谷胱甘肽转硫酶mu亚型在糖尿病肾病发病中的作用及干预治疗的实验的研究

谷胱甘肽转硫酶MU亚型在糖尿病肾病发病中的作用及干预治疗的实验的研究山东大学博士学位论文谷胱甘肽转硫酶MU亚型在糖尿病肾病发病中的作用及干预治疗的实验研究姓名江蓓申请学位级别博士专业内科学肾脏病指导教师高海青20090921山东大学博士学位论文谷胱甘肽转硫酶亚型的表达在糖尿病肾病进展中的作用及干预治疗的实验研究研究生江蓓导师高海青专业内科学中文摘要糖尿病肾病,是糖尿病患者最主要的微血管病变,发病率高,美国疾病控制中心资料显示,患者约占总人数的以上。据美国、日本及许多西欧国家统计资料表明,已经上升为终末期肾脏病,的首位病因,在美国、日本的透析患者中,患者所占比例接近。随着生活水平的提高和生活方式的变化,我国和发病率也成上升趋势。目前临床上早期诊断的主要依据是微量蛋白尿,而患者一旦出现微量蛋白尿,约有的患者将不可避免地进展到明显蛋白尿进而发展至慢性肾功能衰退及。由于患者机体存在极其复杂的代谢紊乱,一旦发展至终末阶段,往往比其他肾脏疾病治疗更加棘手。而目前临床尚缺乏针对有效的特异性治疗。由于患者,尤其是型患者常伴有代谢综合征的其他表现,如高血压、高脂血症、中心性肥胖等,因此临床上针对的治疗以综合治疗为主,包括控制血糖、控制血压、降脂治疗及终末期替代治疗等,而治疗费用昂贵、疗效差和患者病死率高,一直是糖尿病领域和肾脏病领域学者面临的问题。进一步探索的发病机制,以便制定更加有效的防治措施无疑是当今医学界急待解决的重大课题。发病机制十分复杂,包括了众多因素参与。总的来说,它是起始于糖代谢障碍所致的血糖过高,在一定遗传背景以及一些相关的获得性危险因子参与下,通过启动许多细胞因子网络,终于造成肾脏的损害。虽然有关的研究取得了很大的进展,但其发病机制尚未完全清楚。近年来,蛋白质组学技术在肾脏领域的研究逐渐增多,这对于深入了解肾脏的生理功能、揭示肾脏病的发病机理、发现新的诊断标志物以及识别新的治疗靶点有着深远的意义。而蛋白质组学技术山东大学博士学位论文也为深入研究发病机制提供了全新的方法。本论文我们利用蛋白质组学技术对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠肾组织蛋白质差异表达进行了研究,并进一步对其中的差异表达蛋白谷胱甘肽转硫酶亚型在进展中的作用及干预治疗的意义进行了探讨。第一部分在诱导的大鼠肾脏表达的研究研究背景和目的随着人类基因组计划工作的完成,生物医学领域已经开始在基因水平对各种疾病进行深入的研究,但人们也逐渐认识到基因只是遗传信息的载体,而生理活动的执行者是基因的表达产物蛋白质,要研究生命现象、阐明生命活动规律,需要对蛋白质进行全面的研究。只有对蛋白质数量、结构、性质、相互关系和生物功能全面认识,才能揭开生命现象的本质。因此,蛋白质组学已成为“后基因组时期”生物医学研究的重点内容之一。近年来,蛋白质组学技术在肾脏领域的研究也逐渐增多,这对于深入了解肾脏的生理功能、揭示肾脏病的发病机理、发现新的诊断标志物以及识别新的治疗靶点有着深远的意义。而蛋白质组学技术也为深入研究发病机制提供了全新的方法。论文第一部分我们利用蛋白质组学技术对诱导的糖尿病大鼠肾组织蛋白质差异表达进行了研究,以寻求糖尿病肾病可能的发病机制和治疗的新靶点。材料和方法健康雄性大鼠只,随机选取只作为正常对照组组,其余只用来建立糖尿病大鼠模型,作为糖尿病组组。正常对照组一次性尾静脉注射柠檬酸缓冲液,组一次性尾静脉注射柠檬酸缓冲液/,天后取鼠尾血测定血糖,筛选模型成功的大鼠。以注射天后空腹血糖水平/为糖尿病模型成功的标准。所有大鼠标准饲料喂养,自由饮水,持续观察周。于第周末处死大鼠,取血测定空腹血糖、尿素氮、肌酐、白蛋白、尿酸、总胆固醇、甘油三酯、糖基化血红蛋白和晚期糖基化终末产物山东大学博士学位论文留尿测定小时尿蛋白取肾组织染色观察肾脏病理改变,应用双向凝胶电泳和质谱鉴定方法比较大鼠肾组织蛋白质的差异表达。结果第周时组大鼠、水平与组相比较均显著升高尸尿蛋白定量较组大鼠增多尸。光镜下染色显示,与组比较,组大鼠肾小球增多,系膜细胞增生,同时毛细血管部分塌陷,肾小囊部分粘连。双相电泳及质谱分析发现的大鼠肾组织的差异表达蛋白个,其中上调点个,下调点个,其生物功能包括物质代谢、氧化应激、信号传导、细胞增殖、细胞生长、细胞凋亡和热休克等。个差异表达的蛋白中在组表达较组上调。检测发现组大鼠肾组织的表达也较组显著增高尸,与蛋白质组学结果一致。结论蛋白质组学技术是研究的发病机制和治疗的新靶点的有效方法我们利用双相电泳及质谱分析发现的大鼠肾组织的差异表达蛋白个,其中上调点个,下调点个,其生物功能包括物质代谢、氧化应激、信号传导、细胞增殖、细胞生长、细胞凋亡和热休克等,这些差异表达的蛋白可能参与的发病。对两组大鼠肾组织的表达进行检测,发现组大鼠肾组织的表达较组增高,提示可能在的发病中起一定的作用,我们将在今后工作中做进一步深入的研究。关键词糖尿病糖尿病肾病双向电泳第二部分高糖诱导大鼠系膜细胞的表达及干预治疗的实验研究研究背景和目的山东大学博士学位论文,是肾脏固有细胞之一,具有多种生理功能,系膜细胞在病理情况下,与其他肾脏组织细胞一样,不但是疾病的受害者,而且也是直接的参与者。它能通过自身细胞的增殖及转分化,通过产生各种致炎、致纤维化物质而影响疾病的进程。事实上,增生及系膜硬化是最为常见的对各种肾小球损伤的反应。利用体外培养的进行细胞生物学研究,对深入了解。肾脏的生理及病理生理的变化,了解各种肾脏疾病的发病机制具有十分重要的作用。在组织学上的特征性改变包括肾小球基底膜增厚和系膜基质合成增多,而系膜基质合成增多主要是由产生增多。久而久之,肾脏出现肾小球硬化,相应的肾小管萎缩、肾间质纤维化,可见在的发生和发展中起重要作用。由于以上原因,我们选择了体外培养的大鼠系膜细胞,研究高糖刺激下在的表达情况及抗氧化剂白藜芦醇,干预治疗的意义,以期了解在发病中的作用。材料和方法常规体外培养大鼠系膜细胞,分为组正常对照组组高糖组组高糖白藜芦醇组组高糖白藜芦醇组组高糖白藜芦醇组组。治疗组相应浓度白藜芦醇预孵育,在高糖条件下培养,应用比色法和法测定系膜细胞增殖。收集细胞用流式细胞仪/双染色法检测细胞凋亡,染色法检测细胞周期检测系膜细胞和亿的表达。结果比色法测定组较组增殖率增高,治疗后、组增殖率较组减低尸,组增殖率较组减低,但无统计学意义。法测定组增殖率较组增高,治疗后、组均较组增殖率减低,且三个治疗组间增殖率有差异氏,随浓度增加增殖率降低。组期细胞比例较组增高氏,治疗后组期细胞比例较组减少,而、组期细胞比例虽较组减少,但无统计学意义胗。组期细胞比例较组减少氏,治疗后、组期细胞比例较组增高尸。三个治疗组间、两组山东大学博士学位论文期细胞比例较组增高,与组之间无差别。各组间期细胞比例无差异尸。组细胞凋亡率与组无差别户,治疗后、组凋亡率较组增,组凋亡率虽较组增高,但无统计学差异尸。组表达较组增高氏,治疗后、组表达较组减低,组表达较组减低,但无统计学差异,。三个治疗组之间表达均有差异,随浓度增加表达减少。组表达较组增高尸,治疗后、组表达较组减低,组表达较组减低,但无统计学差异叼。三个治疗组之间表达有差异,随浓度增加也表达减少。结论在高糖刺激下,系膜细胞表达上调,这可能是大鼠肾组织表达上调的原因之一。干预治疗高糖刺激下的,下调表达对起保护作用。下调系膜细胞表达是通过调节上游基因也的表达实现的。能抑制高糖诱导的增殖,且抑制作用存在一定的量效依赖关系。抑制的增殖与影响的细胞周期有关。能抑制从期进入/期,将阻滞于期,对高糖诱导的增殖起抑制作用。诱导凋亡也在抑制增殖中起一定作用。下调的表达,从而激活介导的通路,促进了的凋亡。关键词白藜芦醇系膜细胞凋亡细胞周期山东大学博士学位论文,丽,、,一一,娜,山东大学博士学位论文埘,尸谢嬲耐,嬲,【,山东大学博士学位论文位、,职谢,、,妒职酉谢酉,山东大学博士学位论文符号说明说明符号糖尿病糖尿病肾病链脲佐菌素非酶糖基化终产物细胞外基质肾小球基底膜谷胱甘肽转硫酶亚型终末期肾脏病系膜细胞白藜芦醇洲大鼠系膜细胞葡萄子原花青素转录因子相关因子山东大学博士学位论文抗氧化反应元件已心丝裂原激活的蛋白激酶细胞凋亡信号调节激酶核转录因子反应氧产物激活蛋白原创性声明本人郑重声明所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名期立二兰盔关于学位论文使用授权的声明本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。保密论文在解密后应遵守此规定导师签名论文作者签名毽至山东大学博士学位论文第一部分在糖尿病大鼠肾脏表达的研究研究生江蓓导师高海青专业内科学前言随着人类基因组计划工作的完成,生物医学领域已经开始在基因水平对各种疾病进行深入的研究,但人们也逐渐认识到基因只是遗传信息的载体,而生理活动的执行者是基因的表达产物蛋白质,要研究生命现象、阐明生命活动规律,需要对蛋白质进行全面的研究。只有对蛋白质数量、结构、性质、相互关系和生物功能全面认识,才能揭开生命现象的本质。因此,蛋白质组学已成为“后基因组时期生物医学研究的重点内容之一。和首次提出年,澳大利亚大学了“蛋白质组的概念,意思是指基因组表达产生的所有相应的蛋白质【】。年等第一次使用了该词,并定义为“在一种细胞内存在的所有蛋白质,同时提出了“蛋白质组学的概念【】。此后,蛋白质组学成为生命科学中的一个全新领域,它是一门对某一细胞或机体在特定的生理或病理状态下表达的所有蛋白质的特征、数量和功能进行系统性研究的科学【】。目前蛋白质组学的研究内容主要包括两部分一是“表达蛋白质组学,即获得细胞、组织或机体在正常条件下的二维图谱或质谱数据等信息,建立相关数据库,从而了解蛋白质组的组成,并作为后续研究的参考图谱。二是“功能蛋白质组学,即研究各种生理、病理情况下细胞、组织或机体蛋白质组的变化,从而了解参与变化的蛋白质及其性质、功能,以揭示生命活动的规律。近年来,蛋白质组学技术在肾脏领域的研究也逐渐增多,这对于深入了解肾脏的生理功能、揭示肾脏病的发病机理、发现新的诊断标志物以及识别新的治疗山东大学博士学位论文靶点有着深远的意义【铀】。糖尿病肾病,是糖尿病慢性并发症中最主要的微血管并发症,目前已成为发达国家终末期肾脏病,的首位病因【】,在我国也已上升为的第二大病因,严重威胁着人类的生命和健康。不仅发病率高,治疗费用大,而且病死率高,故而的诊断和治疗一直是糖尿病领域和肾脏病领域学者面临的问题。虽然有关的研究取得了很大的进展,但其发病机制尚未完全清楚,进一步探索的发病机制,以便制定更加有效的防治措施无疑是当今医学界急待解决的重大课题,而蛋白质组学技术为深入研究发病机制提供了全新的方讨二【】我们利用蛋白质组学技术对链脲佐菌素诱导的大鼠肾组织蛋白质差异表达进行了研究,以寻求可能的发病机制和治疗的新靶点。材料与方法一、糖尿病大鼠模型的建立一材料动物选择实验动物选用健康雄性大鼠,鼠龄周,体重,购买并饲养于山东大学实验动物中心合格证号。药物购自美国公司。所需溶液的配制溶液的配制用时以溶于/的柠檬酸盐缓冲液,浓度,以肛微孔滤膜过滤除菌后,置冰浴下使用。柠檬酸缓冲液的配制/柠檬酸母液柠檬酸溶于蒸馏水柠檬酸三钠母液柠檬酸三钠溶于蒸馏水/柠檬酸盐缓冲液山东大学博士学位论文二实验分组和模型的建立健康雄性大鼠只,适应性喂养周后,禁食开始实验。随机选取只作为正常对照组组,其余只用来建立糖尿病大鼠模型,作为糖尿病组组。方法如下正常对照组一次性尾静脉注射柠檬酸缓冲液,糖尿病组一次性尾静脉注射柠檬酸缓冲液/,天后取鼠尾血测定血糖,筛选模型成功的大鼠。以注射天后,空腹血糖水平/为糖尿病模型成功的标准。成模后糖尿病大鼠只,稳定周后开始实验。二、标本的收集及测定方法所有大鼠标准饲料喂养,自由饮水,持续观察周。实验结束时,组和组大鼠分别为只、只。于第周末处死大鼠,取血、留尿、取肾组织。一标本的收集尿标本的留取各组大鼠处死前将其置入代谢笼中,自由进食和饮水,收集尿液,记录尿量后取,离心,去除沉淀置于冰箱保存,待测尿蛋白。血标本的留取处死大鼠后立即穿刺心脏取血,静置后离心分钟,收集血清,冰箱保存待测。肾组织的留取处死大鼠后迅速开腹,分离摘取肾脏,修剪掉纤维结缔组织,冰生理盐水冲洗,滤纸吸干称重后将其切成厚的组织片,置于甲醛溶液中固定,用于制作组织切片。二检测指标及方法血压的检测尾动脉收缩压采用尾套式大鼠心率血压测定仪中日友好医院生产,型测量大鼠清醒状态下尾动脉收缩压,每周检测一次,每次测次,取其平均值。尿蛋白测定采用磺基水杨酸法检测机器型号,中国。血糖的监测每周用血糖仪强生公司鼠尾取血测空腹血糖,并测量体重。肾功等指标的测定用全自动生化分析仪德国罗氏公司测定空腹血糖、尿素氮、肌酐、白蛋白、尿酸、山东大学博士学位论文总胆固醇、甘油三酯。高压液相法机器型号测定糖基化血红蛋白,吐检测晚期糖基化终末产物,】。肾组织病理学检查石蜡切片的制备肾组织标本在甲醛溶液中固定小时后,经常规脱水,二甲苯透明晰分钟,浸蜡小时,包埋成石蜡块。切片机切片,厚约,用于病理形态学分析。肾组织病理学检查将病理切片行染色,光镜下观察病理改变。过碘酸染色法见下【试剂配置】高碘酸氧化液高碘酸,蒸馏水,溶解后保存于冰箱待用。液碱性复红,/盐酸,重亚硫酸钠,重蒸馏水。先将重蒸馏水煮沸,稍有火焰,加入碱性复红,再煮沸,冷却到加入/盐酸,待时加入重亚硫酸钠。室温中之后见稍带红色,后变为无色液体。棕色瓶内装好,封口,冰箱保存待用。【染色步骤】用固定液或无水乙醇固定组织,石蜡切片,常规脱蜡至水。蒸馏水洗。高碘酸氧化液蒸馏水洗次。液染色。流水冲洗。用或明矾苏木素液染核。盐酸乙醇分化,自来水洗后将细胞核变蓝色为止。无水乙醇脱水,二甲苯透明,中型树胶封固。【结果】糖原及其他反应阳性物质为红色,细胞核为蓝色。三、双向凝胶电泳及质谱分析一试剂尿素、硫脲、四甲基乙二胺、两性电解质、碘乙酰胺、低熔点琼脂糖和蛋白浓度测定试剂盒等购自山东大学博士学位论文公司、二硫苏糖醇、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、十二磺基硫酸钠、缓冲液、等点聚染料,、二甲基甲酰胺、赖氨酸和焦干胶条,等购自公司蛋白酶抑制剂和胰酶购自公司考马斯亮蓝购自公司溴酚兰购自上海华美公司。设备型等电聚焦仪、垂直电泳仪、扫描仪美国公司型超低温冰箱美国型公司型/质谱仪德国公司/质谱仪美国公司。三方法蛋白质的提取分别取正常对照组、糖尿病组大鼠各只,处死后迅速开腹,分离摘取肾脏。切开肾脏以冰磷酸盐缓冲液进行漂洗,去除血液成分。吸干多余水分后液氮保存。实验时将组织解冻后,用生理盐水清洗干净,剪碎,液氮下充裂解液/尿素,/硫脲,分研磨后加入“载体两性电解质,缓冲液,蛋白酶抑制剂,使用匀浆器进行匀浆,超声波细胞粉碎机破碎细胞,/次,共次,每次间隔,整个过程冰浴进行。冰上静置后,/离心,收集上清,保存。用法测定总蛋白含量。荧光标记蛋白质按照使用手册进行操作。样品浓度稀释到吲山,将所有样品等量混合后分装得内标,调节值到啦,加入染料,/各,黑暗环境下冰上标记,标记结束后再加山赖氨酸/终止反应。第一向等点聚焦正整个过程避光进行上样体系的准备带有荧光标记的样品,加入适量再水化液,使总体积达,加至胶条槽。再水化液成分如下山东大学博士学位论文尿素缓冲液,溴酚蓝上样体系准备好后,在旋涡混合器上振荡混匀,离心去除振荡产生的气泡。从酸性端开始上样,逐渐向碱性端移动连续滴加,加样时避免产生气泡。从酸性端撕去胶条的保护膜,用眼科镊夹住胶条碱性端末端无胶处,将其胶面向下缓慢放入胶槽中,放的过程中也要避免产生气泡。使液体在胶槽两个电极间连续分布,且一定要没过电极。放好胶条后在其上加适量约,保证为一连续油层将其下的胶条和液体完全盖住。盖上盖,将其放在电泳仪电极平板上,保证胶槽的两电极与平板电极接触,并使胶槽长轴方向与电泳仪长轴方向一致。将胶条槽放到等电聚焦仪器操作平台上,行等电聚焦。表面温度,最大电流/,电泳结束时总小时伏特约为。等点聚焦电泳的条件如下胶条平衡待第一向电泳结束后,用滤纸吸去附着的矿物油,分别在平衡液、中进行步平衡,各。山东大学博士学位论文平衡液尿素甘油溴酚蓝平衡液尿素甘油溴酚蓝第二向电泳整个过程避光进行。灌胶迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液至距离顶端,用加样枪在胶液上覆盖一层,饱和正丁醇。聚合完全后至少,倾出覆盖层液体,用电泳缓冲液洗涤凝胶。顶部洗涤数次以除去未聚合的丙烯酰胺。尽可能排去凝胶上的液体,再用滤纸的边缘吸尽残留的液体。聚合期间可进行平衡步骤的操作。胶条转移和封胶平衡好的胶条从试管中取出,用电泳缓冲液清洗次,将预先热好的低熔点琼脂糖封胶液加入胶面上,迅速将胶条推入其中,使胶条下缘与胶面紧密接触,胶条与胶面之间不应有气泡。封胶后放置数分钟,待封胶液凝固后即可进行第二相电泳。在进行第二相电泳前应该先将冷凝循环水装置开启,使其在进行电泳时达到预设的温度。将胶架装到垂直电泳仪上,加入电泳缓冲液,缓冲液的量不高于外槽表面标志。双向电泳参数为/胶,/胶,。电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部后结束电泳,小心取出胶,山东大学博士学位论文做好标记。凝胶图像分析荧光标记的凝胶用多功能激光扫描成像系统扫进行分析。描,图像用软件系统生物质谱分析蛋白胶内酶解从胶中切下明显差异表达的蛋白质点,清洗和脱色,脱水干燥,酶液泡胀,酶解,提取。样品的纯化、浓缩采用方案。质谱分析堇/质谱鉴定/质谱仪分析,质谱仪的紫外光的频率为,波长,加速电压,质量分辨率最大可达到,质量扫描范围是,基质为/。本实验中用软件/进行搜索,使用的数据库为大鼠非冗余的数据库。逗/质谱仪鉴定未鉴定的多肽进行/全自动分析,分析以方式进样,系统装备一个脱盐预柱分流器前的流速为/,分流器后的流速为/毛细管温度为,毛细管电压为电喷雾电源电压为,碰撞能量设置为在进样后的前通过预柱脱盐,以后的时间通过梯度洗脱经毛细管柱进行肽段分离,肽混合物的洗脱梯度,洗脱时间为,重复次分离后直接进入质谱仪,仪器一级扫描范围为。一级和二级之间通过母离子强度和母离子电荷自动转换。串联质谱扫描包括一个全扫描觚及十个串联扫描/搜索使用的数据库为上大鼠的非冗余蛋白库,结果过滤参数为当,当,一当,其中,。四、检测蛋白质的提取蛋白质提取液的配制山东大学博士学位论文去氧胆酸钠临用前加蛋白酶抑制剂/异丙醇/组织蛋白的提取称取组织,在研钵中液氮下研磨加入的蛋白提取液,吸入的灭菌管中将管在冰上冰浴上,/离心吸取上清,分装保存胶的配制浓缩胶分离胶电泳样品加入上样缓冲液,煮沸,上样,电压,。转膜膜转膜所需的缓冲液阳极缓冲液,/甲醇,/甲醇阳极缓冲液,阴极缓冲液氨基正已酸,/甲醇,山东大学博士学位论文转膜前的准备将凝胶在阴极缓冲液中浸泡在阳极缓冲液中浸泡两张滤纸至少在阳极缓冲液中浸泡一张滤纸至少在阴极缓冲液中浸泡三张滤纸至少在甲醇中湿润膜,然后小心地将膜放入水中浸泡,再将膜放入阳极缓冲液中平衡至少。转膜按照如下顺序依次铺好滤纸、凝胶和膜由下至上依次为两张阳极缓冲液中浸泡的滤纸一一张阳极缓冲液浸泡的滤纸一膜一凝胶一三张阴极缓冲液中浸泡的滤纸,然后倒放在转膜仪的阴极板上。转膜时间一般为封闭的脱脂奶粉或者配,封闭至少。包被一抗用封闭液将一抗按照适当比例稀释,和膜一起放入干净的塑料袋中封口室温孵育至少,或过夜。洗膜用/洗膜次,每次。包被二抗用封闭液将二抗按照适当比例稀释,和膜一起放入干净的塑料袋中,封口室温孵育或。洗膜用/洗膜次,每次。显色将、液各一滴加入的三蒸水中混匀,均匀的加到膜上,避光。查看结果应用密度测定法定量分析相应蛋白条带发光度,五、统计学处理采用统计软件进行统计分析,计量资料以表示,两组比较采用检验。为差异有统计学意义。山东大学博士学位论文结果一、大鼠形态及体重的变化组大鼠均出现多饮、多尿、多食的表现,与组大鼠比较毛色暗淡无光泽,由于消瘦及多食逐渐呈现大腹小头的形态变化,尾静脉采血后伤口不易愈合。两组大鼠体重变化见表、图。实验开始时两组大鼠体重无差异尸叼,周时组大鼠较组大鼠体重显著下降。二、两组大鼠一般情况的比较第周时组大鼠、水平与组相比较均显著升高尸尿蛋白定量较组大鼠增多氏、水平较组大鼠显著升高,但两组水平均在正常范围。组大鼠收缩压与组相比较显著升高见表,图。三、两组大鼠肾组织病理改变光镜下染色显示,组大鼠和系膜细胞均无明显增加,毛细血管管腔开放良好。与组比较,组大鼠肾小球增多,系膜细胞增生,同时毛细血管部分塌陷,肾小囊部分粘连见图。四、双向电泳和蛋白分析结果组与组各取个肾组织样品,经双相凝胶电泳分离、考马斯亮蓝染色和脱色处理后,检测蛋白质点个,对其中表达显著差异的个蛋白点进行质谱分析,组较组上调表达蛋白质点个,下调表达点个,其生物功能包括物质代谢、氧化应激、信号传导、细胞增殖、细胞生长、细胞凋亡和热休克等见表。五、在肾组织的表达在差异表达的个蛋白中,蛋白在组的表达较组上调见图经质谱分析,并在蛋白质数据库中对比质谱得到的肽序列标签,鉴,定该蛋白为谷胱甘肽转硫酶“亚型又称亚型,方法对两组大鼠图。我们利用肾组织的表达进行了测定,发现组大鼠肾组织的表达较组显著增高见图,与蛋白分析结果一致。山东大学博士学位论文讨论随着生活水平的提高和生活方式的变化,发病率逐年增高,年世界卫生组织公布的患病人数约为亿千万,预计年患者将达到亿千万,已成为列肿瘤、心脑血管疾病之后又一严重威胁人类生命和健康的重大疾病。是最主要的微血管并发症,发病率高,美国疾病控制中心资料显示,患者约占总人数的以上。而一旦出现蛋白尿,约有的患者将不可避免地进展到明显蛋白尿进而发展至慢性肾功能衰退及,这是患者致死的主要原因之一【。据美国、日本及许多西欧国家统计资料表明,已经成为的首位病斟,在美国、日本的透析患者中,患者所占比例接近。而目前临床尚缺乏针对有效的特异性治疗,一旦发生,仍然采取包括控制血糖、控制血压、降脂治疗及终末期替代治疗等综合治疗方法,一旦患者进入期,治疗费用昂贵、疗效差和患者病死率高,一直是糖尿病领域和肾脏病领域学者面临的问题【。近年来,虽然有关的研究取得了很大的进展,但其发病机制尚未完全清楚。探索的发病机制,以便制定更加有效的防治措施一直是当今医学界急待解决的重大课题。我们利用蛋白质组学技术对诱导的糖尿病大鼠肾组织蛋白质差异表达进行了研究,以寻求糖尿病肾病可能的发病机制和治疗的新靶点。一、糖尿病大鼠模型的建立制备出标准而完善的动物模型,是我们研究疾病发病机制及治疗的基础。目前国际上诱导大鼠动物模型多采用大鼠。本研究采用一次性鼠尾静脉注射柠檬酸缓冲液/,天后取鼠尾血测定血糖,以空腹血糖水平/为模型成功的标准。整个饲养动物的过程中每周检测大鼠血糖,组大鼠血糖基本波动于一/。每月检测大鼠体重,正常组大鼠体重随时间延长逐渐增加,而组大鼠体重增加缓慢,体形瘦小,并出现多饮、多食、多尿的表现,由于消瘦及多食逐渐呈现小头大腹的形态,与正常组相比,毛色暗淡无光泽,尾静脉采血后伤口不易愈合。第周处死大鼠后,测定组大鼠、水平与组相比较均显著升高尿蛋白定量较组大鼠增多。光镜下染色显示,组大鼠和系膜细胞均无明显增加,毛细血管管腔开放良好。与组比较,组大鼠肾山东大学博士学位论文小球增多,系膜细胞增生,同时毛细血管部分塌陷,肾小囊部分粘连。说明糖尿病动物模型的建立是成功的。二、在糖尿病大鼠肾组织的表达我们利用和质谱鉴定技术对诱导的大鼠肾脏组织进行了研究。结果显示,图谱分离出的蛋白质点经过软件系统分析和质谱鉴定,组与组比较,获得差异表达蛋白点个,其中上调点个,下调点个,其生物功能包括物质代谢、氧化应激、信号传导、细胞增殖、细胞生长、细胞凋亡和热休克等。在差异表达的个蛋白中,蛋白经质谱分析,鉴定该蛋白为,在组的表达较组上调。我们进一步用方法对两组大鼠肾组织的表达进行了测定,发现组大鼠肾组织的表达也较组增高,与蛋白分析结果一致,说明在大鼠肾组织的表达较组增高。,是细胞解毒系统的重要部谷胱甘肽转硫酶分,是体内生物转化最重要的相代谢酶之一,它和谷胱甘肽过氧化物酶年,是一对抗氧化酶。是于从牛红细胞中发现,分子结构中含有硒,故又名硒谷胱甘肽过氧化物酶,是体内清除和多种有机氢过氧化物的重要酶【】。年等发现组织中还存在一种不含硒的,并将其命名为或不含硒的谷胱甘肽过氧化物酶【】。在体内不能分解,但具有清除过氧化物和解毒的重要作用。分布广泛,可在所有的真核及原核系统存在,包括细胞浆、微粒体和线粒体。人体各组织中均含有,但其种类、含量和活性有所不同,其中以肝脏中含量最耐。目前对超家族已分出八种亚型,包括,肛,和,其中以,亚型又称、或、亚型为主。的功能主要是催化还原型谷胱甘肽的巯基与一些亲电子类物质相结合,从而发挥解毒作用,保护细胞免受损害【。亲电子类物质包括抗肿瘤药物、致癌剂、环境中的毒素、氧化应激产物等。的底物是,二硝基氯苯,的催化机理是促使与结合生成,一二硝基苯谷胱甘肽。还可以与一些难溶于水的物质,如血红素、胆酸、染料、激素山东大学博士学位论文和其他一些疏水性强的外来或内源的代谢产物相结合,使之极性增强,易溶于水,从而最终被降解而排出体外【。许多环境相关疾病的发生都与暴露因素及宿主因素有关,个体对外源性化合物代谢的差异取决于代谢酶重要基因位点的多态性,这些基因多态性可影响相应酶的表达水平、结构和催化能力等方面。在相同的暴露条件下,这种差异对相关疾病的发生起重要作用。是体内生物转化最重要的相代谢酶之一,所以基因家族被列为许多环境相关疾病的候选基斟矧,基因多态性与环境相关疾病的关系一直备受关注。以往的研究证实基因多态性与胃癌、结肠大肠癌、肺癌、乳腺癌、甲状腺癌等多种肿瘤的发病有关【锄】,还在维持正常的肺功能及动脉粥样硬化的形成中起一定的作用【,但在不同人种中的结果也不尽相刚。】。而对基因多态性与关系的研究较少,结果也不完全一致。等对例岁型患者的研究发现,牝岁组患者易感性与基因多态性相关,基因缺失型具有保护作用【。等对土耳其型患者的研究结果显示,基因缺失型与发生相关,作者认为基因缺失型可以作为预测易感性的基因水平标志物【。而一项日本型患者的研究结果则提示基因多态性与日本人型发病无关【。除了基因多态性与关系的研究外,目前有关与肾损害的相关研究甚少。而我们利用蛋白质组学技术发现,在组肾脏的表达较组上调,应用方法对两组大鼠肾组织的表达进行测定,结果与蛋白质组学结果一致,提示在大鼠肾组织的表达较正常增高,这种变化可能在肾损害中起一定作用。等对早期型小鼠模型肾脏个基因的表达进行了研爿,发现中的、亚型水平和蛋白质表达均升高,免疫组化证实的表达主要在肾脏近端小管,该研究结果与本论文结果有一致性。我们以往的研究结果证实应用天然抗氧化剂一葡萄子原花青素,对诱导的大鼠模型肾脏损害有明确的治疗作用能够显著降低大鼠蛋白尿,改善肾小球高滤过状态。治疗组、均较组有改善而肾组织病理改变也发现,经山东大学博士学位论文治疗后细胞外基质增多、系膜细胞增生情况较组减轻,同时治疗组的表达较组减低争加。以上研究结果说明,在大鼠肾组织表达增高,而抗氧化剂治疗干预后,随着大鼠血糖等指标及肾脏病理方面的改善,表达减低,这种变化提示可能在的发病中起一定的作用。三、大鼠肾组织过表达致肾脏损伤的机制大鼠肾组织过表达引起肾损害的机制尚不清楚,可能通过以下途径起作用【删增强炎症反应参与炎性因子白三烯、前列腺素的代谢,过表达使前列腺素合成增加,从而导致炎症反应的增强。,抑制细胞凋亡丝裂原激活的蛋白激酶信号通路是细胞内信号传导的重要方式之一,参与调节细胞的凋亡。通路包括细胞外信号调节的蛋白激酶