【毕业学位论文】（Word原稿）亚洲棉（Gossypium arboreum L.）石系亚1号耐旱相关基因的克隆生物化学与分子生物学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 亚洲棉 （ .） 石系亚 1 号耐旱相关基因的克隆 (.) (.) I 摘 要 干旱是影响植物优良遗传特性充分表达的主要逆境因子之一 ， 大部分中国棉花种植区域水资源紧缺，建立稳定有效的耐旱评价及鉴定标准，开展棉花耐旱性研究，选育和培育耐旱品种对棉花生产具有重要意义。 本实验 分别选用 8 个陆地棉、 2 个海岛棉、 2 个亚洲棉品种作为材料进行耐旱水平试验， 建立了 采用 定的快速棉花幼苗耐旱性评价体系 ： 3 6 片真叶的棉花幼苗为材料 ，在 7%（ W/V）时， 12 h 连续处理后 棉花幼苗的成活率与田间旱棚鉴定结果有较高的一致性。 此方法简单、快速，易操作，基本可用于棉花品种的耐旱性评价与鉴定工作，并将为棉花耐旱分子生物学研究奠定基础， 与传统的鉴定方法结合， 会 提高对棉花耐旱资源筛选和育种工作的效率。 亚洲棉石系亚 1 号本论文耐旱水平试验中，鉴定结果为抗旱水平（成活率 85%） 。 在 前期 已经摸索出的 胁迫条件 （ 液浓度为 17%） 下， 1 5h 内 诱导耐旱相关基因的 充分 表达 ,利用 法克隆亚洲棉石系亚 1 号 耐旱基因 ， 分离到亚洲棉三个耐旱相关基因： 质和叶绿体 因的中间保守区片段， 通过 术，得到了亚洲棉胞质和叶绿体因的全长序列，已提交数据库注册，分别命名为 对核酸和蛋白序列进行了比对与分析 之后 ， 在 17%理 0、 1、 2、 3、 4、 5h 后的材料的 模板，内参引物的 选择： 198 开展上述基因的半定量初步研究了在旱胁迫下的表达规律。 结果显示在 0-5 h 胁迫的范围内： 因的表达量随着时间的增长不断上升； 表达量始终保持恒定，几乎没有变化；而 2 h 时显著低于 1 h，而后逐步增加。结果 与 同时期 活变化曲线与检测到的 表达量的动态变化一致。 根据初步表达规律分析的结果， 构建了 由 35s 和 动子驱动的 组成型和 旱诱导型的因植物表达载体 测得到的阳性克隆现已转入农杆菌用于下一步的植物遗传转化，验证基因功能。 关键词 石系亚 1 号 耐旱 克隆 is of of of in of of it is to a to of it is in 2 as to EG 67%(W/V) 2, EG be to of in EG is be to of in on In is in 80%). 5 by 7%(W/V) we 5u/u/we of In to in to of 3 6 7%(W/V) , 1, 2, 3, 4, 5 h of 198 5CS at up by s is to OD 7%(W/V) of 5s by CR in to 录 第一章 引言 . 1 物耐旱性研究概况 . 1 内外植物吡咯啉 研究进展 . 8 内外植物超氧化物歧化酶（ 研究进展 . 9 物抗逆基因分离策略 . 12 研究目的和意义 . 14 验技术路线 . 15 第二章 棉花幼苗耐旱性 迫评价方法的研究 . 16 验材料 . 16 验方法 . 17 验结果 与分析 . 17 论与 讨论 . 21 第三章 亚洲棉耐旱相关基因的克隆及序列分析 . 22 验材料 . 22 验方法 . 22 验结果与分析 . 31 论与 讨论 . 46 第四章 耐旱相关基因旱胁迫表达分 析及植物表达载体的构建 . 48 验材料 . 48 验方法 . 49 验结果与分析 . 51 论与 讨论 . 53 第五章 结论 . 56 文结论 . 56 究展望与预期结果 . 56 参考文献 . 58 附录 . 63 致 谢 . 错误 !未定义书签。 作者简历 . 69 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文全称 基对 六烷基三乙基溴化铵 二胺四乙酸 丙基 那霉素 B 培养基 鼠白血病病毒 国国家植物基因组计划 密度 乙二醇 合酶链反应 乙烯吡咯烷酮 分钟转速 NA 热水生菌 合酶 冲液 羟甲基氨基乙烷 43中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引言 物耐旱性 研究概况 干旱是影响植物优良遗传特性充分表达的主要逆境因子之一，筛选与培育优质耐旱种质资源始终是农业研究的重要课题 (陈立松等， 1997； J 等， 1984； K 等， 2002)。 20世纪 80 年代以来，植物耐旱生理和育种学者围绕植物耐旱性评价、鉴定指标体系的建立进行了较多探索，研究对象主要是农作物如小麦（ S 等， 1998）、大麦（ 等， 2001）、玉米（ 等， 1993）、高粱（ 1998）以及部分蔬菜作物如芸苔、芥菜（ J 等 ， 1984）等，而园林植物中有草坪草（ 吴志华等， 2002） 的报道。 由于全球淡水资源越来越紧张，并且就中国的大部分棉花种植区域来看，水资源紧缺是对棉花生长的一大问题。因此开展对棉花的耐旱研究，筛选稳定有效的耐旱鉴定指标，选育耐旱陆地棉品种具有重要的价值和意义。 旱性鉴定方法研究进展 作物常用的干旱鉴定方法有 田间鉴定法，人工控制干早胁迫法，生化鉴定法，分子生物学方法。 评价内容有植株形态指标如形态特性分级、株高、茎粗、根系、叶片 （气孔、蜡质）等；产量指标如作物产量、作物干旱敏感指数等；生理指标如种苗生活力、水分状况（叶片水势、相对含水量、渗透势、膨压等）、脯氨酸含量、脂质过氧化程度、抗氧化能力（含酶促和非酶促系统）等；综合指标如耐旱总级别值、耐旱性隶属函数值等。 田间鉴定法的 方法简单，所得结果比较可靠。但此法缺点是受季节限制，所需时间长 (尤其多点多年份的重复鉴定 )，工作量大、速度慢、 重复性差 。 人工控制干早胁迫法是人为的在幼苗生长期进行干旱处理，而后根据实验需要达到相应的干旱条件的一种方法。其重要包括反复干旱法和连续干旱法两种。 生化 鉴定法是用生理生化的方法进行耐旱性的研究，克服了田间品比试验周期长，重复性较差的不足。 国外苜蓿耐旱研究已近入分子水平。应用限制性片段长度多态性 (术对首稽抗早基因或与耐旱性密切相关的性状基因，进行定位。建立起 传连锁图。在抗旱鉴定时，用特定的 针便可容易地鉴别出抗 旱 基因的存在。目前国内相关研究进展缓慢，其主要的方法是：小分子有机物含量的测定法，保护酶系测定法等 (景蕊莲 等 ， 1999;张正斌等， 2002)。 生化鉴定法多用到的胁迫药剂就是聚乙二醇 (聚乙二醇是 一种 非离子长链惰 性化合物，在水中有很高的溶解度，是亲水性很强的大分子有机物 ， 溶于水后能产生强大的渗透压。分子量大于 4000 的 能被植物吸收 ， 对植物无害 ， 只是降低溶液中的水势。因此 ， 为渗透调节剂 ， 广泛用于植物耐旱性选择剂或水分胁迫剂。 我国棉花抗旱性鉴定多采用反复干旱法鉴定。目前使用 液 的生化 鉴定的条件还在摸索阶段。近年来 ， 利用分子生物学手段研究植物耐旱性时常用一定浓度的 液处理植株 ， 然后研究水分胁迫下的 异表达或旱激蛋白的合成等 ， 进而研究植物的耐旱机理。 1979 年首次以 诱导剂和筛选剂 筛选出耐旱的烟草中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 2 细胞系（ H 等， 1979） ;以后 ， 相继出现的研究成果有 :把细胞放在含有 培养基中选到了抗干旱的番茄细胞（ A 等， 1981） ;利用高粱种子经 导产生的愈伤组织为材料获得了耐旱性强的再生植株并且收获了种子（ H 等， 1981）。国内的研究也取得了一定进展 ， 用 3 种途径获得抗 迫而且抗性稳定的苜蓿细胞系（张志胜等， 1993， 1995） ， 以为耐旱性 选择剂初步获得耐旱性甘薯植株（ 刘秀莲 等， 2002）。 物耐旱机理研究进展 物形态结构特征对其耐旱机制的影响 根系 ： 植物根系是植物直接吸收水分的重要器官，它对植物的耐旱功能具有至关重要的作用。纵深发达的根系系统可使植物充分吸收利用贮存在土壤中的水分，使植物度过干旱期。一般认为抗旱性强的植物，根水势低，利于水分吸收。 叶片 ： 作为同化和蒸腾器官的叶片，在长期干旱胁迫下，叶片的形态结构会发生变化，其形态结构的改变与植物的耐旱性有着密切的关系 （ 韦梅琴 ， 2003） 。主要表现在：叶片表皮外壁有发达的角质层，角质层是一种类质膜，其主要功能是减少水分向大气散失，是植物水分蒸发的屏障。厚的角质层可提高植物的能量反射与降低蒸腾，从而增强植物的抗旱性；具有表皮毛，可以保护植物避免强光照射，减少蒸腾；具有大的栅栏组织 /海绵组织比和小的表面积 /体积比，发达的栅栏组织，分布于叶的背腹两面，可使干旱缺水植物萎蔫时减少机械损伤。而小的表面积 /体积比，可以最大程度减少水分丧失。 透调节 水分的缺乏可以导致农作物一系列的生理生化反应 ， 渗透胁迫信号转入胞内 ， 进入 细胞核后 ，通过顺式作用元件与反式作用因子的相互作用进行基因的转录调控及表达。渗透胁迫诱导基因的表达调控至少存在 4 条不同的途径 ， 其中 2 条依赖于 另外 2 条不依赖于 分胁迫条件下会积累有机分子相溶性溶质或渗压剂，有效地提高植物的渗透调节能力、增强植物的抗逆性。 1) 脱落酸与植物抗旱性 脱落酸 (植物五大类激素之一，大量的试验表明：当植物处于干旱、低温、盐碱、环境污染等不利环境下，植物体内脱落酸大量增加，使植物对不利环境产 生抗性。 20世纪 80 年代初人们就广泛承认，缺水时叶片合成的脱落酸通过韧皮部运到根部，促进根对水和离子的透性 ，所以 脱落酸能 促进根系对水和离子的吸收 。另外，脱落酸能促进芽的休眠，使生长速度下降，促进同化物质的积累，这些都可以减少蒸腾，提高植物保水能力， 尤其是脱落酸的增加和气孔的关闭一致，这对植物抗旱是非常有利的。 2) 甜菜碱与植物抗旱性 近年研究结果指出，甜菜碱可能是作为植物的主要渗透调节物质之一而对植物的抗旱性起作用。其依据是渗透胁迫条件下，植物体内的甜菜碱醛脱氧酶 (胆碱单氧化酶 (性中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 3 升高，这两种酶在高等植物中，具有将胆碱氧化为甜菜碱的作用，并在细胞质中积累甜菜碱，甜菜碱的积累能够保持细胞与外界环境的渗透平衡和稳定复合蛋白四级结构，从而提高植物对干旱胁迫的适应性。因此， (1998)认为：在受到干旱胁迫的细胞中，甜菜碱似乎是起到一种低分子量分子伴侣的作用，稳定 化酶的构象并使其处于功能状态，部分抵消了干旱的胁迫。 3) 脯氨酸与植物抗旱性 在有机溶质中能够理想地起到渗透调节作用的化合物很少 ， 因为渗透调节物质要具备以下的特征 :分子量小 ， 极易溶于水 ； 在生 理 范围内必须不带净电荷 ;必须能被细胞膜所保持 ， 引起酶结构变化小 ， 生成迅速 ， 而且能够积累到足以引起调节作用的量。在维管植物中 ， 脯氨酸和甜菜碱是比较理想的。 脯氨酸积累是植物为了对抗干旱胁迫而采取的一种保护性措施 ， 脯氨酸可能是一有用的干旱伤害传感器 (在正常情况下，mg重，占总游离氨基酸的百分之几，而在干旱条件下，脯氨酸可成 10 倍地增加，占总游离氨基酸的 30。 如高粱在严重缺水条件下 ， 叶组织中脯氨酸含量增加了 108 倍 ， 占游离脯氨酸的 60%。由此可见 ， 脯氨酸作为渗透调节物质在渗透胁迫条件下起到了重要的作用 ， 并且脯氨酸还可以作为无毒氮源、呼吸底物 ， 参与叶绿素的合成。脯氨酸既具有亲水部分 ， 也具有亲脂部分 ， 能形成一些类似于亲水胶体的聚合物 ， 对细胞内结构具有保护作用 ， 因此 ， 脯氨酸不会与蛋白质分子内部的疏水基团相互作用导致蛋白变性。 992)发现，轻度水分胁迫，苜蓿根瘤组织积累较多的脯氨酸，并认为脯氨酸可保护蛋白质在水分胁迫下的不变性脯氢酸亲水基与蛋白质亲水基相互作用使蛋白质稳定性提高，乃至严重水分胁迫下苜蓿 根瘤代谢酶和结构蛋白质可能会受积累的脯氨酸的保护，减轻严重干旱对组织的危害程度。水分胁迫下脯氨酸的积累一方面增强了植物的渗透调节作用，使组织的抗脱水力加大；另一方面脯氨酸的偶极性保护丁膜蛋白结构的完整性，同时增强了膜的柔韧性。同时，脯氨酸还有作为自由基清除剂，调节细胞质 止酶变性，防止细胞质酸化的作用。 孔蛋白与植物抗旱性 水孔蛋白是植物体中水分跨膜运输的主要途径。是作为跨膜通道的主嵌人蛋白 (族中有运输水分功能的一类蛋白质 。水孔蛋白、 H+/ H+反向运输蛋白在调节细胞水势和胞内盐离子分布中起信号导作用。植物体可以通过调控水孔蛋白等膜蛋白以加强细胞与环境的信息交流和物质交换，改变膜对水分的通透性，实现渗透调节，以增强植物的抗旱、耐盐能力 。 性氧清除 在高等植物的正常代谢过程中，活性氧可通过多条途径产生。例如，在电子传递的过程中，当电子传递到分子氧上时，随之产生活跃且具有毒性的活性氧 粒体、过氧化物体等均可产生活性氧。其中对叶绿体活性氧的产生机制了解得最为清楚。叶绿体是光合作用的细胞器，在 电子传 递过程中，光合电子可通过末端氧化酶将 02 光氧化还原为超氧化物，并通过 士学位论文 第一章 引言 4 的电子循环或类囊体扩散至基质表面，在这里发生酶促歧化反应生成 者在 存在下通过 应生成 和 02 可能促进 02 在逆境胁迫下，活性氧自由基的产生能力增强，特别是 02成量持续增大。而这些自由基又可以与 生 应，生成更多的活性氧自由基 分胁迫时，产生活性氧，对细胞造成损伤，具体表 现在 4 个方面： 活性氧能与酶的巯基或色氨酸残基反应，导致酶失活； 活性氧会破坏核酸结构，攻击核酸碱基，使嘌呤碱和嘧啶碱结构变化，导致变异出现或变异的积累； 蛋白质合成的信息，由于活性氧对 制过程的损伤，从而妨碍蛋白质合成； 启动膜脂过氧化反应，使维持细胞区域化的膜系统受损或瓦解。大量的研究实验表明，植物体内广泛存在的抗氧化酶系统 (超氧化物歧化酶 氧化氢酶 氧化物酶 )能有效清除活性氧，保证细胞正常的生理功能，维持其对干旱胁迫的抗性。有研究表明，耐旱植物在逆境条件下能使保护 酶活力维持在一个较高水平，有利于清除自由基，降低膜脂过氧化水平，从而减轻膜伤害程度。 白与植物抗旱性 白 (指胚胎发生后期种子中大量积累的一系列蛋白质。 白广泛存在于高等植物中。在植物个体发育的其他阶段，也能因 脱水诱导而在其他组织中高水平表达。一般认为， 白在植物细胞中具有保护生物大分子，维持特定细胞结构，缓解干旱、盐、寒等环境胁迫的作用。 白大多是高度亲水 的。高度亲水性有利于 白在植物受到干旱而失水时，能够部分替代水分子，蛋白质的多羟基能保持细胞液处于溶解状态，从而避免细胞结构的塌陷，稳定细胞结构，尤其是膜结构。在干旱脱水过程中细胞液的离子浓度会迅速升高，高强度的离子浓度会造成细胞的不可逆伤害。 物耐旱相关基因的研究进展 了解植物适应干旱胁迫的分子机理有利于开展抗旱基因工程研究，对提高植物抗旱能力，促进农业生产的发展具有非常重要的意义。 物 耐 旱关键基因的克隆 1) 甜菜碱合成相关基因 由于甜菜碱的合成途径比较简单 ， 且已证明甜菜碱合成后几乎不再被进一步代谢 ， 属于永久性或半永久性渗透调节剂 ， 因此甜菜碱被认为是最有希望的渗透保护剂之一 ， 在植物抗盐、抗旱研究中已越来越受到重视。 乙 酰 胆 碱 由 胆 碱 单 加 氧 酶 ( 或 胆 碱 脱 氢 酶( 甜菜碱醛脱氢酶 (步催化合成甜菜碱。现已在菠菜、甜菜、山菠菜中成功克隆出 因，从烟草中克隆出 因，从甜菜、菠菜、山菠菜、大麦、水稻及木本植物海榄雌中克隆出 因。此外，乙酰胆碱氧化酶 (为可以把乙酰胆碱一步合成甜菜碱而日益受到中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 5 人们的关注。目前， 因已从水稻、拟南芥中成功克隆。 (1998)用编码 因转化水稻，获得两种分别在细胞的两个不同部位表达的乙酰胆碱氧化酶转化株，这两种转化株的耐盐、抗旱以及耐低温的能力均有所增强。 2） 海藻糖合成酶基因 因和 藻糖和甘露醇、甜菜碱、氨基酸等一样 ， 是细胞渗透调节时产 生的重要相容性物质之一。高等植物一般都不能合成海藻糖 ， 只有极少数极端耐旱的复苏植物以及能忍受完全干旱的昆虫、细菌、酵母等生物体中才发现大量的海藻糖 ， 对生物体起着抗逆保护作用。海藻糖合成酶为一多酶体系 ， 它们是受干旱、高盐、重金属离子污染等胁迫诱导而表达的基因。目前已从细菌、真菌、耐受干旱的高等植物中克隆出了海藻糖合成酶基因。 3） 脯氨酸合成酶基因族 在高等植物中，脯氨酸的合成是通过 2 条途径 ， 即谷氨酸途径和鸟氨酸途径，随后通过对细菌营养缺陷型的互补试验由谷氨酸和鸟氨酸均可合成脯氨酸。这 2 条途径在不同的生理状态 下表现不同。在渗透胁迫或氮素缺乏时 ， 谷氨酸途径要比鸟氨酸途径更具有优势，是合成脯氨酸的主要途径；鸟氨酸途径主要在高氮情况下合成脯氨酸。 谷氨酸通过两步连续的还原反应可合成脯氨酸，其合成途径为：谷氨酸 谷氨酸 15 脯氨酸。 但是在植物体中一直没有分离到谷氨酰激酶 ( 也很难检测到 存在。 直到克隆到一种编码二氢吡咯 1 酶不仅具有活性 ， 也具有 活性 ， 即它是一个双功能酶。对 因 列分析表明 ， 它编码一个 73.2 多肽 ， 其 N 端与 源 ， 而 C 端却与 源。 催化谷氨酸合成途径 第一步反应的酶 即 为 1 一二氢吡咯 产物 谷氨酸 15催化第三步反应的为二氢吡咯还原酶， 将 15 图 1氨酸生物合成途径 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 6 -1 of 脯氨酸合成酶相关的基因，即脯氨酸合成酶基因族。其中包括了吡咯啉 咯琳 5 拟南芥中克隆得到的 因分别命名为 2 个基因具有不同的时间和空间表达特点 ， 因在所有的组织中都具有较高的表达活性 ， 而 因则在分生组织受到 高盐胁迫的刺激时优先表达。 4） 抗氧化酶系统 基因 一般认为 ， 植物的抗氧化防御系统能起到调节膜性、增加膜结构和功能稳定性的作用。 该系统包括过氧化氢酶 (多酚氧化酶 (谷胱甘肽过氧化物酶 (、谷胱甘肽转硫酶(、过氧化物酶 (超氧化物歧化酶 (、 抗坏血酸过氧化物酶 (，这些酶编码基因的克隆工作开展比较早。 这些物质协同作用以去除植物体内的活性氧自由基 ， 其中尤以为重要 ， 它是植物体内第一个清除活性氧的关键抗氧化酶。超氧化物歧化酶 (一种广泛存在于生物体内的金属酶 2 为生物体的抗氧化酶 ， 对生物体具有重要的保 护作用。将 入植物如烟草、番茄和苜蓿 ( ， 大量表达后均增强了植物的耐氧化能力。这对于植物抵抗逆境胁迫具有重大意义。 基因可做为抗性基因加以应用。 在研究中发现 ， 对植物抗旱起着关键性作用 ， 研究推测适度轻微的干旱胁迫对植物具有抗旱锻炼的效果 ， 性可能是先下降而后逐渐回升增加，但过度或过快的干旱处理则会使植物 活。 5） 因、水孔蛋白基因及脱水素基因 (1996)用来自大麦的一种 白基因 化水稻，使其在水稻中过量表 达，结果发现水稻的耐旱能力明显提高，且提高幅度与 白的表达量一致，为 白在植物耐旱、抗盐过程中的作用提供了直接证据。棉花 11 个 关基因，分别是 16 及拟南芥 个基因已经成功分离。拟南芥中有 30 个基因编码水孔蛋白得到克隆，其中， 12 种属于 12 种属于 6种属于 经得到克隆的编码 H+反向运输蛋白的基因包括：拟南芥中的 小麦的 和水稻的 因。脱水素是一种广泛存在于高等植物中的干旱诱导蛋白，具有很强的亲水性和热稳定性。具有保护植物细胞的大分子在脱水过程中不受伤害的功能。由于脱水素是在种子成熟时发挥作用，因此也把它归于 白。脱水素基因是一个大的基因家族，目前已有多个脱水素基因或相关基因被克隆及定位，如大麦中米中的 及拟南芥中的 等。 逆相关的转录因子及双组分系统基因 抗逆相关的转录因子的研究近来也日益受到重视，它们可以控制一系列的下游胁迫反应，从而启动信号传导中的级联反应，使细胞产生相应的抗逆性。至今，已克隆出了大量的与植物抗旱相关的转录因子。例如 ， 拟南芥 C 和 B， 3、 国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 7 。 在拟南芥和烟草中还发现双组分系 (因的存在，其基因产物为 感受器 和 反应调节器 合 二为一的激酶蛋白。如拟南芥的双组分系统基因 和 受干旱、高盐及低温的诱导。烟草双组分系统基因 和 则受高盐胁迫处理的诱导。双组分系统基因被诱导表达后，产生一系列的细胞应激反应，提高植物的干旱胁迫适应能力。 花耐旱性研究进展 洲棉简介 亚洲棉原产于印度次大陆。由于它在亚洲最早栽培和传布，故称亚洲棉。亚洲棉遗传性状比较稳定，它具有早熟、抗逆性强、纤维强力高、弹性好等一些优良的种质特性，这正是当前陆地棉栽培种所欠缺的 。相对于陆地棉，亚洲棉具有以下 3 个主要优点： 抗逆性强，不仅对一些病虫具有较强的抗性，而且由于棉铃下垂，在多雨阴湿地区可以减少烂铃僵花；并且较耐旱、耐瘠，耗水、需肥量较少，比较适于粗放栽培。 成熟早，一般比陆地棉早熟 20 多天。 纤维粗短，强力高，弹性大，适于纺织拉绒布或棉毛混纺及棉絮等专门用途。 亚洲棉是 2 倍体棉种，基因组 对较小，遗传背景也相对简单。亚洲棉 曾 被认为是 150 2005），石系亚 1 号遗传性状稳定，抗枯萎病，耐瘠薄，耐 旱抗寒，不易脱铃烂铃，相当于亚洲棉的标准系。 花品种的耐旱性鉴定及抗旱品种的筛选 80 年代初 ， 一批中熟、中早熟棉花品种的育成 ， 极大地促进了棉区耕作改制 ， 作为主产棉区的黄淮海棉区大部分地区由麦或棉一熟种植改为麦棉两熟种植（郭香墨等， 1995）。由于大部分中国棉花种植区域水资源紧缺，建立稳定有效的耐旱评价及鉴定标准，开展棉花耐旱性研究，选育耐旱品种对棉花生产具有重要意义。 为了鉴定棉花的耐旱性 ， 刘金定（ 1987）等提出了棉花抗旱性鉴定的苗期反复干旱法 ， 经研究改进 ， 确立了高效、合理的棉花耐旱碱鉴定 方法和标准 苗期反复干旱法：供试材料播于旱棚 ， 3 次重复 ， 从三叶期开始进行干旱处理 ， 土壤含水量达到 3%时复水 ， 反复 3 次 ， 最后调查生长点存活的幼苗数 ， 以幼苗存活率 (示供试材料的抗旱性。目前我国棉花抗旱性评价、鉴定多采用反复干旱法（俞希根等， 1999）。使用 液进行生化鉴定的条件仍处于摸索阶段，仅有 本研究开展了相关工作（张雪妍， 2007）。 棉花耐旱碱品种的选育研究开展较晚 ， 美国、澳大利亚等国从 70 年代、我国从 80 年代初开展棉花耐旱碱育种的系统研究 ， “七五”起在国家棉花育种攻关项目中设立“耐旱碱新品种选育”子专题 ， 以缓解粮棉争地矛盾 ， 促进粮棉同步增产。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 8 内外植物吡咯啉 研究进展 5脯氨酸合成途径中的第 1 个酶 编码 基因是一个双功能基因 ， 编码 谷氨酸 种酶 ， 催化从谷氨酸合成脯氨酸的最初两次反应。 在正常和胁迫条件下反馈调控植物中脯氨酸合成水平等方面均起着重要作用（ A， 1992）。 在胁迫条件下植物中脯氨酸的积累是两条途径相互调控的结果 ， 即增加脯氨酸合成酶基因( 表达量 ， 同时抑制脯氨酸降解酶的活性。将 因转入烟草和水稻后，转基因植株中 因 含量明显提高，转化植株的耐旱能力也比对照有所增加。此外，大量研究也表明，在干旱胁迫条件下， 表达 水平提高，胁迫解除， 因表达水平下降 。 5基因克隆与转基因方面的研究 经研究发现 ， 因受干旱、高盐和 导而不受热或低温所诱导（ ， 1995）。国内外学者克隆了大量动植物的 因 ， 如表 1示。 表 1发表的 因序列的部分信息 of 5CS 先在拟南芥中发现 诱导可以导致脯氨酸的积累 ， 表明 渗透胁迫下的脯氨酸合成中起到了关键的作用。这是因为 ， 在脯氨酸合成过程中的 2 个重要的催化酶 5到胁迫的诱导表达水平具有明显的差异。对拟南芥进行脱水处理 2 小时后 ， 因 达量在 10 h 之内随胁迫的延续而不断增加 ， 以后便维持在这一水平。在胁迫处理 10 h 后复水 ， 其转录水平在 5 h 后显著下降 ， 回复到脱水处理前的程度（ ， 1995）。对 论是干旱、盐胁或是 都不能明显提高 ， 1995）。 报道 ， 拟南芥在盐胁迫下 ， 其叶和根里 因转录的 平分别提高了 5 倍和 2 倍 ， 但是 因的 平却提高到 10 倍以上（ ， 1993）。随后在苜蓿和拟南芥中又发现了新的 因。在拟南芥中克隆得到的 因分别命名为 2 个基因具有不同的时间和空间表达特点 ，中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 9 因在所有的组织中都具有较高的表达活性 ， 而 因则在分生组织受到 物中的 到脯氨酸的变构调节 ， (运用定点突变技术替换豇豆 (肽 126131 位的 6 个氨基酸残基的任