【毕业学位论文】（Word原稿）CpG重组质粒的体外筛选及其在猪体内的安全性研究预 防 兽 医 学硕士论文

密级 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 组质粒的体外筛选及其在猪体内的 安全性研究 of of I 摘 要 本研究用已 构建 的 2、 3、 4，并按每孔 激用淋巴细胞分离液分离的 进行淋巴细胞体外转化试验，用 比较不同质粒及其浓度对猪外周血淋巴细胞的刺激效果。结果表明：四种质粒对猪外周血单个核细胞均有不同程度的刺激效果，其中 低剂量下就具有较高的 刺激指数，对猪具有最佳的免疫刺激活性。 用 对猪具有最佳免疫刺激活性 的重组质粒 500 g/头的剂量肌肉接种于试验猪，分别于注射后 4h、 4d、 8d、 15d、 30取主要组织器官的 后根据重组质粒序列设计引物并进行 确定重组质粒在猪体内的分布和停留时间。结果表明：在注射后 4h，可在猪注射部位肌肉检测到重组质粒 注射后 4d，可在 1头 猪的血液和注射部位肌肉检测到重组质粒 注射后 8d，任何组织都检测不到重组质粒的存在。 在上述研究的基础上，进一步对 0地高辛标记的 列为探针，进行 测是否有 果显示： 总之，重组质粒 为免疫佐剂在猪体内的停留时间少于 8d，且不会与猪基因组发生整合。 关键词 ： 重组质粒 淋巴细胞转化 残留 整合 PF by of TT It is of 0g of on it a at 00g of to of of h, 4d, 8d, 15d 0d of in CR It is in h of of in no On of CR O.9 0d by a to or of on of in no it t NA of 录 中文摘要 I 英文摘要 录 一章 绪论 1 1 发现 1 2 序的结构特点及种属特异性 2 序的结构特点 2 2 3 免疫刺激效应 2 4 应用前景 3 5 4 粒 4 粒 6 6 本研究的目的和意义 8 第二章 对猪具有最佳免疫刺激活性的 组质粒的筛选 9 1 材料与方法 9 料 9 法 11 2 结果 12 重 组质粒对猪淋巴细胞的刺激效果 12 3 讨论 14 第三章 重组质粒 16 1 材料与方法 16 料 16 法 17 2 结果 19 .1 19 感度 19 粒 猪体内存留时间和分布 20 3 讨论 22 第四章 重组质粒 因组 25 1 材料与方法 25 料 25 法 26 2 结果 28 组质粒的酶切结果 28 针标记用 段制备的结果 28 针敏感度 28 29 3 讨论 31 第五章 结论 33 参考文献 34 致谢 40 作者简历 41 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪 论 自二十 世纪 20 年代以来，国内外学者 对免 疫佐剂进行了 深入细致 的 研究，到目前为止，科学家们已经 尝试 了多 种 无机或有机材料 作为佐 剂 来提高 疫苗的 免疫效果。 近 年来，人们 发现一些以 非 甲基化的 核心的寡脱氧核苷酸 (列具有免疫刺激功 能（朱建中等 ,2001; et 2000;.,et 2001; et 2002），可明显 提高动物机体 免疫应答 水平 （ L， et 1998） ， 是一种良好的免疫佐剂。 1 发现 脱氧核苷酸（ 作为一种新型免疫佐剂，源于人类对癌症治疗方法的 研 究。早在 19 世纪九十年代，人们就观察到注射全菌制剂的癌症病人，其肿瘤可以显著消除 ， 1965 年 发现用 寡脱氧核糖核酸与绵羊红细胞一起注射小鼠，可明显提高小鼠对绵羊红细胞的免疫应答水平，并首次提出寡脱氧核糖核酸具有免疫佐剂活性的观点，但未引起广泛的重视。直到 1984年， 提取的 进一步证实非甲基化 的 胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸 (构可 刺激 宿主 的 免疫系统（ ， et 1984） 。 后来科学家们发现无论细菌 们的免疫刺激作用都是由于其中含有非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸（ 其特定的侧翼碱 基所构成的基序。 2 序的结构特点及种属特异性 序的结构特点 核苷酸 是一类以非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸为核心的序列，其碱基排列顺序大多为： 5 端为 2个嘌呤， 3 端为 2个嘧啶，即 5 共 6个脱氧核苷酸组成的特征序列 (如 5 、 5 和 5 。 元 ( M， et 1995） 。 进 一步 的 研究 显示 ， 仅包 含 6 个脱氧核苷酸 的 元的免疫刺激活性极弱 ，真正 产生免疫刺激活性的最短序列长度为包含上述0 个核苷酸残基。 等认为侧翼的 答 的水平和类型 （ ， et 1984）。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 2 序的种属特异性 人们发现相同 的 列对不同动物的免疫 刺激 活性 不尽相同 。 对不同物种的 发现： 元在无脊椎动物中 的 出现频率是细菌的 1/16，且其胞嘧啶上的第 5位碳原子未发生甲基化； 中出现的频率比细菌 更 低 (1/500)；而非甲基化0 倍（ P, et 1986） 。因此，人们推测脊椎动物正是通过识别原核生物 免疫应答 反应 。国外学者通过大量 的 动物 实验和 人类细胞 的 体外培养实验，确认了对小鼠细胞最具免疫 刺激 效 应 的 列 核 心 骨 架 及 其 序 列 分 别 为 ，而对于 人类淋巴 细胞最具 免疫刺激 效应的 。最 近 ， 国 内 学 者 也 通 过 实 验 筛 选 出 了 对 人 类 淋 巴 细 胞 具 有 增 殖 效 应 的 序 列5 ，并认为其活性强于国外报道的 外，人们还陆续发现了其它一些具有较强免疫刺激作用的 对牛最有效的序列是5 ；对鲤鱼有非特异免疫刺激 活性的序列 为含有 及含 ； 能促进猫和犬的免疫细胞增殖 的序列为 5 。含 人类、猩猩、猕猴、猫和犬均有免疫增强作用，而含 列的 上研究结果提示，对于不同物种，具有最强免疫刺激作用的 有种属特异性。猩猩、弥猴和人类 有同源性，而且实验 证实了 对人类刺激作用最强的 3 免疫刺激效应 含有 序的寡核苷酸可活化多种免疫细胞，包括 B 细胞、巨噬细胞和 胞 等，其 主要作用是刺激淋巴细胞 的 增殖和分化；激活多种免疫细胞，诱生多种细胞因子，尤其可调节免疫应答向 导单核细胞分泌 化自然杀伤 (胞分泌干扰素 (（ M， et 2001 a； 2001b）。 发 机体免疫应答的主要过程可能为首先直接活化细胞、单核细胞、树突状细胞等抗原提呈细胞分泌 同下直接激活 刺激 胞产生 同时增强单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞的活性；树突状细胞被 化之后产生以辅助性 T 细胞（ 疫相关的一些化学因子，并刺激 细胞的活化，间接地促进了细胞免疫应答 水平 （ J，et 1995）。 提出 卵清白蛋白 (特异性抗体滴度 ，从而 促进淋巴细胞增值（ et 2002）。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 3 4 应用前景 由于 某些抗原的 免疫原性 较 差，在缺乏佐剂的条件下，几乎不能诱导 免疫 应答的产生（ .， et 2001）。目前应用 较 多的佐剂主要诱导 答 ，该 类免疫应答不能产生细胞免疫应答，不能提供 足够的 免疫 保护。有可靠证据显示 不同抗原 均 具有佐剂作用，特别 是 有利于 增强 答 （ et 1997； .,et 1998）。 好 的免疫佐剂，已 被 大量的 动物试验所证实。例如， 猕猴 极大地增强 了 对添加 了 疾多肽疫苗的免疫反应（ et 1999） ；猩猩可以自然感染乙肝病毒，但商 品化 乙肝疫苗不能 提供 很好的免疫 保护 ，添加 乙肝 商品化 疫苗（ ，仅通过二次免疫接种， 猩猩的 血清抗体保护水平就由 8提高到 100 (et 2000)。 为疫苗佐剂，它不仅能提高传统疫苗 的 免疫效果， 而且对 苗也有显著的免疫增强效果。在抗感染疫苗方面， ., et 1998； .,et 2002） 、流感病毒（ r., et 1989） 、柯萨奇病毒（ . et 1992） 、甲肝病毒（ .,et 2000）、利什曼原虫（ 2001） 和爱滋病病 毒（ ., et 1998） 等 疫苗的良好佐剂。无论将 含 乙肝 抗原 的 组载体还是将 苗共同注射小鼠，均可显著提高疫苗的免疫效果（ J， et 2003； et 2003）；将灭活的流感病毒配以 清 中 抗流感病毒 的 抗体 效价 比不加 倍以上（ r., et 1989） 。 目前 ， 兽医生物制品 上常 使用 的 佐剂有：氢氧化铝胶佐剂、钾明矾佐剂、佛氏佐剂、油乳剂、蜂胶佐剂、脂质体载体佐剂、左旋咪唑和葡聚糖佐剂 ，其免疫 刺激效果 较低且 有一定的毒副作用 ，会在注射部位形成坏死和结节，引起肌肉品质的下降，从而限制了其使用范围。 而 反应， 细胞毒性 T 淋巴细胞（ 反应强，当用 铝 胶 佐剂与抗原混合使用时，机体产生的抗体水平比单独使用铝 胶 佐剂 和 抗原时高出很多倍，这说明 J， et 2003）。此外 ， 在粘膜免疫中， 生的水平也大大增强， 与此同时 减少 了 由霍乱毒素引起变态反应的可能性（ et 2003）。 因此， 实验室研究的 成 成本高、不适合大规模生产 ，限制了 为新型高效 佐剂 在临床尤其是兽医临床上 的应用。为了解决这一矛盾，将 列连接 入 质粒载体，构建出富 含 这一 研究 势必 成为人们解决这一问题的 首选。但是，含有 型铎类受体（ 结合来发挥作用，因此必须考虑到含 重组质粒在 动物体 内 的生物安全性 。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 4 5 剂的安全性评价 序 对多种疫苗抗原具有佐剂活性，对动物 的免疫系统 具有免疫 刺激 作用，这一观点已得到大家的共识 ， 但 序的作用机理 尚不 明确，许多问题 亟待 解决 。另外， 疫佐剂作为一种外源性 否会 在 动物 体内 广泛分布并 长时间停留 ；是否会引起免疫系统性疾病 ；有无产生抗 与宿主基因组 合的潜在危险 性； 外源 因 失活等 ，这些问题都 成 了 人们关注的焦点 。虽然 ， 目前所有 的 动物模型研究还没发现质粒 尚不能完全排除理论上可能发生的危险性（ S， 1994；靳彦文， 2001）。所以对于富含 序重组质粒作为 免疫佐剂 对 动物体的 生物 安全性，要按照质粒 价标准来进行 研究和评价 。 粒 安全性评价 粒 动物体内的 分布和停留时间 00质粒通过肌肉、皮下和静脉等途径注射后， 短时间内大部分会 被细胞等胞饮和吞噬，在酸性溶酶体的环境中被 降解和清除 ，粒载体 ， 在动物体内并 不能自身复制。靳彦文等应用恶性疟原虫 明小鼠来 检测质粒的分布，结果显示除肌肉注射部位外，其他组织在两天后均检测不到质粒 (靳彦文等 ,2001)。 粒 肉注射小鼠和兔子，注射后 24小时可在含血管 丰富的组织检测出质粒 2天后仅在骨髓、血液和注射部位肌肉中检出， 7天后只有注射部位肌肉中检出， 并 持续 8周 以上 。但通过静脉注射该质粒 脑和性腺外，其他的组织中均检出了较肌肉注射 量 低的质粒 射后 6 周在 6 只动物 中 仅检出 1 只有质粒 残留 （ . 1999）。 注小鼠，每次 100g， 反复 注射 6次， 6周后仅在接种处 检测到 质粒 12周和 16周时均未发现质粒 粒 肉注射 小鼠和兔子，分别于 30d、 60d 提基因组，采用能检测出一个质粒拷贝的高灵敏度 检测质粒 果每 150,000 个基因组 中 的质粒0 个拷贝 。 许多研究证明质粒 在组织分布上静脉注射 肌肉注射 皮下注射，这可能是血液循环的便捷为质粒的分布提供了方便，另外，皮肤固有组织限制了质粒的扩散，从而导致了这种分布上的差异性；在停留时间上则是静脉注射 含的 列大小不同，同样剂量的重组 质粒含有的具有的免疫刺激活性的 可能是不同质粒和不同剂量 异的主要原因。 近年来众多学者研究的热点 ， 已 被 证明是一种 新型 免疫佐剂 ， 可以激活 多 种免疫细胞 (1997)，包括 B 细胞、巨噬细胞和 胞，使淋巴细胞的代谢、形态发生一系列变化，进 而 转化为淋巴母 细胞，这一特性可以作为细胞免疫的一个测定指标。 色法是 用于检测细胞 的 增殖和活性 的一种方法 ，可直接检测活细胞数量及活细胞代谢强度。其原理是细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物，在该酶催化下 成蓝色的甲臢结晶。由于琥珀酸脱氢酶只存在于活细胞中，死细胞不能引起这种 生化反应 。加之甲臢结晶生成量与此酶活性或细胞代谢成正比，所以结晶形成数目的多 少 与活细胞数目及细胞活化状态呈正相关。结晶沉积于细胞中，经溶解剂 解 后显 色，在 570长具有最高吸收值，吸收值大小可反映细胞的数量及活性。 本实验正是利用 淋巴细胞转化的特性，结合 判断 重组质粒对培养的淋巴 细胞活力 和增殖能力的影响来筛选重组质粒， 其结果 应 是可靠的。 由于 重组质粒 是以质粒的形式来进行细胞转化试验的，与常见的刺激原如 物血凝素和刀豆蛋白等的作用方式不一样，尤其是 入细胞的机制首先是质粒被细胞吞噬或胞饮，进入细胞后通常通过几种途径被转运到溶酶体中，如吞饮、受体介导和有外来物质引起细胞凋亡后的主动保护性吸收而进入酸性环境的溶酶体中，然后与 体相结合，从而激活特异性和非特异性免疫应答信号通路。所以在进行具体 的应用研究时必须考虑到这些因素，才能确保 好地发挥它们的生物学功能。 在进行 物体内、外试验时，在追求高的免疫刺激效果的同时，要尽可能降低质粒的使用量，以期在降低使用成本的同时降低质粒进入动物机体后引起的安全性隐患，所以选中国农业科学院硕士学位论文 第二章 对猪具有最佳免疫刺激活性的 组质粒的筛选 15 择合适的剂量和高刺激活性的重组质粒是达到这一目标的必要条件。当然，重组质粒进行动物机体的的安全性不只受剂量的影响，还与其在体内的停留时间、免疫反应等诸多因素有关，有待我们进一步研究。 中国农业科学院硕士学位论文 第三章 重组质粒 猪体内的停留时间试验 16 第三章 重组质粒 内的停留时间试验 摘要 ：为了检测富含 将重组质粒通过肌肉途径注射入试验猪体内， 剂量为 500g/猪，同时设生理盐水对照组。定期宰杀试验猪，取其血、心、肝、脾、肺、肾和注射点肌肉，提取 基因组 法检测重组质粒在猪各个组织内的分布和停留时间，结果显示：注射 h 可在猪注射部位肌肉被检测到，4头 猪 的血和注射点肌肉可被检测到； 8天后，任何组织都检测 不 到重组质粒的存在。 关键词 重组质粒；总 布和停留时间 由于重组疫苗的快速发展，许多重组疫苗已经具有了很强的应用价值并显示了诱人的商业前景，但是人们终究还是考虑到它们的生物安全性问题，因此临床前的安全性评价显得尤为重要。本研究将第二章筛选出的对猪具有最佳刺激活性的重组质粒 500g/头的剂量 注射到 试验猪 体内 ， 采集 注射后不同时期的不同组织提取总 据载体和目的基因的核酸序列，设计引物 ，通过对延伸时间、退火温度和反应体系的摸索和优化，最终建立 测体系。最后以提取的组织 行 以确定重组质粒 在猪体内的分布和停留时间。 1 材料与方法 料 组质粒 863课题组（ 2001建并 保存 ，为第二章中筛选的对猪具有免疫刺激作用的重组质粒。 验动物 杜长大三元杂交猪， 7日龄左右，体重 2计 11头，其中公猪 6头，母猪 5头。 剂 购 自北京化学试剂公司，为分析纯； 仿、异戊醇 ,购自北京双翔达生化试剂公司； ： ：购自 自大连宝生物工程公司； 大连宝生物工程公司合成； 括 10 购自大连宝生物工程公司 中国农业科学院硕士学位论文 第三章 重组质粒 猪体内的停留时间试验 17 器： 电泳仪： 北京六一厂产品； 凝胶成像分析仪： 购自 上海天能公司。 液配制： 细胞裂解液： 10 （ m/v) 用灭菌的 双蒸水 配制 3取醋酸钠 00 法 组质粒 射 试验猪 用琼脂糖凝胶电泳分析方法 结合标准的 质粒 行定量， 并用无菌 生理盐 水 稀释 至终 浓度为 机选取 11 头猪中的 1头作阴性对照， 臀部 肌肉注射生理盐水 600l，其余 10头 猪 分别注射 00l（相当于 500，对注 射点进行标记 。实验猪继续常规饲养 ，每天进行两次观察猪的行为、被毛、神经症状、饮食、饮水，体重变化等。 组织 基因组 提取 分别于重组质粒 射后第 4h、 4d、 8d、 15d、 30d 各取两头实验猪，心脏无菌采血后屠宰，依次取其心、肝、脾、肺、肾、注射点肌肉，注意避免组织间交叉污染。血液采用反复冻融的方法， 3,000心后收集白细胞 100l 于无菌 分剪碎猪组织后，各取 中 ， 每管 中 加入 500l 细胞裂解液，再分别加入 （使终浓度为 20g/和 （使终浓度为 100g/ 55 孵育至组织完全消化，其间轻轻混匀几次 ， 然后 每管中 各加 600l 饱和平衡酚，充分混匀后静置分层， 10,000g 离心 10用阔头 心吸取 400饱和平衡酚再抽提一次 ， 小心吸取上清200l，用等体积氯仿抽提以去除残留的苯酚。上清加入终浓度为 倍体积的无水乙醇，混匀后 以 10,0000去上清。沉淀用 70酒精洗涤一次，待残留酒 精完全挥发后，各加 100至 基因组 ， 中国农业科学院硕士学位论文 第三章 重组质粒 猪体内的停留时间试验 18 物设计 根据重组质 粒 别设计出 六条引物 。 正向引物： a、 5 b、 5 C c、 5 C 反向引物： d、 5 e、 5 f、 5 感度 方法 的建立 在 1 肌肉 基因组 别加入 剂量为 100101当于 300 个拷贝）已纯化 的质粒 择 比较接近的正、反向引物各一条，据其 和扩增目的片段的大小，确定反应程序中的退火温度和延伸时间，并按照下述的通过琼脂糖凝胶电泳分析，以确定出最敏感的反应体系和条件。 10 l 1 l（相当于浓度为 400） 正 向引物： 当于浓度为 800） 反向引物： 当于浓度为 800） 模板： 1 l（相当于 1 l（相当于 1U） 用灭菌的 双蒸水 补至 25l 950s（第一次循环为 5， 520s， 72 0后一次循环为 10共 30 个循环。 琼脂糖凝胶进行电泳分析，电泳上样量为 10l，电压 90v， 紫外光下进行观察，以扩增出目的片段为准，确定检出存在于 含量最低的重组质粒 。用 扩增出的目的片段特异性强的引物以及所对应的 立最佳的 中国农业科学院硕士学位论文 第三章 重组质粒 猪体内的停留时间试验 19 法检测残留的质粒 用 脂糖凝胶电泳分析方法对不同组织的 ，调整浓度至 1g/l。以此来做模板，然后按前面建立的 扩增产物用上述方法进行分析，观察有无目的片段。出现肉眼可见的目的片段为阳性结果， 并以此 来确定 重组质粒在情况。 2 结果 2.1 取结果 按照上述方法进行猪 体 各组织 到的 子量大小一致，稍大于 23同组织所提取的 、脾、肺、肾等组织产量比较高，而心、肌、血产量稍低。所有实验猪的 选一 张电泳图片以示 说明（见图 2） 图 2 猪 组织器官基因组 脂糖凝胶电泳图 he of of 感度 通过一条正向和一条反向引物相互配成 6 对引物，根据每对引物的 和扩增的目的片段来确定反应时的退火温度和延伸时间，比较其检测的 敏感性和特异性。结果显示：正向引物 a、5 和反向引物 f、 5 的敏感性和特异性最好，退火温度为 54伸时间为 120s，扩增出的目的片段 大小 为 感度为可 在 1 2500拷贝）（见图 3）。 9416557 2 3 4 5 6 7 M 2313036132202764bp 国农业科学院硕士学位论文 第三章 重组质粒 猪体内的停留时间试验 20 粒 猪体内存留时间和分布 应用建立的敏感度和特异性最好的 法，对实验猪的所有 行 测。结果显示：注射重组质粒 h，可在两头猪的注射点肌肉 扩增出 小的目的片段，其余组织 未扩增出目的片段。说明注射重组质粒 4h，注射点肌肉有质粒存在，其余组织没有质粒存在（见图 4）。 在注射重组质粒 第 4d，两头猪中的一头的注射点肌肉和血液的 扩增出了 目的片段，其余组织均为阴性结果。说明在注射质粒 4d 天后，除注射点肌肉外血液中也会有质粒存在（见图 5）。 在注射重组质粒 第 8d、 15d、 30d 所取的 5 头实验猪（饲养过程中有 1 头死亡， 30d 为 1 头猪）的所有 组织 未扩增出目的片段，检测不 到重组 质粒。 8d 以后检测结果相同，仅 选 8d 的图片以示说明（见图 6） 。 猪肌肉注射重组质 粒 粒在各组织的分布和存留时间见表 2。 图 3 应 敏感度 he of CR . 1002. 103. 14. 5. 6. 1M. 2322 2 3 4 5 6 M 23130557416361027物 中国农业科学院硕士学位论文 第三章 重组质粒 猪体