DB21∕T 2537-2015 蓝舌病病毒荧光PCR检测方法DB21∕T 2537-2015 蓝舌病病毒荧光PCR检测方法

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pnbsp;41 nbsp;宁 省 地 方 标 准 nbsp;25372015 蓝舌病病毒荧光of 015 - 10 - 15发布 2015 - 12 - 15实施 辽宁省质量技术监督局 nbsp; 发 布 nbsp; 25372015 I 前 nbsp; 言 本标准按照 本标准由辽宁出入境检验检疫局提出并归口。 nbsp; 本标准起草单位辽宁出入境检验检疫局。 本标准主要起草人吴斌、万超、孙铭英。 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 25372015 nbsp; nbsp; nbsp;蓝舌病病毒实时荧光 范围 本标准规定了蓝舌病病毒(时荧光本标准适用于蓝舌病病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 nbsp;6682 nbsp;分析实验室用水规格和试验方法 nbsp;1193 nbsp;基因检验实验室技术要求 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 到阈值的循环数(碳酸乙二酯(NA 糖核酸(实时荧光光逆转录聚合酶链反应(4 原理 采用对蓝舌病病毒基因组计特异性引物和特异性的荧光双标记探针进行配对。探针539;端标记339;端标记它在近距离内能吸收539;端荧光基因发出的荧光信号。物和探针同时与目的基因片段结合,此时探针上器检测不到荧光信号;而反应进行到延伸阶段时,339;的外切核酸酶功能将探针降解。这样探针上的发出的荧光不再为着5 试剂和材料 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 25372015 nbsp; nbsp; nbsp;除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为 6682规定的一级水;所有试剂均用无剂 附录A)。 nbsp;附录A) 氯甲烷。 糖蛋白胨缓冲肉汤(见附录A) 5乙醇(见附录A)。 丙醇(冷)。 他试剂荧光50 附录A), 10 见附录A),2.5 nbsp;附录A)。可采用等效商品化试剂。 nbsp;10 nbsp;U/μL。 引物合成一对特异性引物上游引物539;下游引物539;39; 配制成10 ,保存。 器与耗材 光速台式冷冻离心机(最高可达13 000 r/ 量移液器L~10 μL,5 μL~20 μL,20 μL~200 μL,100 μL~1000 μL。 匀器。 箱2℃。 钵。 量可调移液器。 心管。 水纸。 心管 量带芯吸嘴(10μL,100μL,1000μL)。 6 生物安全要求 采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作,应遵守 1193的有关规定。 7 操作步骤 本的采集与处理 采样过程中样本不得交叉污染,采样及样品前处理过程中应戴一次性手套。 样工具 棉拭子、剪刀、镊子、研钵、离心管(055样方法 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 25372015 nbsp; nbsp; nbsp;织样品 加10方见附录A,含青霉素2000IU/霉素2000μg/加入于研钵中充分研磨,4℃浸提4h,取上清液500μA、1经处理的样品当天使用,剩余样品存备用。 液样品 取加入肝素(10凝血5磷酸盐缓冲液方见附录A,洗涤血样3次2000r/上清液后加入倍量方见附录A),置冰浴中超声波处理(40μA、1经处理的样品当天使用,使用前置4℃保存,剩余样品存备用。 酸提取 所有菌后方可使用。自上述完成前处理的样品中加入1温放置5烈振荡15秒,室温放置3℃10000水相转移到新管中,加入500μ20℃预冷,室温放置10℃10000取离心后的上清液转移至相应的新管中,上清液约吸取500μl(注意不要吸出中间白色絮状层),轻轻颠倒均匀。于4℃条件下,12000r/出轻倒去上清液,加入15乙醇,颠倒洗涤。于4℃条件下,12000r/出轻倒去上清液,倒置于吸水纸上,吸干液体,不同样品应在吸水纸不同地方吸干。每管加入20μ轻混均,溶解管壁上的000r/上保存备用。提取的增或放置于箱备用。 转录 于7.2 0反转录酶缓冲液(200 和 500 2μl;下游引物4μl;10 mM 2μl;5 l;00 l,水至20μl。瞬时离心,97℃水浴52℃ 1h;4℃ 10 即进行存备用。 nbsp;荧光光5μL,核酸模板5μL)10 μL;10 nbsp;10μ上下游引物1μL,5μ探针1μL, U/μL,μ性 nbsp;95 ℃ nbsp;5 2℃,1h;预变性 nbsp;95 ℃ nbsp;5 4 ℃ 20 s、45℃ 20s、72℃ 20s,40个循环,于退火结束时收集荧光信号。需配制的荧光品个数对照个数1。将各试剂按使用量吸取到微量离心管中,充分混匀,然后再每个应参数 录样本摆放顺序。循环参数设置如下 第一阶段,变性 nbsp;95 ℃ nbsp;5 转录42℃,1h; 第二阶段,预变性 nbsp;95 ℃ nbsp;5 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 25372015 nbsp; nbsp; nbsp;第三阶段,94 ℃ 20 s、45℃ 20s、72℃ 20s,40个循环,荧光收集设置在第三阶段每次循环的退火延伸时进行。 8 结果判定 果分析条件设定 读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点,不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。 控标准 性对照无性对照的8,并出现特定的扩增曲线。 阴性对照和阳性对照条件不满足以上条件,此实验视为无效。 果描述及判定 性判定 无明样品中无蓝舌病病毒核酸。 性判定 0,且出现特定的扩增曲线,表示样品中存在蓝舌病病毒核酸。 nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; nbsp; 25372015 nbsp; nbsp; nbsp;A nbsp;A nbsp;附 录 A 规范性附录 试剂的配制 入7℃静置过夜,采用121士2℃/5 nbsp;配制液。 nbsp;称取一水合磷酸二氢钠20二水合磷酸二氢钠于蒸馏水中,定容至1L。 nbsp;称取十二水合磷酸氢二钠2 二水合磷酸氢二钠于蒸馏水中,定容至1L。 称取17适量蒸馏水溶解,量取13液和87液,混合,用蒸馏水定容至2L。采用121士2℃/5 5%乙醇溶液 量取75入双蒸水中,充分混匀,定容至100温保存。 0 氯化钾(50 入双蒸水,充分溶解,定容至1000温贮存。 0 双蒸水溶解,后定容到250温贮存。 .5 nbsp;双蒸水溶解,定容到250用121士2℃/5 A.7乳糖蛋白胨缓冲液肉汤(水),用双蒸水溶解,充分混匀,最后定容到500水),用双蒸水溶解,充分混匀,最后定容到1000工作液的配制取液780糖100g,充分混匀,采用121士2℃/5 _________________________________/p
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