【毕业学位论文】（Word原稿）溶磷高效菌株筛选鉴定及其溶磷作用研究微生物学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 溶磷高效菌株筛选鉴定及其溶磷作用研究 要 从 江苏、湖南、重庆、云南等地土壤样品 筛选溶磷菌，对溶 磷 效果较好的菌株进 行鉴定 ， 并对其溶解难溶磷能力 、磷矿石施用效果 、促进 作物生长 和 磷素吸收的作用， 进行了较为系统的研究。 以期为溶磷微生物肥料的开发应用提供优良菌株，提高磷矿粉的利用率、减少有效磷的固定化，为改善土壤磷素营养提供有效的生物学途径。 取得以下主要结果： 经筛选得到 7 株溶磷效果较好的细菌， 结合生理生化和 16S 列分析对菌株进行鉴定，菌株 别 属于成团肠杆菌（ 成团泛菌（ 草生欧文氏菌菠萝 变种（ 费氏柠檬酸杆菌（ 猪霍乱沙门氏菌萨拉姆亚种（ 菌株 寡养单胞菌属（ 。 用液体摇瓶法研究 7 株溶磷菌对不同难溶磷源的溶解能力，菌株 13 种难溶磷源均具有不同程度的溶解 效果 ，而其它 5 株溶磷菌仅能溶解几种磷矿石。菌株 肥东、连云港、晋宁等地磷矿石的溶解能力最强；菌株 较好的溶解开阳、浏阳磷矿石 。 所有 7 株溶磷菌中，有 6 株 溶解磷酸三钙和羟基磷灰石的效果 5 较好 ，仅一株 羟基磷灰石的溶解效果较差 ，但能强烈的溶解磷酸锌 。 7 株溶磷菌 显示 较强的溶磷能力，对难溶磷源存在溶磷特异性 ，菌株 47 具有较广的 “ 溶磷谱 ” ， 。 在液体摇瓶条件下 溶磷菌 溶磷能力受碳源、氮源 、培养时间 的影响。以昆阳磷矿石为磷源，溶磷菌 磷最佳氮源分别为尿素、硫酸铵，最佳碳源为 葡萄糖 ， 而果糖 不适宜作为菌株 溶磷的 碳源 ； 菌株 磷酸三钙中释放出有效 磷量随培养时间的延长而增加。 菌株 灭菌土和非灭菌土中均能够转化土壤难溶磷 。 非灭菌土接种处理转化土壤难溶磷的效果好于灭菌土接种处理 。 当土壤中施 入 开阳和锦屏磷矿石时，溶磷菌 47可以提高土壤有效磷含量；而 施 用 晋宁磷矿粉时，溶磷菌 转化难溶磷的效果不理想，说明在土壤条件下溶磷菌对难溶磷的转化存在选择性，接 种 溶磷菌对 玉米 植株的生长 和磷素的吸收 有明显的促进作用。 关键词： 溶磷菌 ， 鉴定 ， 溶磷能力 ， 有效磷 ， 土壤 in on in in to is as of to in to 6S 31 is 32 In 47 in at in 31 36 is of of 41, . In a of 21 31 by in by 21 31 in is 21 31,21, is 21, as 21, in in of is in in 21, in is of of 录 第一章 文献综述 . 1 素营养对植物生长的重要性 . 1 壤中磷的形态 . 1 壤有机磷 . 1 壤无机磷 . 2 在土壤中的转化（吸附、固定） . 2 生物对磷的转化 . 2 矿概述及磷矿粉的肥效 . 3 磷微生物 . 4 菌的溶磷作用 . 4 菌的溶磷作用 . 5 磷微生物研究和应用 . 6 磷微生物的溶磷机理 . 7 究的目的、意义及研究内容 . 9 究的目的和意义 . 9 研究的主要内容 . 9 术路线 . 9 第二章 溶磷菌的分离与筛选 . 11 料与方法 . 11 壤来源 . 11 养基 . 11 试难溶磷酸盐 . 12 生物结构分析与溶磷菌的分离 . 12 液的制备 . 12 磷菌的初筛 . 12 磷菌的复筛 . 12 磷菌对难溶磷酸盐溶解效果测定 . 12 定方法与数据处理 . 12 果与讨论 . 13 壤样品中微生物结构分析 . 13 磷菌的初筛 . 13 磷菌的复筛 . 15 磷菌对难溶磷酸盐溶解效果 . 18 结 . 19 V 第三章 高效溶磷菌株鉴定 . 20 料与方法 . 20 试菌株的形态观察与革兰氏染色 . 20 理生化实验测定项目及鉴定方法 . 20 6S 列分析 . 22 果与讨论 . 22 落形态观察 . 22 株生理生化特征 . 23 6S 列分析结果 . 25 磷菌株鉴定结果 . 27 论 . 28 第四章 溶磷菌对难溶磷源溶解效果研究 . 29 料与方法 . 29 养基 . 29 试磷源 . 29 试菌株及菌液制备 . 30 磷菌对难溶磷酸盐溶解效果测定 . 30 磷菌对磷矿石溶解效果测定 . 30 定项目及分析方法 . 30 果与分析 . 30 磷菌对难溶磷酸盐溶解效果 . 30 磷菌对磷矿石溶磷效果 . 32 论 . 37 结 . 37 第五章 高效溶磷菌室内 溶磷条件研究 . 39 料与方法 . 39 养基与供试菌株 . 39 试氮源、碳源、磷源 . 39 液制备 . 39 同氮源对溶磷菌株溶磷能力的影响 . 39 同碳源对溶磷菌株溶磷能力的影响 . 39 同培养时间对溶磷菌株溶磷能力的影响 . 40 定方法与数据分析方法 . 40 果与分析 . 40 同氮源对溶磷菌株溶磷能力的影响 . 40 同碳源对溶磷菌株溶磷能力的影响 . 40 不同培养时间对溶磷菌株溶磷能力的影响 . 41 论 . 44 结 . 44 第六章 三株溶磷菌土壤溶磷效果研究 . 45 料与方法 . 45 试菌株与培养基 . 45 试土壤与磷矿石 . 45 试种子与实验用盆 . 45 磷菌剂制备 . 45 效溶磷菌对土壤难溶磷的溶解效果 . 46 同磷矿粉和高效溶磷菌对土壤有效磷和植株全磷的影响 . 46 定项目与测定方法 . 46 果与分析 . 46 效溶磷菌对土壤难溶磷的溶解效果 . 46 加磷矿粉条件下土壤中有效磷的变化 . 47 加磷矿粉条件下接种溶磷菌 玉米植株全磷含量的影响 . 47 加 4 种磷矿粉条件下接种溶磷菌对玉米植株与根的干重和鲜重的影响 . 49 结 . 53 第七章 全文结论 . 54 论 . 54 究展望 . 55 参考文献 . 56 附录 . 65 致谢 . 67 作者简历 . 68 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 磷微生物 基磷灰石 d 落直径 D 磷圈直径 矿石 基对 磷酸脱氧核糖核酸 合酶链式反应 合酶 物 物 计分析系统软件 会科学统计软件包 P ） 溶磷量 S P 磷率 名 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 磷是植物生长发育所必需营养元素之一，我国有 74%的耕地土壤缺磷。土壤中 95%以上的磷为难溶形态，植物很难吸收利用，施入的磷肥当季植物利用率为 5% 25%。而磷肥施入土壤后很快 90%左右被土壤化学固定，形成溶解性极低的磷酸钙、铁、铝等化合物。 增施磷肥是一种“高投入，低产出”的途径， 不仅造成了磷素资源的大量浪费，严重影响了磷肥工业的可持续发展，而且经济效 益 下降，环境污染加重 。同时，我国的磷肥资源 匮乏 ，生产能力难以满足需 求 ，每年需 进口磷肥约 300 万吨（纯 （ 中国化工信息中 心 ,1998; 李家康 , 2003） 。 因此，提高磷肥的利用效率，增强土壤磷素的活化与利用，恢复和保持土壤健康功能成为科学研究的重要任务。溶磷微生物广泛分布于土壤，是一类能改 进 磷肥固定、提高磷肥利用率和溶解土壤难溶磷的微生物群，已经被世界公认为廉价高效的环保型的土壤磷活化的生物措施。利用溶磷微生物提高磷肥的有效性和土壤难溶磷的利用率、减少磷肥投入、发挥我国有限磷矿的增产作用和农业持续发展意义重大。 素营养对植物生长的重要性 磷是植物生长必需的三大营养元素之一， 在植物体内的含量相差很大，约为干物质的 而大多数作物为 在植物体内，磷主要存在于核酸、磷脂和核素等成 份 中，核酸是细胞核的主要 成份 ，磷质是原生质体的重要 成份 ，缺少磷就要影响到细胞的分裂和植物的生长发育，特别影响植物的分生组织（陈瑞泰等 ,1987）。磷还能促进植物体内糖类化合物的运输和淀粉的转化，对油脂形成有 重要意义 ， 对于光合作用、呼吸作用、脂肪代谢、氮代谢等都是 不可或缺的 （刘世亮 ,2002; 刘世亮 ,2003）。 磷的营养生理功能有 以下 几个方面： 1、磷是作物体内重要有机化合物的组 份 。是 脂、核苷酸、 要成 份 。 遗 传信息的载体，又是生命活动的中心。在植物的个体发育、繁殖、遗传 和变异等生命活动过程中起着非常重要的作用。磷脂是生物膜的主要成 份 ，具有多种选择性功能，是生命活动正常进行的重要屏障，对植物与外界物质、能量和信息交流有控制和调节作用； 2、磷参与碳水化合物的代谢 ； 3、 光合作用和磷酸化以及脂肪代谢必须有磷参加 ； 4、促进氮素的代谢，有利于植物体内硝态氮的转化与利用 ； 5、促进脂肪代谢，在糖转化为甘油和脂肪酸的过程以及后两者合成脂肪时均需要磷的参与才能进行 ； 6、磷参与生物与生物体内的信号传导 ； 7、提高作物抗逆性（陆景陵 ,1994）。 壤中磷的形态 土壤中磷的形态分为有机态磷和无机态磷，其中无机态磷 分为矿物磷、吸附态磷、水溶液中的磷（范丙全 ,2001）。 壤有机磷 有机磷占土壤中全磷的 20% 80%，其中 50%是磷酸肌醇（ 2 50%）、磷脂（ 1%）、核酸（ 3%）中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 2 和少量磷蛋白、磷酸糖。另外 50%在形态和性质上还不甚清楚。土壤有机磷中 5 10%的量是存在于 生物体内， 30 50%是以植酸钙、 植酸 镁形态存在的。 壤无机磷 土壤中无机磷的含量约占全磷的 1/2 1/3。土 壤中无机磷的形态主要有原生矿物和次生矿物二种类型。原生矿物有 200 多种，主 是 要有磷灰石，其主要成份为钙氟磷灰石和氢氧磷灰石。次生矿物主要是指化合态即沉淀态的磷酸盐，它可分为闭蓄态和非闭蓄态二种类型。必蓄态磷指磷酸铁和磷酸铝被氧化铁胶膜所包蔽，其活性低，供磷能力弱。晶形的粉红磷铁矿也是土壤中的必蓄态磷。非必蓄态磷酸盐包括磷酸铝、磷酸铁、磷酸三钙三种形态。它们在一定的条件下可逐渐释放出来。在我国南方的砖红壤中，非必蓄态的磷以磷酸铁为主，磷酸铝和钙盐较少，而必蓄态的磷酸盐占无机磷量的 80%。在北方黄壤中，非必蓄态 的磷酸钙占无机磷量的 60 85%，磷的铁和铝盐极少 （ 5%） （钟传青 ,2004）。 在土壤中的转化（吸附、固定） 磷酸根化学性质活泼，磷肥施入土壤后能很快与土壤中的其它成份发生反应，形成 难溶 磷酸盐 ， 使植物对其利用的有效性随时间延长而降低，最终以 难溶 磷酸盐或吸附态形式滞留于土壤中，难以被植物直接吸收利用。磷在土壤中的固定途径主要有： 1、铁、铝化合物对有效磷的吸附和固定； 2、钙、镁化合物对磷的固定； 3、磷酸钙表面对磷酸根的吸附； 4、粘土矿物对磷酸根的吸附。（ 1985）把不同类型 土壤中磷的固定作了一个归纳，如图 1示。 图 1同类型土壤中磷的固定 of in of 微生物对磷的转化 生物转化的方式一种是生物依靠自身形成的适应机制，另一种是由微生物的代谢活动所引起的。土壤中许多微生物都具有不同程度的溶磷能力，溶磷微生物能够依靠自身的代谢产物或 与 其它 生物协同溶解土壤中的难溶无机磷，这些微生物可以通过活化难溶磷提高土壤中有效磷的含量和分泌生长素等 物质刺激植物生长。由于微生物的参与，磷在地表生物圈内发生如图 1示的中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 3 循环。 磷的地球生物化学循环过程主要包括： a、 植物根系分泌物和微生物的溶解作用或其它作用释放出磷酸二根离子； b、 植物、微生物、动物合成有机磷化合物； c、 微生物分解动植物残体中的有机磷化合物； d、 土壤成份对无机磷或有机磷化合物的固定。磷的地球生物化学循环是典型的不完全循环，其中磷生物小循环又极为不活跃，加强磷生物小循环就可以减弱磷地球化学大循环，进而就能缓解土壤缺磷、磷矿资源衰竭以及水体富 营养 化等环境污染问题。 图 1球生物圈中磷元素的循环 of 磷矿 概述及磷矿粉的肥效 磷矿最早是于 19 世纪 50 年代在欧洲发现的。据估计，在地球磷的总储量中，存在于陆地上的磷（ P）大约为 960 1600 亿吨，海洋中磷总量为 800 亿吨，其中以磷矿形式的储存量估计为190 亿吨磷（ 978）。中国磷矿资源的总资源量约为 200 亿吨，第一个发现的磷矿是于 1919年发现的江苏锦屏磷矿，属于元古代 的变质磷块的发现， 其发现 使 我国 化学磷肥 工业得到迅速发展。 我国磷矿资源极其丰富，居世界第四位，主要集中于西南部和中南部，并以海相沉积型磷块岩为主几乎全部为地台型其余如变质岩磷矿、岩浆岩型磷矿、鸟粪磷矿等约占 ，但大多数属于中低品位磷块岩（李庆逵等 ,1992）。 磷的有效 是一个物理化学问题。土壤中的磷归根到底来源于各种难分解的磷灰石，在长期风化过程中生