引物寡核苷酸序列在细菌染色体 分布的位置和数目不同，经扩增后得到的 纹图谱显然不一致。因此， 纹型能提示基因组染色体 基 的变化（ et 但是，若采用单一引物扩增，所检测到的基因组区域非常有限，多态性不明显，因而在现代研究中多采用一系列引物，使检测区域几乎覆盖整个基因组，从而反映出细菌全序列的基因变化。 在根瘤菌研究中， 术主要用于研究种内的遗传多样性（ . et 2003; . et 1996）。李群芳 (1999)等用 术研究了四川花生根瘤菌的遗传多样性，结果表明， 4 个随机引物的扩增图谱有 明显的多态性，供试的 22 株根瘤菌分为 6 个遗传型，同一采集地的菌株分布在同一遗传型内，表明环境条件对根瘤菌的发育和遗传分化有影响。 术快速、简单，但也存在着局限性：对反映条件敏感，容易出现假带，使结果的重复性较差；并非所有的随机引物都能产生足够的多态性（ , et 1992），其有效性取决与引物的长度和 量（ et 992）。因此研究者通过使用双引物、提高退火温度（ 40以上）等措施，有效地降低假条带的产生，提高 重现性和多态性（ et 1995），在此基础上，目前发展了双引物 . et 使 果具有了种的特异性。 殊基因片段的多态性分析和保守序列测定 限制性片段长度的多态性 (术是利用适当的限制性内切酶在特定位点上将基因组 割成不同长度的片段，通过凝胶电泳分离后对所得图谱进行分析比较得出分类结论。一般而言，细菌的基因组 大，用现有限制性内切酶酶解得到的片段太多而难以用于区分亲缘关系较近的菌株，因此为了得到既简单又具有足够信息以计算不同菌株之间遗传距离的电泳图谱，人们将 术与 析结合在一起，即利用 术扩增普遍存在于细菌中的保守基因区域，再用特异的限制性内切酶对得到的特殊中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 8 基因片段进行酶切、电泳和图谱分析。用于这一目的的特殊基因主要是