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MTT法测定肿瘤细胞对化疗药物的敏感性1002HERALDOFMEDICINEVO129NO8AUGUST2010MTT法测定肿瘤细胞对化疗药物的敏感性陆艳上海交通大学医学院附属新华医院药剂科,200092摘要目的研究人肿瘤细胞对化学治疗化疗药物的体外敏感性,为临床用药提供参考方法对白血病18例,脑肿瘤15例,胃癌8例,乳腺肿瘤8例进行细胞体外培养,采用MTT法进行化疗药物敏感实验结果肿瘤细胞体外药敏存在着明显的个体差异,其平均抑制率结果与临床用药情况基本相符结论MTF法灵敏度高,特异性强,成功率高,且操作简便,快速,对于临床合理用药,实现肿瘤患者的个体化化疗具有重要的价值关键词化疗药物MTT法肿瘤中图分类号R9791文献标识码A文章编号10040781201008100204EVALUATIONOFSENSITIVITYOFTUMORCELLTOCHEMOTHERAPEUTICDRUGSUSINGMTTASSAYLUYANDEPARTMENTOFPHARMACY,XINHUAHOSPITALAFFILIATEDTOSHANGHAIJIAOTONGUNIVERSITYSCHOOLOFMEDICINESHANGHAI200092,CHINAABSTRACTOBJECTIVETOSTUDYTHEVITROMTTASSAYFORDETERMININGTHEDRUGSENSITIVITYINHUMANTUMORSMETHODS18SAMPLESOFLEUKEMIAS,15BRAINTUMORS,8GASTRICCANCERSAND8BREASTCANCERSWERECULTUREDINVITROFORDETERMINATINGINHIBITORYRATEOFCHEMOTHERAPYDRUGSTOCANCERCELLSBYMTTRESULTSTHEREWASSIGNIFICANTDIFIERENCEINDRUGSENSITIVITYTODIFFERENTCANCERCELLSINVITROTHEAVERAGEINHIBITIONAGAINSTCANCERCELLSEONFORMEDTOTHEIRCLINICALEFFECTSCONCLUSIONTHEMQWASSAYISSENSITIVE,SPECIFIC,RAPID,SIMPLEANDWITHHIGHPROBABILITYOFSUCESS,WHICHISIMPORTANTFORCLINICALUSEANDINDIVIDUALMEDICATIONKEYW0RDSCHEMOTHERAPEUTICDRUGSMTTASSAYTUMOR化学治疗化疗目前仍是肿瘤治疗的重要手段,但传统的化疗无法在治疗前判断患者个体对药物的敏感性和耐药性为了有效地指导临床用药,提高肿瘤患者的生存期和治愈率,MOSMANN设计了一种用于检测药物对肿瘤细胞增殖影响的新方法,即MTT法该方法敏感性高,特异性强,与临床化疗敏感性密切相关引,目前已作为肿瘤患者体外药物筛选的常规方法之一笔者应用MTT法测定了49例肿瘤患者体外细胞对20种化疗药物的敏感性,为临床合理使用化疗药提供了理论依据1材料与方法11标本取自2008年10月2009年5月问我院住院肿瘤患者的骨髓和新鲜肿瘤组织,其中白血病骨髓标本18例,脑肿瘤组织标本15例,胃癌组织标本,乳腺肿瘤标本各8例12仪器与试药酶标仪购自科华实验系统有限公司RPMI一1640培养液购自美国GIBCO公司灭活新生小牛血清购自上海生物制品研究所生化试剂厂淋巴细胞分离液购自上海恒信化学试剂有限公司3一4,5二甲基一2一噻唑一2,5一二苯基溴化四氮唑蓝收稿日期20091012修回日期20091220作者简介陆艳1986一,女,上海人,药师,学士,专业方向医院药学电话021657900005241,EMAILRITALUYANMTT购自蓝季科技发展有限公司13药物工作液的配置选取目前临床常用敏感化疗药物20种氟尿嘧啶5FU,顺铂DDP,环磷酰胺CTX,长春新碱VCR,甲氨蝶呤MTX,丝裂霉素MMC,米托葸醌MIT,阿糖胞苷ARAC,羟基喜树碱OPT,柔红霉素DNR,表柔比星EPI,吡柔比星THP,异环磷胺IFO,博莱霉素BLM,平阳霉素PYM,多柔比星ADM,奥沙利铂LOHP,紫杉醇FFX,多西他赛DOE,吉西他滨GEM,用09氯化钠溶液或葡萄糖注射液溶液稀释配置成工作液,使药物终浓度等于药物一次快速静脉注射后理论最高血药浓度,置于一2O冰箱保存备用对于白血病用药物终浓度降低10倍14实验原理根据化合物MTT能和包括肿瘤细胞在内的具有代谢活性的有核细胞线粒体呼吸链上的琥珀酸脱氢酶反应,将MTT还原成兰黑色的甲腊化合物,比色后通过测定吸光度A值来定量细胞的成活程度,从而得出抗癌药物对肿瘤的抑制率抑制率/R1一加药孔4值/对照组A值100/R30为耐药,50为敏感,70为中度敏感,70为高度敏感15实验方法151细胞悬液配制肿瘤组织标本在手术后于无菌条件下送至实验室,用1640培养液含10小牛血医药导报2010年8月第29卷第8期1003清和青霉素100UML,链霉素100GML反复冲洗,剪除脂肪,纤维及坏死组织,选取边缘生长好,无坏死的肿瘤组织小块,将其剪碎并加入适量1640培养液对于纤维结缔组织较多,质硬的肿瘤应加入适量消化酶,于37消化12H,然后将剪碎的组织和细胞培养液倒入筛孑L内径15066IXM不锈钢筛中将标本碾碎过滤,制成细胞悬液白血病患者取外周血或骨髓34ML,用等体积的1640培养液加双抗和小牛血清稀释并混匀在无菌离心管中加入淋巴细胞分离液3ML,将稀释好的血液或骨髓液缓慢滴人淋巴细胞分离液中,5CC下离心10MIN,离心速率1500RRAINR6CFVI离心后溶液分层,用玻璃滴管将中间灰白层小心吸取,移至另一无菌离心管中加1640培养液制成细胞悬液将骨髓或组织制成的细胞悬液,离心10MIN离心条件同上,清洗2次离心后用细胞计数板在显微镜下数,加1640培养液调整每大格细胞数在5080个即每毫升510810个152分组培养取96孑L板,设用药组,对照组,空白组用药组中每孑L加入各化疗药10L和细胞悬液90L对照组每孔不加药只加细胞悬液100IXL空白组每孔不加药加1640培养液100IXL将加完样的96孔板置培养箱中于37,5二氧化碳条件下培养4896H153加M1VR反应并溶解生成物细胞培养后在3组每孔中分别加5MGMLMTT20L,在相同条件下继续培养6H,取出后每孔加10十二烷基硫酸钠SDS100IXL溶解沉淀并终止反应154定量细胞存活情况1618H后用酶标仪在570NM630NM参比波长波长处读出各孔吸光度A值,并计算抑制率16统计学方法实验所测数据以YS表示,各组间均数采用T检验方法比较,所有数据均经SPSS软件处理2结果将几类肿瘤标本进行统计,比较同一类肿瘤不同个体问的抑制率差异,并计算同一类肿瘤对不同化疗药的平均抑制率,见表1结果显示各组肿瘤细胞对化疗药存在明显的个体差异20种化疗药物对不同肿瘤的抑制率均也差异有显着性P005,其中对白血病抑制率比较高的药物为ARAC,OPT,EPI,THP对脑肿瘤抑制率较高的药物依次是BLM,IFO,ARAC,MMC对胃癌抑制率较高的药物是PTX,DOE,IFO,EPI对乳腺肿瘤较敏感的药物为PTX,DOE,EPI,MMC,VCR实验结果显示,不同的个体对同种药物的敏感性表现出明显的差异表2,因此在药敏测定结果的指导下进行个体化化疗,可以最大限度地发挥化疗药物对肿瘤细胞的杀伤能力表120种化疗药对4类肿瘤细胞的抑制率TAB1THEINHIBITIONRATIOOF20CHEMOTHOROPYDRUGSTO4KINDSOFTMORCELLSYS1004HERALDOFMEDICINEVO129NO8AUGUST20103讨论对于肿瘤患者,化疗是必要的,但是临床上往往出现化疗效果不理想的问题原因可能是由于化疗药物种类较多,肿瘤细胞个体生物学特性存在着差异,经验性用药等问题的存在通过MQT法在化疗前对药物进行敏感性测定,筛选出适合不同患者的敏感药物,能减少因针对性不强甚至盲目用药给患者带来的经济损失及不良反应,防止多重耐药的产生,以期提高治疗效果MTR法有着灵敏,简便,快捷等优点的同时也存在着局限性,主要表现在此法尚没有一个统一的技术标准,各家采用的药物浓度,加药时问,作用时间以及药物敏感标准的设立各不相同,导致难于资料积累和比较本实验对MTT法各环节进行了选择和优化,根据相关文献报道J,药物作用时间48H,MTT20L作用6H,单波长570NM处测值时,药物对肿瘤细胞的抑制率较高,实验效果也较好,因此本实验所有肿瘤细胞测定过程均在此相同条件下确立在药物浓度的选择上本实验主要采用棋牌滴定法,将抗肿瘤药物分别用09氯化钠溶液或葡萄糖水稀释成不同浓度,加入96孔培养板中,每个浓度一竖排,再取肿瘤细胞用培养液稀释成不同浓度,加入96孔板,每个浓度一横排,按常规MR丌方法的步骤测定其抑制率,最后浓度按常规剂量血药浓度峰值配制本实验检测结果显示,对实体肿瘤组织的成功率及临床相关性不及白血病骨髓标本,这可能因为实体肿瘤组织常伴有污染,而且部分肿瘤质地坚硬难被剪碎消化使细胞分散不均匀,还有些有明显的纤维结缔组织增生,使药敏结果出现假阴性或假阳性RPMI一1640培养基PH值在7274之问,更接近体内白血病细胞的生长环境,这也是白血病细胞体外培养较成功的原因之一因此,实体瘤标本须在手术切除后立即放入无菌容器中,并于术后2H内送至实验室在处理标本时应用加双抗的培养液反复冲洗,并清除肿瘤表面黏膜,脂肪及纤维组织在分离肿瘤细胞时对一些质地坚硬的应使用机械与消化分离相结合的方法对标本量较小的可以适当延长培养时间由表1和表2实验数据所知,本实验所用的20种临床常用化疗药物对肿瘤细胞的抑制率存在很大的差异,对白血病敏感IR30者只有2种,可见白血病的多药耐药性使其对多数抗肿瘤药物不敏感对脑肿瘤敏感的药物有4种,这可能与血脑屏障这个特殊因素有关,对胃癌敏感药物有8种,对乳腺癌敏感者共有7种因此,在临床上用同一种化疗药物或同一个化疗方案治疗不同的肿瘤患者,显然带有一定的盲目性通过体外MTF药医药导报2010年8月第29卷第8期1005敏试验,针对不同患者在其化疗用药前,测出肿瘤细胞对各种药物的敏感程度,从而施行化疗方案个体化,能更好地提高化疗效果,为临床及患者服务DOI103870/YYDB201008008参考文献1MOSMANNTRAPIDCOLORIMETRICASSAYFORCELLULARGROWTHANDSURVIVALAPPLICATIONTOPROLIFERARTIONANDCYTOTOXICITYASSAYSJ_IMMUNOLMETHODS,1983,651255632杨磊,宋诸臣,谭青和,等肿瘤体外药敏试验与临床实用研究进展J现代肿瘤医学,2008,1623063093BURTONJDTHEMR【R【1ASSAYTOEVALUATECHEMOSEUSITIVITY4567JMETHODMOLMED,2005,11016978曾庆华,吕新生,汤辉焕,等MTT测定恶性肿瘤细胞对化疗药物的敏感性J中国普通外科杂志,2000,96552554张俊英,梁永柜,李永强,等恶性脑肿瘤体外化疗药物敏感性试验初步报告J广东医学,2003,2477L57L7魏文青,赵满仓,刘晶,等MRITI肿瘤药物敏感试验的方法学研究J临床肿瘤学杂志,2008,1310871874杨建峰,秦良宜,刘原杰,等多药耐药基因表达检测在白血病治疗中的应用研究J白血病淋巴瘤,2001,1029596两种植物来源金果榄药材降血糖作用比较王永慧,杨光义,冉培红,叶方郧阳医学院附属太和医院药学部,湖北十堰442000摘要目的比较两种植物来源金果榄药材降血糖作用方法选用四氧嘧啶复制糖尿病小鼠模型,以二甲双胍作为阳性对照药,将青牛胆,金果榄两种植物来源的金果榄药材的半仿生煎煮据取液灌服小鼠,通过检测模型小鼠给药前后血糖水平,计算血糖下降百分率,对二者降糖作用进行比较结果青牛胆与金果榄均具有显着的降血糖作用,其血糖下降百分率均明显高于模型对照组,且青牛胆高剂量组血糖下降百分率高于金果榄高剂量组结论青牛胆降血糖作用优于金果榄关键词青牛胆金果榄降血糖作用比较中图分类号R2855文献标识码A文章编号10040781201008100503COMPARETHEHYPOGLYCEMIAEFFECT0FTWOKINDSOFTINOSPORASAGIATAOLIVGAGNEPWANGYONGHUI,YANGGUANGYI,RANPEIHONG,YEFANGDEPARTMENTOFPHARMACY,TAIHEHOSPITALAFFILIATEDWITHYUNYANGMEDICALCOLLEGE,SHIYANHUBEI442000,CHINAABSTRACTOBJECTIVECOMPARETHEHYPOGLYCEMIAEFFECTOFTINOSPORACAPILLIPESGAGNEPANDTINOSPORASAGITTATAOLIVGAGNEPMETHODSTHEHYPERGLYCEMIAMODELINMICEWASINDUCEDBYALLOXAN,ANDTHEMICEWEREIGADMINISTEREDWITHTHESEMIBIONICEXTRACTSOFTCAPIUIPESANDTSAGITTATATHEMETFONNINWASFEDASAPOSITIVECONTRO1THEHYPOGLYCEMICEFFECTSOFTWOEXTRACTSWERECOMPAREDBYTESTINGBLOODSUGARLEVELSBEFOREANDAFTERADMINISTRATION,ANDTHEPERCENTAGEOFDECREASERESULTSBOTHTSAGITTATAANDTCAPILLIPESSHOWEDSIGNIFICANTHYPOGLYCEMICEFFECT,WHILE,HIGHDOSEOFTSAGITTATADECREASEDBLOODSUGARMOREOBVIOUSLYTHANTHATOFTCAPILLIPES

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