茶叶提取物抗补体活性初步研究 论文

毕业论文（设计）题目茶叶提取物抗补体活性初步研究指导老师专业班级生物技术及应用0701姓名学号2010年5月30日摘要在8种植物提取物中筛选出一种有较好抗补体活性成分植物（茶叶），然后再对该植物进行活性成分浓度与抗补体活性效果关系研究，以便为茶多酚新用途提供参考。研究主要利用超声波对植物抗补体活性成分提取制备，再运用抗补体溶血活性检测方法筛选与检测具有抗补体活性成分植物和抗补体活性效果；研究结果表明，8种植物中杭白菊和绿茶具有较好的抗补体活性成分，粗提物溶血活性CH50检测值分别为0152、0535MG/ML，对茶多酚分离提纯后三个成分98茶多酚（EGCG为45）、EGCG及咖啡碱的溶血活性CH50检测值分别为0353、0451MG/ML，咖啡碱没有抗补体活性效果；由此可以初步得出茶多酚为较好的抗补体活性成分，但抗补体活性效果的主导成分不是EGCG，而且粗提物抗补体活性更好。关键词茶多酚；抗补体活性；溶血活性检测；茶叶；清热解毒目录引言11材料211实验材料212实验试剂213实验仪器22方法221八种植物提取物制备222茶叶抗补体活性成分分离223补体经典途径的溶血活性CH50测定2231溶液配制3232补体制备及效价测定3233药物经典途径抗补体活性测定33结果与分析331八种植物提取效果的比较432八种植物抗补体初步筛选433茶叶抗补体活性测定结果44结果与讨论5参考文献7引言补体系统是人体重要的免疫防御系统之一。补体系统的正常激活在消灭外来微生物、清除肌体内损伤或死亡的细胞和组织以及维持机体的平衡中起着重要的作用。与补体激活相关的疾病如心肌死、肾炎、系统性红斑狼疮、SARS等，均是发病群体数量巨大、危害性强的疾病。目前临床上广泛使用的糖皮质激素等免疫抑制剂虽然对某些与补体过度激活相关的疾病有一定治疗作用，但由于该类药并非专一的补体抑制剂，选择性差，长期应用会降低机体的防御机能，产生多种副作用和并发症。因此临床上急需高效低毒专一的新型补体抑制剂。国内外已完成部分天然产物的筛选，发现自然界中广泛存在的某些多糖、黄酮、甾类扫萜类化合物具有显著的抗补体活性。本文将对几种天然产物类抗补体活性成分的测定1。自然界中广泛存在具有抗补体作用的活性成分，直接从植物中研究开发天然补体抑制成分的成本低，且大多数活性成分作为药用植物的一部分可以直接被机体消化吸收，因此天然产物中高教低毒的新型补体抑制剂的研究与开发受到国内外学着的广泛关注。茶叶中含有大量的茶多酚，茶多酚是茶叶中具有生物活性的重要成分之一，是一类存在于茶叶中的多羟基酚性化合物的混合物。研究表明，茶多酚不仅是一种天然的无毒抗氧化剂，也是一种理想的天然药物，具有多种保健功能和药理作用，可以清除自由基，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗紫外线照射、防治心血管病、除臭、延缓衰老、抗龋护齿、抗肿瘤、多药耐药性逆转和抗辐射等作用。杭白菊为“浙八味”之一。其作为一常用药具有疏风清热、平肝明目的功效，用于风热感冒、头痛眩晕、目赤肿痛、眼目昏花。现代药理学研究证明，杭白菊主要含有黄酮类化合物、挥发油、绿原酸、维生素等成分，其中杭白菊总黄酮2。豆腐柴具有抗菌、抗病毒、抗氧化、降血脂、抗肿瘤等功能清热解毒、消肿止血等功效，民间常用来治疗蛇毒咬伤、无名肿毒、创伤出血等。不仅仅是以上这几种植物，从文献中得知麦冬、温郁金、这些“浙八味”还有芦荟、鸭趾草、艾草等植物，均具有清凉解毒，抗自由基等作用。1材料11实验材料麦冬、温郁金、鸭趾草，购于杭州新城医院；杭白菊、绿茶、芦荟，购于下沙物美超市；豚鼠，新西兰兔，上海复旦大学实验动物部提供12实验试剂BBS、2SRBC、巴比妥、溶血素、30的酒精。13实验仪器微波提取器（NJL073，实验室专用微波炉）；低温高速离心机JONANMR22I型，JOUAN公司，法国；酶标仪WELLSCANMK3，THERMOLABSYSTEMS公司，芬兰；恒温振荡器WMZK8002，上海医用仪器厂；冷冻干燥器FREEZEDRYERL8型，LABCONCO公司，美国；2方法21八种植物提取物制备3称取绿茶250G用微波真空提取（8090，时间30MIN，料液比110）提取两次合并滤液抽滤用旋转蒸发仪浓缩成膏状放到干净的铝盒真空干燥。豆腐柴、麦冬、温郁金、杭白菊、芦荟、艾草、鸭趾草，7种提取方法同绿茶提取方法相同。22茶叶抗补体活性成分分离4称取绿茶500克30酒精超声提取两次，每次30分钟过滤离心孔径045M微孔滤膜过滤截留分子量5000及1000超滤膜过滤浓缩大孔树脂吸附不用浓度的酒精溶液洗脱浓缩、冻干茶多酚固体检测。23补体经典途径的溶血活性CH50测定231溶液配制5,6巴比妥缓冲液配制先配制出5倍浓缩巴比妥缓冲液5BBS。使用时稀释成巴比妥缓冲液BBS。2羊红细胞SRBC配制取绵羊血2ML，用BBS洗涤，800R/MIN，离心3MIN，重复3次后，再3000R/MIN。离心10MIN压积，然后用BBS配成2SRBC。11000溶血素配制用BBS配制成11000溶血素溶液。绿茶溶液配制称取茶多酚4MG，用BBS超声溶解成11溶液5MG/ML，加BBS对倍稀释配成12、14、18、116、132、164、1128共8个浓度的供试品溶液。232补体制备及效价测定7,9豚鼠股动脉取血约10ML，4放置1H凝固后，800R/MIN，离心5MIN，取血清，加入以BBS洗涤后的2SRBC约2ML，混匀后，800R/MIN，离心5MIN，取上清液作为补体分装，70冷冻保存备用。补体经典溶血系统的建立取补体豚鼠血清01ML，加入BBS配制成110溶液，用BBS对倍稀释成120、140、180、1160、1320、1640和11280溶液。取11000溶血素、各浓度补体及2SRBC各01ML溶于03MLBBS中，混匀，37水浴30MIN后，在5000R/MIN，4条件下离心10MIN分别取上清02ML，在405NM测定吸光度。实验同时设置全溶血组01ML2SRBC溶于05ML三蒸水中。以三蒸水溶血管的吸光度作为全溶血标准，计算溶血率。以补体稀释度为X轴，溶血百分率为Y轴作图。选择达到高溶血率的最低补体浓度作为确保体系能正常溶血所需的临界补体浓度。233药物经典途径抗补体活性测定10,11取确定的临界浓度的补体与供试品混匀，按照表1加入适量BBS、溶血素和2SRBC。37水浴30MIN后，5000R/MIN，4条件下离心10MIN后分别取每管上清液02ML，用酶标仪在405NM下测定吸光度。实验同时设置8种提取物对照组，补体组和全溶血组。3结果与分析31八种植物提取效果比较通过八种植物的提取过程中发现有的提取物很粘（如温郁金）不容易过滤，有的干燥后的质量不是大，在对比之下要选着，容易过滤，干燥后质量较大的。提取物干燥后的质量比较如表31。表31八种植物提取物干燥后的质量比较植物名称铝盒重量（G）干燥后铝盒重量（G）提取物质量（G）豆腐柴37853044312964599麦冬46311551695753842温郁金462380577846115466杭白菊16551722404858531芦荟34879235090417888绿茶34302038022937209艾草3769840123824258鸭趾草33848235983921357对比表格中得出温郁金、豆腐柴、麦冬、绿茶的提取物重量较大，但是考虑到温郁金、豆腐柴、麦冬这三种浓缩液较粘，不易过滤。32八种植物抗补体活性初步筛选在八种植物提取物的提取和干燥后，然后再对这几种植物提取物进行抗补体活性进行分析，惊奇的发现只有绿茶和杭白菊具有抗补体活性，但是茶多酚的抗补体活性为0152MG/ML，杭白菊的抗补体活性为0535MG/ML，相比之下茶多酚的活性较为理想。33茶叶抗补体活性的测定结果在对绿茶提取进行分离检测后得到茶多酚含量为98，EGCG含量为45。试验的同时把粗提取的茶多酚和纯的EGCG还有咖啡碱也进行了抗体活性的检测。结果如表32、33、34。表32茶多酚经典途经溶血实验中所加各成分的体积ML分组BBS三蒸水补体茶多酚溶血素2SRBC茶多酚测定020103530101茶多酚对照05补体组03010101全溶血组0501表33EGCG经典途经溶血实验中所加各成分的体积ML分组BBS三蒸水补体EGCG溶血素2SRBCEGCG测定020104510101EGCG对照05补体组03010101全溶血组0501表34咖啡碱经典途经溶血实验中所加各成分的体积ML分组BBS三蒸水补体咖啡碱溶血素2SRBC咖啡碱测定02010101咖啡碱对照05补体组03010101全溶血组0501从表格中得出茶多酚的EGCG含量为43，抗补体活性为0353MG/ML，纯的EGCG是0451MG/ML，咖啡碱则为0MG/ML次发现并不是EGCG的含量越高抗体的活性越大。4总结与讨论在八种植物提取物中筛选出一种有较好抗补体活性成分植物（茶叶），然后再对该植物进行活性成分浓度与抗补体活性效果关系研究，以便为茶多酚新用途提供参考。研究主要利用超声波对植物抗补体活性成分提取制备，再运用抗补体溶血活性检测方法筛选与检测具有抗补体活性成分植物和抗补体活性效果；研究结果表明，8种植物中杭白菊和绿茶具有较好的抗补体活性成分，粗提物溶血活性CH50检测值分别为0152、0535MG/ML，对茶多酚分离提纯后三个成分98茶多酚（EGCG为45）、EGCG及咖啡碱的溶血活性CH50检测值分别为0353、0451MG/ML，咖啡碱没有抗补体活性效果；由此可以初步得出茶多酚为较好的抗补体活性成分，但抗补体活性效果的主导成分不是EGCG，而且粗提物抗补体活性更好。一开始总以为具有抗自由基、抗辐射、抗自由基的EGCG在抗补体活性中占主导地位，试验的结果推翻了原有的想法，而绿茶在本次试验中得出被认为是具有较好的抗补体活，同时它的抗补体活性的具体跟什么有关，我的猜想是跟茶多酚的浓度、还是茶叶里面的其他有效成分有关，有待于具体研究，同时我也希望有人能对他的作用靶点和具体机制待进一步试验阐明。自然界中广泛存在有较强抗补体作用的活性成分，种类多样，结构各异，直接从天然产物中开发的补体抑制剂还有成本低的优点，但本文得出来了并不是所有的天然产物都具有抗补体活性，但有些植物确实具有较好的抗补体活性，此外，大多数活性成分作为药用植物的一部分可以直接被机体消化吸收，说明从天然产物中开发出高效、低毒的补体抑制剂是可能的，预示着天然产物类补体抑制剂将有良好的应用前景。参考文献1章蕴毅，张建文，陈道峰天然产物中的抗补体活性成分J中国天然药物，2007，553223252马荣粒，黄丛林茶用菊花研究进展J北方园艺，2009，10281511543王文平，李琳野木瓜水溶性多糖的分离提取纯化及其抗体活性研究J贵阳中医学院学报，2008，3111201234陈鹤立高效液相色谱法测定茶叶中茶多酚及咖啡碱含量J福建医药杂志，2006，8180815王黔云，熊郁良眼镜蛇毒高活性抗补体因子的体外溶血活性研究J中国药理学通报，2009，1989099136吴颜，吴甘霖半支连多糖抗