病理解剖技术

病理解剖学技术（The technique of Pathology哈尔滨医科大学病理教研室金晓明,序： 病理学的理论和技术被视为一辆车的两个车轮，缺一不可，互为依存，互相促进，两者的结合决定病理学的发展。,病理学的技术主要体现在几个结合上1.传统病理学技术与现代生物新技术相结合2.宏观、脏器、组织、细胞、超微与分子基因不同层次技术相结合3.形态、机能与代谢变化相结合4.定性、定位与定量观测相结合5.实验研究技术与临床应用技术相结合6.技术的基本原理与具体方法相结合7.基本技术知识与作者实践经验相结合,病理学的发展与使用的工具和方法的更新密切相关1.用解剖刀剪等进行尸体检查，开展了器官病理学2.显微镜发明百年之后，建立了细胞病理学3.电子显微镜的问世，发展了超微病理学4.免疫组织化学促进了免疫病理学的发展5.分子生物学带动了分子病理学的兴起6.计算机及其网络的应用，将病理学走向信息病理学时代,传统病理学技术： 传统的Formalin固定，石蜡切片和HE染色技术仍是病理学的基本技术，大量应用与基础和临床病理学日常工作中，保证和提高常规质量和现代设备水平十分重要。,第一章：病理解剖技术一、病理解剖的意义 病理解剖技术是病理学的基础之一，是病理学不可分割的一部分。 通过病理解剖收集病理教学及科研资料是其中一个途径，大量病理资料的积累促进了医学的发展与进步。 病理解剖是通过解剖尸体观察和发现死者器官、组织的病理变化，找出主要病变，分析判断直接死亡的一个重要方法。,二、病理解剖室的设备和器械1. 设备：1解剖室的设计要求 最好位于太平间； 室内面积要大，必须有两个门； 地面用水磨石，四周有排水沟或地漏； 室内通风好； 有消毒室，男女更衣室，浴室等。,2解剖台的设计 高低和大小要合适 台面可用水磨石或不锈钢 有条件可购置能够升降的解剖台 解剖台可带有抽气的功能等,水磨石台面的解剖台,水磨石台面的解剖台,不锈钢台面的解剖台,病理解剖器械,2. 器械：,3. 清洁、消毒和个人保护1病理解剖室的清洁和消毒2病理解剖器械的清洁和消毒3个人保护等,三、病理解剖的方法和步骤1. 病理解剖前的准备 主要办理一切手续，非常重要。2. 体表检查,体表检查,尸斑，尸僵,3. 胸腹腔检查1切口2腹腔检查3胸腔检查,腹腔有渗出液,心包积液（血液,气管周围血液,液体称量,4. 内脏器官的取出及检查 一般有两种方法：1各脏器分别取出法 是病理解剖最常用的方法2多脏器联合取出法 此法比较简单，可保持各器官的完整性。,心脏,表面充血,绒毛心,双肺和支气管,肝脏,表面有结节,胰腺，出血改变,肠管，出血,脑,脑干出血,第二章 病理大体标本的制作一、大体标本的收集、取材、固定和保存1.大体标本的收集 通过尸体解剖和活体组织（包括外科手术切除标本和活体组织穿刺标本检查时发现并收集。2.大体标本的取材,取材室条件：通风要好，必须有排风设备；固定的组织取材前要用流水充分冲洗；排水要远离住宅区等,不同器官的取材和固定不同：1实质性的器官：如肝、脾等 要注意，实质器官不容易被固定液所穿透。,肝癌,肝癌,肝癌,肝癌,2空腔器官：如胃、肠等 取材时要看全层，保持粘膜、肌层和浆膜全层的组织。,胃癌，呈菜花状,切面的形状,胃癌，溃疡型,切面的形状,切面的形状，浸润性至浆膜,溃疡型胃癌,溃疡型胃癌,切面的形状，浸润性至浆膜,3肺 肺组织比较疏松，固定液容易渗透。 肺组织的取材要清楚的了解各叶肺组织所伴随的支气管。,A：主支气管B：叶支气管,肺和气管周围的淋巴结,肺癌肺门型,肺癌肺门与周围之间,肺癌周围型,肺癌空洞型,4）其它类型 外科手术标本常见： 乳腺癌 子宫颈癌 肠癌 卵巢肿瘤等,乳腺癌,乳腺癌,乳腺癌,乳腺癌,子宫颈癌,子宫颈癌,子宫颈癌,子宫颈癌，切面,3.大体标本的固定1固定的目的： 将受检组织尽快地侵入固定液内，使组织和细胞的固有成分迅速凝固，防治自溶和腐败，使其保持与生活状态有相似的结构，以利于切片和观察。2固定液的选择：A.甲醛（Fomaldehyde，又称福尔马林，其浓度在4，它是一种还原剂，极易挥发，散发出强烈的刺激性气体，使人流鼻涕、流眼泪，呼吸道有异物感。B.95酒精（乙醇，除具有固定组织的作用外，尚有脱水作用。,3固定液的特性 甲醛固定液渗透力强，固定均匀，对组织收缩较小，并能增加组织韧性的优点，而且可以保存组织内的脂类物质，对组织的主要作用为硬化和防腐。 酒精可以保存组织内的糖类物质及尿酸结晶，不过，它常使组织明显收缩，且使脂类物质溶解。,4. 大体标本的脱水、包埋和切片 为能制成满意的切片，固定后的组织还要经过脱水、透明、浸蜡及包埋等一系列程序。1脱水：目的是将固定了的组织内水分除去。以便使切片时的支撑物（石蜡充分进入组织内。常用的是酒精。2透明：目的是使能与石蜡结合溶解的媒介剂进入组织，进而将不能与石蜡结合的脱水剂置换出来，并使组织透明。常用的是二甲苯。,3浸透和包埋：可使组织具有一定的硬度和韧度，便于切成薄的切片。常用的石蜡溶点为6062，有时为保存更多的抗原成分。可采用低溶点石蜡（4850 。4切片切片机类型： 旋转式切片机 滑动式切片机,旋转式切片机,5. HE（Hematoxin Eosin,HE染色1苏木素染色配方： 苏木素 1g 纯酒精 10ml 钾明矾 20g 蒸馏水 200ml 氯化汞 0.5g2伊红染色配方： 伊红 0.5-1g 蒸馏水 99ml,HE染色法：1苏木素染色57分钟；2自来水冲洗多余的染液；31盐酸酒精分化数秒钟，使细胞核呈紫蓝色4自来水中充分洗涤；51氨水中数秒，至返蓝；6自来水中至蒸馏水冲洗；71的伊红染色，3分钟左右； 结果：细胞核呈紫蓝色，细胞浆呈粉红色，基底膜，胶原纤维及肌纤维呈粉红色。,HE切片,第三章 特殊染色 HE染色虽是一种快速、经济、且易掌握的方法，但它不能回答病因学、Z组织发生及发病机制等方面的许多问题。而特殊染色可以协助解决病理诊断问题。,目前市场上有配制好的特殊染色试剂,介绍常用的几种特殊染色1. 脂肪染色 主要用于心、肝、肾的脂肪变性，动脉粥样硬化，以及因脂肪栓塞导致的死亡病例鉴定等。1试剂配制：苏丹染液 苏丹III或苏丹IV0.5g，70%乙醇250ml，丙酮250ml。2染色方法：（1标本常规甲醛固定后流水冲洗12h；（2用滤纸吸干标本表面的水分，把标本放入苏丹III染液中浸泡30min；（3用70乙醇分化，以脂肪组织呈橙黄色，其它组织不着色为佳；（4水洗后浸存在5甲醛液中，为了防腐可加入适量的防腐剂。,肝脂肪变,苏丹III染色,2. 过碘酸(periodic acid)-schiff染色，即PAS染色 此技术主要显示糖原（在淀粉酶消化对照下、中性粘液物质、基底膜、霉菌和寄生虫等。1 schiff氏试剂的配方：（1将200ml蒸馏水煮沸；（2冷却至90时，慢慢加入碱性复红1g;（3搅拌并煮沸5分钟使其全溶；（4冷却至50时过滤，并加入1N盐酸20ml；（5冷却至25时，再加入无水亚硝酸钠1g并搅拌匀。（6置入遮光瓶内并放入在4冰箱内保存备用。,2PAS染色方法：（11过碘酸水溶液染10分钟，使含有乙二醇的化合物氧化形成醛基；（2蒸馏水洗去过碘酸；（3 schiff氏试剂反应15分钟，使醛基和schiff氏试剂结合，形成紫红色产物；（40.5%亚硝酸钠(NaHSO3)处理三次，每次2分钟；（5流水冲洗510分钟；（6用苏木素染色液复染细胞核；7水洗或1盐酸酒精分化。3结果： 细胞核呈蓝色，基底膜呈红色，胶原纤维、肌纤维及细胞浆呈红色。,过碘酸Schiff反应：糖元及其他PAS反应阳性物质呈红色，细胞核呈蓝色,PAS,念珠菌（PAS染色）,附：AB/PAS法（阿尔辛蓝过碘酸雪夫染色法结果：中性粘液物质呈红色，酸性粘液物质呈蓝 色，中性和酸性粘液的混合物质呈紫色。,阿尔辛蓝阿尔辛黄法：常用于黏液上皮肿瘤的鉴别诊断,阿尔辛蓝过碘酸雪夫反应：是显示中性和酸性黏液物质的有效方法,HID/AB:高铁二胺奥新蓝法,AB/PAS,3. 六胺银（PASM染色 在肾脏活体组织检查和一些真菌感染的组织选用此方法。1PASM染液的配方： 2硝酸银水溶液3ml； 3六次甲基四胺液25ml； 5硼砂2ml。注：2硝酸银配制胺溶液，染色时间40分钟，温度 5560，随时镜下观察便于控制。,2PASM染色法：（11过碘酸水溶液内染10分钟；（2自来水冲洗，蒸馏水冲洗；（3入5铬酸水溶液40分钟，出此溶液后用1亚硫酸钠除掉铬酸；（4自来水洗数次，蒸馏水洗34次；（5入六胺银染液（506040分钟，20分钟后，每5分钟镜下观察一次，蒸馏水洗四次；（6入0.2%氯化金水溶液12分钟，蒸馏水洗三次；（7入5硫代硫酸钠水溶液12分钟，蒸馏水洗数次；（8复染HE，脱水、透明、封片结果：底膜呈黑色，网状纤维呈黑色，细胞核呈蓝色，背景呈粉红色。,PASM染色,PASM染色,PASM,PASM,附：PASM对真菌的染色 真菌（fungus，又称霉菌，其种类较多。 真菌的基本结构成分是含有较多的粘多糖和蛋白质。1试剂的配制：（1六次甲基四胺、硝酸银原液（简称六胺银原液。3六次甲基四胺水溶液100ml，5硝酸银水溶液5ml；（2六胺银硼砂染色液。六胺银原液25ml，蒸馏水25ml，5硼砂水溶液2ml；（3核固红染液。核固红0.1g，硫酸铝5g，蒸馏水100ml；（4亮绿染色液。亮绿0.2g，蒸馏水100ml，冰醋酸0.2ml。,2染色步骤：（15铬酸水溶液氧化1小时，流水洗2分钟，蒸馏水洗2次；（2浸入1亚硫酸钠水溶液除掉铬酸1分钟，流水洗5分钟，蒸馏水洗3次；（3浸入六胺银硼砂液染色11.5小时（4050温箱内，至切片呈浅棕色，蒸馏水3次；（4用0.2%氯化金水溶液调色3分钟，蒸馏水稍洗；（5核固红染色细胞核10分钟，流水洗，蒸馏水洗；（6亮绿染色液30秒，用蒸馏水快速稍洗；（7无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。结果：真菌均呈黑色，菌丝和孢子呈黑褐色，细胞核呈红色，背景呈淡绿色。,念珠菌（假菌丝）,新生隐球菌性脑膜炎,4. 淀粉样物质染色（介绍刚果红染色） 淀粉样物质是一种嗜伊红性物质，性质属于糖蛋白成分。组织出现此物质称为淀粉样变性。1试剂配制：（1刚果红染色液。刚果红1g，蒸馏水100ml；（2Harris苏木素染色液。,2染色步骤：（1苏木素染色液浸染2分钟；（20.5%盐酸乙醇分化数秒钟；（3流水洗，蒸馏水洗2次；（4刚果红染色液中25分钟；（5无水乙醇迅速脱水2次；（6二甲苯透明，中性树胶封固。结果：淀粉样物质呈红色，细胞核呈蓝色。,刚果红染色,5. Mallory三色染色法（属于结缔组织复合染色法1试剂配制：（1重铬酸钾液。重铬酸钾2.5g，醋酸5ml，蒸馏水95ml；（2苯胺蓝橘黄G液。苯胺蓝0.5g，橘黄2g，磷钨酸1g，蒸馏水100ml；（3酸性复红液。酸性复红0.5g，蒸馏水100ml。,2染色步骤：（1重铬酸钾液10分钟；（2流水洗2分钟，蒸馏水洗2次；（3酸性复红液2分钟，蒸馏水稍洗；（4苯胺蓝液20分钟，95乙醇快速分化；（5直接用无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。结果：胶原和网状纤维呈蓝色，软骨、粘液、淀粉样变性物质呈淡蓝色，神经胶质纤维、肌纤维和酸性颗粒呈红色，髓鞘和红细胞呈橘红色。,特点：利用酸性复红、苯胺蓝、橘黄G这三种染料对结缔组织和非结缔组织进行着色。,Mallory,6. Masson三色染色法1试剂配制（1Masson复合染色液。碱性复红1g，丽春红2g，橘黄G2g，0.25%醋酸300ml；（2）亮绿染色液。亮绿SF0.1g，0.2%醋酸100ml。2染色步骤（1 Masson复合染色液5分钟；（2 0.2%醋酸水溶液稍洗；（35磷钨酸510分钟；（4 0.2%醋酸水溶液浸洗2次；（5亮绿染色液5分钟；（6 0.2%醋酸水洗2次；（7无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。,结果： 细胞核呈红色，基底膜、胶原纤维呈蓝绿色，免疫复合物呈红色。,适用于脑垂体、上皮、甲状腺、神经的正常和肿瘤组织,Masson,肾小球,左：HE染色右：Masson染色，胶原组织呈蓝色，弹力纤维棕色，肌纤维、 纤维素、红细胞呈红色，胞核呈黑蓝色。,7. 弹力纤维染色法 病理诊断应用弹力纤维染色，目的是观察组织内弹力纤维是否增生或破坏、断裂和崩解，从而帮助诊断。试剂配制： 地衣红酒精液 1g 70%酒精 100ml 浓盐酸 1ml结果：Taner-Unna法，弹力纤维呈深棕红色。 Verhoeff铁苏木素染色法，弹力纤维呈黑色。,Verhoeff铁苏木素染色法：弹力纤维黑色或黑蓝色，胞核黑色，胶原纤维呈红色,Verhoeff铁苏木素染色法,Lendrum纤维素染色法显示肾小球毛细血管腔内血栓形成,免疫组织化学技术,第四章：,免疫组织化学（Immunohistochemistry）一定义： 应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成分进行原位的定性、定位、或定量研究，这种技术称免疫组织化学（immunohistochemistry） 或免疫细胞化学（immunocytochemistry），简称免疫组化。免疫组化技术是1941年 Coons等学者首创的，随着其理论及技术的发展，目前已发生了日新月异的变化。,1免疫组化的方法： 1）直接法 2）间接法： SPA、 PAP、 ABC、 LAB法等，间接法 的灵敏度高于直接法。2标记的物质：荧光染料、放射性同位素，酶（辣根过氧 化物酶、碱性磷酸酶等）铁蛋白、胶体金等。3根据标记物区分：免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和 免疫金银法。其中免疫荧光法和酶标法应用 广泛。,反差,二免疫组化的基本知识1原理：抗体与抗原间的结合具有高度的特异性，免疫纽织化学正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫后获得特异性抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的抗原物质。由于抗原与抗体结合后形成的免疫复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来，以期达到对组化或细胞中的未知抗原进行定性、定位甚至定量的研究。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等，都可以用相应的特异性抗体进行检测。,2.抗原性的保存：上述谈到的抗原或半抗原物质，防止在组织或细胞内丢失是非常重要的。在组织处理过程中，如固定、包埋、薄切、反应，必须保持其抗原性，特别是选择的固定液及包埋方法要十分注意。3.抗体：抗体是机体受抗原刺激后，由B淋巴细胞、特别是浆细胞分泌产生的一种与相应抗原发生反应的一种球蛋白，即免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig)，共有五类：IgG, IgA, IgM, IgD, 和IgE，主要分布在血清或外分泌物中，以IgG为主，约占7080。,1抗体的制备方法：A 多克隆抗体（血清抗体：指机体接受抗原主动免疫或被动免疫后从血清中分离提纯的抗体。B 单克隆抗体：是1975年由Kohlenh Milstein发明的一种新技术。其原理是将体外培养的骨髓细胞和免疫的脾细胞相融合，产生杂交细胞。这种融合的杂交细胞既有骨髓细胞的无限生长能力，又有浆细胞分泌单一抗体的能力。将该免疫细胞纯化，成为单克隆系，就能产生大量专一的高纯度的抗体，即单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb),2) 单克隆抗体与多克隆抗体特性的比较特性 多克隆 单克隆组成 多种类抗体的混合物 单一种类的抗体 特异性 低针对多个抗原决定族 高针对单一的抗原决定族亲和力 平均亲和力较高 不定，较低交叉反应 高 低,4抗原与抗体的特异性结合 抗原与抗体的结合具有高度的特异性。在抗体的轻链和重链的可变区中有3个特殊的易变部位，即在第30位、50一60位和第100位氨基酸残基附近，这些部位称为超变区。超变区直接参与抗原接合部位的组成，形成的接合部位是一个浅平穴槽，槽大小约I.5nm0.6nm0.6nm抗原决定族在空间呈互补性地嵌入槽内，借分子间的范德华力、疏水作用静电引力以及氢键而相互结合。抗原与抗体分子的结合不受两者数量比例的限制，但如要出现肉眼可见的反应， 则抗原与抗体的量需有一定的适当的比例，否则在抗原与抗体过量的情况下，不能聚合成大颗粒，因此不能出现肉眼可见的反应。,三免疫组织化学的基本技术 （一 取材1实验动物：麻醉 （处死，锋利刀片切成大小适中， 厚度3mm4mm; 小型实验动物：灌注（流）固定（生理盐水和4多聚甲醛 取材2人体材料：活检组织、手术标本、细胞和组织,（二）固定：原则是保持组织形态良好和被检测抗原的前提下，应采用浓度最低的固定剂和最短的固定时间，固定时间一般为112h。1常用的固定剂：1）甲醛缓冲液：广泛应用于病理标本的固定，甲醛在很好地保护组织形态结构完整的同时也有效地保存某些抗原。由于甲醛的交联作用会影响被固定细胞膜的通透性不利于染色时抗体的渗透，因此染色前常用酶进行消化以使抗原决定簇充分暴露，固定时间不直超过24h。,2）4多聚甲醛磷酸缓冲液：广泛应用于光镜细胞化学研究。3）戊二醛多聚甲醛缓冲液：适用于光镜、电镜免疫组织化学研究。4）其它：如PLP液（过碘酸赖AA多聚甲醛固定液）、丙酮及醇类、锇酸等。,2固定注意事项：1）固定液的选择标准：A. 组织形态结构保存良好；B. 最大限度 保存抗 原的抗原性。中性甲醛和多聚甲醛是应用最广的固定剂。2）组织块的大小：1.5cm1.5cm0.5cm为宜。3）固定时间：与组织块大小成正比，与固定液浓度成 反比。4）温度：一般在室温下进行，电镜标本和固定时间较长时 可放置在4 冰箱。5固定后处理：充分冲洗，除去多余固定剂。,（三）包埋：1.石蜡包埋；2.冷冻包埋；3.环氧树脂包理。（四）切片：1.载玻片的处理：1）清洗 ；2）涂胶（防止脱片） 常用粘附剂：明胶：铬矾明胶和甲醛明胶；树脂胶： 也称白胶； 多聚赖氨酸（PLL）；商品化粘附剂。2.切片类型：l）石蜡切片：厚约 3 5 m放置 37 温箱烘烤过夜， 以减少脱片。2）冷冻切片：2 m。3）振动切片：特点是组织经固定后不需包埋，只要用胶水粘在 载物台上即可切片。切片较厚，可将阳性部位作电镜包埋。 神经组织应用 较多。,四免疫组化染色过程中的基本技术（一）蛋白酶消化技术 进行固定时，抗原决定簇有可能被固定剂所封闭，因此在抗原抗体反应前，常用蛋白酶处理组织切片，使抗原决定簇充分暴露出来，并使组织的通透性增高，以利抗原抗体最大限度地结合增强特异性染色。1常用的消化酶：胰蛋白酶、胃蛋白酶2消化时间：因组织而异，一般为530分钟，消化时间不宜太长，以免损伤组织形态，破坏抗原决定族。消化结束后要充分洗涤，以除去残留的蛋白酶。,1）非特异染色的控制 非特异染色或背景染色是指在免疫组化染色过程中凡不属于特异性抗原抗体反应所出现的染色。1原因分析：组织方面：主要有组织的自发荧光、内源性过氧化物酶或碱 性磷酸酶、内源性生物素等；试剂方面：因抗体不纯、标记的酶和荧光不纯或标记过量等。2消除方法： A. 加 1抗前加正常血清1030分，以封闭组织中带电荷的基 因，避免与1抗的非特异性结合。,B . 减少非特异性染色：a 免疫酶组化染色时，在加1抗前，用0.3的H2O2甲醇溶 液将组织切片处理30分（若是3的H2O2甲醇溶液处 理510分）。b 免疫荧光染色时，可用0.010.05伊文思蓝稀释荧光 抗 体。（二）对照实验 阳性对照片：用已知抗原为阳性的标本作对照。 阴性对照片：确认不含己知抗原的标本作对照。,（三）抗体的分装、稀释、滴加及保存1抗体的分装：不能用完的抗体分装在小的EP管内，保存在 -20 - 40 的低温冰箱中持用可保持数年有效。2抗体稀释：常用 0.01M PBS（磷酸缓冲溶液）或 BSA （牛血清白蛋白）3滴加：滴加的抗体要充分覆盖组织切片，一般加 3050l，最好在滴加前，用蜡笔或特制的组化笔在组织周围画一圈，以防溶液的扩散。4保存：未用完的抗体可在低温冰箱或冻干保存，已稀释未 用完的抗体最好在一周内用完，不宜长期保存。,（四）免疫酶组织化学技术和酶标抗体技术1免疫酶染色原理： 用酶作为标记物，可分为直接法、间接法、补体法、免疫酶桥法、免疫酶双桥法、过氧化物酶抗过氧化物酶法（PAP法）和双PAP法等。1）直接法原理：用酶直接标记在特异性1抗上，与标本中的 抗原结合，让酶催化底物反应产生有色产物，沉淀在抗原 抗体反应部位，即可在镜下对标本的抗原进行检测。优点：简便、快速、特异性强；缺点：敏感性差。,2）间接法原理：先用标记的特异性1抗与标本中相应抗原结 合，再用酶标记的抗球蛋白抗体（2抗）孵育，然后再加 酶的底物，显示抗原抗体抗原抗体复合物存在的部 位，以对抗原进行检测。如：1抗是由免产生的多克隆抗体： 则2抗常用羊抗兔IgG；如：1抗是由鼠产生的单克隆抗体： 则2抗常用羊或马抗鼠IgG。以上两种方法称为酶标抗体法,3）非酶标记的抗体酶法：是以酶为抗原免疫动物，产生抗酶的抗体。通过酶与抗体的特异性结合进行标记。该方法适用于石蜡包埋的组织切片。 原理：首先用酶作为抗原免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体，然后以2抗为桥梁，将在组织中与抗原结合的lffo抗酶抗体连接起来，再将酶结合在抗酶抗体上，经呈色反应显示抗原的分布。在这种过程中酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合，避免了酶标时化学反应对抗体和酶活性的破坏。不但提高了敏感性，同时还节省了1抗的用量。常用的有PAP、sABC、LsAB法（附图表说明）。,（酶标识特异抗体,（酶标识二次抗体,生物素,HRP,ALP,1常用的酶种类： 常用的酶大多为辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）介绍几种酶的底物及产生沉淀的颜色。常见的几种酶的一般情况酶 底物 沉淀颜色HRP A 3,3氨基联苯胺DABH2O2 深褐色 B 5氨基水杨酸 H2O2 棕色ALP A 苯酚磷酸盐重氮盐 红色 B P校际酚磷酸盐 黄色酸性磷酸酶 Gomoui液葡萄糖氧化酶 D葡萄糖MTT酚嗪磷酸 甲酯化合物 蓝色,五免疫组化的实际操作（一）实验准备 1. 必须器材： 1）实验台：光线充足，方便操作。 2）湿润盒：放置抗原抗体反应过程中反应，避免干燥。 3微量移液器：120 l、20200 l 、1001000 l必备。 4其它：滤纸、纱布、吸头、EP管、染缸、提篮等。2.试剂药品 1缓冲液：PBS, 0.01 M 磷酸缓冲液（pH7.2） TBS, 0.05 M Tris盐酸缓冲液（pH7.6） 2抗体稀释液: 1 BSA或 0.01 M PBS 310 2抗免疫动物的正常血清 4DBAH2O2显色液 5核复染液：苏木素或甲基绿,（二 sABC法的操作过程1. 基本原理：sABC（strepto-avidin-biotin peroxidase complex）链球菌抗生物素（卵白蛋）生物素过氧化物酶复合物 生物素（ biotin）：是一种分子量为 244da的小分子的维生素。 抗生物素（avidin）：是一种糖蛋白，分子量为 68KDa。 生物素与抗生物素有很强的亲和力，两者一旦结合就很难解离。同时生物素与抗生物素都有与其它示踪剂如荧光素，胶体金和过氧化物酶等相结合的能力。所以生物素-抗生物素系统具有灵敏度高、特异性强及方便快速等显著优点。 基本操作步骤：,六操作过程中的各种注意事项及结果判定 要想得到理想的结果，组织细胞形态的保存、抗原性的保存、充分的显示是非常必要的。要满足这些条件，取材、固定、切片厚度、操作过程、抗体浓度及特异性的选择、操作前蛋白酶的消化、抗原修复及显色等各程序的操作不当均可导致不满意结果的产生。1取材固定：标本要尽可能新鲜，取材固定要及时，固定液要新 鲜充足，防止组织破坏和抗原性的失活。2切片：切片不宜过厚，一般4m左右。切片不宜过大，载玻片要涂粘附剂，以防脱片。切好的切片暂放 37 温箱保存。,3脱蜡：脱蜡一定要彻底，新鲜二甲苯 5min 3。4蛋白酶消化：由于组织在固定时抗原决定簇可能被固定 剂所封闭，因此在抗原抗体反应前常用蛋白酶处理组织 切片（根据1抗要求），使抗原决定簇充分暴露出来，并 使组织通透性增高，使抗体充分结合抗原，增强特异性 染色。一般用0.1% 胰蛋白酶或胃蛋白酶消化530min。5抗原修复：一般在柠檬酸钠抗原修复液内，微波炉， 8595，10min左右。,6抗体的选择：选择抗体时要注意是用于冰冻切片还是用于 石蜡切片的抗体，或是二者均可；其次要看抗体说明，是 单抗还是多抗；适用于哪些组织；抗体来源于哪种动物， 由此来选择2抗；还有抗体的稀度（在实验前根据预实验 选择最佳浓度。7特异性的确定：阴性对照（不加 1抗，用PBS或TBS代 替），阳性对照（已知确定阳性的组织）或买阳性对照片。,8DABH2O2显色：注意H2O2的浓度，必须在显示前加入 H2O2均匀搅拌，最佳显色时间在35min，过短或过长都 不会出现满意的效果。 9复染：一般用苏木素30s，过长复染将掩盖免疫组化的染 色效果。10结果判定：以下用图片说明。,膜性肾病，IgG染色,免疫组织化学ABC法,胃癌淋巴结转移cerbB-2癌基因表达sABC法,HE染色,免疫组化染色,胃癌，P53抑癌基因表达， sABC法,胃癌CerbB-2的表达， sABC法,胃癌cerbB-2的淋巴管侵袭， sABC法,胃淋巴组织反应性增生，CD20/CD43检测sABC法,胃组织中的反应性增生的淋巴组织，CD43表达， sABC法,骨骼肌营养不良，myosin蛋白表达， sABC法,IgAN，TGF2表达，主要在近曲肾小管内， sABC法,IgAN, TGF2的表达，sABC法,IgAN，bFGF的表达， sABC法,IgAN, PDGF的表达， sABC法,免疫组织化学在病理诊断中的应用范围1.肿瘤诊断： 未分化恶性肿瘤性质判定； 圆形、梭形、多形性肿瘤细胞鉴别； 转移肿瘤的原发部位的确定。2.淋巴瘤的诊断： 鉴定反应性增生疾病与淋巴瘤； 各种淋巴瘤的分型。,3.内分泌肿瘤的诊断（检测肿瘤分泌的激素4.软组织肿瘤；神经系统肿瘤5.小活检组织病理检查（能明确显示瘤细胞存在与否6.微小癌、微小转移灶（淋巴结和骨髓7.细针穿刺（细胞学诊断,8.部分肿瘤来源分类9.乳腺癌激素受体检测（ER，PR10.肿瘤基因产物（p53,cerb-B2,ALK,CDs)11.增殖细胞核抗原（Ki-67，PCNA)判定肿瘤的预后12.病因诊断（HBV，HCV，EBV，CMV，HIV等,免疫组织化学在病理诊断中存在的不足1.与分子生物学等技术相比，范围有限2.并非所有肿瘤均可以做免疫组化，因常无相应的 抗体3.相当多的肿瘤缺乏特异性抗原的表达，同一种抗 体，常常可表达多种肿瘤4.免疫组织化学标准化问题,免疫电镜技术,哈尔滨医科大学病理教研室 金晓明,一、免疫电镜技术(immunoelection microscopy,IEM) 是利用抗原和抗体特异性结合的原理，在超微结构水平定位、定性及半定量显示抗原的技术方法。从细胞超微结构水平研究和观察抗原抗体的免疫反应，必须使抗体带上具有高电子密度的标记物，这样才能在电镜下观察反应分结果。 到目前为止，已有三种标记技术： (1)铁蛋白标记技术 (2)酶标记技术 (3)胶体金标记技术,二、免疫金标记技术（immunogold staining technique) 用胶体状态的金颗粒，作为抗体的标记物，制成免疫胶体金来研究抗原抗体的反应。在光镜下，胶体金呈鲜红色。电镜下，金颗粒电子密度大，有利于超微结构的观察。 根据抗体特异性结合的原理，在亚细胞水平定性定位。对抗体加以标记，形成高电子密度区，在电镜下观察反应过程。在对细胞内抗原定性研究中，还可用不同的金颗粒标记同一细胞内不同的抗原。进行多重标记。,三、免疫电镜的基本技术方法1.标本的处理(1)取材:各种培养细胞和分离的血细胞应随用随取；游离的培 养细胞可先进行离心；贴壁细胞可在载玻片上固定， 也可用胰蛋白酶将细胞消化下来；取组织块时应做到 越快越好，最好在没有停止血流前取材。,（2）固定 固定液的选择： 既要保存细胞的超微结构，又要尽可能的保存抗原的活性。A.多聚甲醛加低浓度的戊二醛固定液（PG固定液）B.过碘酸盐赖氨酸多聚甲醛混合固定液（ PLP固定液）C.苦味酸多聚甲醛戊二醛固定液（PAPG固定液) 固定方法与时间：A.血管灌注固定（最好方法）B.浸泡固定C.微波固定,2.基本技术方法（1）包埋前免疫电镜技术 是指先对标本进行免疫标记，然后进行包埋、切片、观察。（2）包埋后免疫电镜技术 是指组织标本经固定及树脂包埋，制作成超薄切片后再进行免疫化学染色方法。详见包埋前和包埋后电镜技术的比较,包埋前与包埋后的比较,肝细胞内的内质网和核膜，可见G-6-P酶阳性反应产物。(32000),肝细胞。箭头指线粒体，线粒体嵴、内膜基质侧呈现琥珀酸脱氢酶阳性反应颗粒（36000）,IgAN, TGFs2的表达，免疫金银法,IgAN, TGFs2的表达，免疫金银法,K4M低温包埋剂和紫外线低温包埋机联合的免疫电镜法 （实验结果介绍）,免疫电镜技术是从超微结构水平能显示抗原和抗体结合后在细胞微细结构水平的定位，这一技术已成为目前生物医学领域的一项重要研究手段。但是，由于免疫电镜技术因多种原因造成的重复性差或技术的不稳定性，加之目前电镜包埋所采用的是环氧树脂618或812，都需高温聚合，这样可使多种抗原活性减低或丧失。本研究组选用了Lowicryls K4M低温包埋剂和紫外线低温包埋机（SPI#17020），对免疫电镜观察的标本进行了处理，目的是更好的保存被检测组织中抗原的活性，提高检出率。现将一些不成熟的经验和存在的问题进行一下总结。,一、紫外线低温包埋机（SPI#17020）,SPI#17020是美国特殊研制的低温包埋机，它最主要的特点是采用数字化温度控制， 通常采用干冰制冷，也可以使用液氮制冷，温度可以控制在-10-37之间。通过温度控制风扇可以使机内的温度控制在某一恒定温度，持续长达36小时，完全可以满足低温脱水、浸透和包埋所需的时间。它占地面范围小，但机内空间较大，可以同时放入72个包埋胶囊。而且机箱上方有两个封闭起来的波长为360nm的紫外灯，低温和室温下的紫外线聚合都可以在包埋机中进行。 总之，紫外线低温包埋机是很理想的低温脱水、浸透、聚合的机器。,二、Lowicryls K4M 低温包埋剂 Lowicryls K4M是丙烯酸盐和甲基丙烯酸盐化学物质，其特点是能在低温下保持低粘度，能很快渗入组织以及具有在波长360nm的紫外光照射下聚合的能力，它的光聚合作用与温度无关，而且Lowicryls K4M具有亲水性，因此它能较好地保持组织结构和抗原性，减少背景染色。,三、方法1.包埋剂的配制 商品提供的Lowicrys K4M包埋剂由三个部分组成：单体，交联剂和引发剂。调整单体和交联剂的比例，增加交联剂的量，组织块的硬度增加。中等硬度的组织块，其配制比例如下： （1）Lowicryls K4M：单体 17.30g；交联剂2.70g；引发剂0.10g。可量取后，注入棕色的玻璃容器避光，用玻璃棒轻搅35分钟。勿过分搅拌，以防空气的气泡进入包埋剂中。（2）Lowicryls K4M的贮存：应保存在暗处室温下，该物质有刺激性，在配制时应戴手套，以免触及皮肤。在通风橱内操作，以免蒸气刺激眼睛。如触及皮肤和眼睛，应立即以水冲洗局部。,2.组织和细胞的取材、固定、处理（1）组织的取材与固定：用锐刀将新鲜组织切成13mm3的小块, 迅速置于3%多聚甲醛- 1%戊二醛固定液中, 23h。（2）细胞的取材与固定：将含有细胞的培养液转移到离心管中，离心15min，使细胞聚成团块，弃去上清夜，换上3%多聚甲醛1%戊二醛固定液固定23h。,（3）组织或细胞处理过程 将固定好的标本用0.01mol/L 磷酸缓冲液冲洗, 10min3次；用0.5mmol/L NH4CL-0.1mmol/L PB（pH7.4）封闭游离的醛基30min； 0.01mol/L 磷酸缓冲液1h；4 30%,50%乙醇脱水30min； -20乙醇系列逐级脱水至100%，各1h（乙醇溶液应先在冰箱中预冷）。-20低温包埋剂逐级渗透 , 纯包埋剂浸透过夜。标本放入含包埋剂的胶囊加盖后放入紫外线低温包埋机中，-2