产纤维素酶微生物在农业秸秆资源化中的应用

国内图书分类号X712密级公开国际图书分类号西南交通大学研究生学位论文年姓专二O一五年五月万方数据CLASSIFIEDINDEXX712UDCSOUTHWESTJIAOTONGUNIVERSITYMASTERDEGREETHESISAPPLICATIONOFCELLULASEPRODUCINGMICROORGANISMSAGRICULTURALSTRAWRESOURCESGRADE2012CANDIDATECHENZHIJIAOACADEMICDEGREEAPPLIEDFORMASTERDEGREESPECIALITYENVIRONMENTALENGINEERINGSUPERVISOROUYANGFENG一一万方数据西南交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权西南交通大学可以将本论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复印手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于1保密口，在年解密后适用本授权书；2不保密使用本授权书。请在以上方框内打“”学位论文作者签名19B扔吱趋指导老师签名日期妒侈歹，万日期沙蜉，罗法万方数据西南交通大学硕士学位论文主要工作贡献声明本人在学位论文中所做的主要工作或贡献如下1研究筛选出了秸秆降解效率较高的实验室获取里氏木霉工程菌；2通过化学方法及气相色谱分析秸秆降解产物性质；3通过单因素实验法及PB设计、BB设计确定了实验室获取里氏木霉工程菌的最佳培养条件。本人郑重声明所呈交的学位论文，是在导师指导下独立进行研究工作所得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明。本人完全了解违反上述声明所引起的一切法律责任将由本人承担。学位论文作者签名7际涮、日期。JJ。J、2J万方数据西南交通大学硕士研究生学位论文第1页摘要现阶段我国秸秆产量十分庞大，但暂无有效的方法处理秸秆，为了提高秸秆利用率，同时降低由于秸秆的焚烧及其他不当处理方式引起的环境污染问题。实现农业可持续发展及解决秸秆资源化利用的问题迫在眉睫。本次实验，首先选取本校生命科学与工程学院实验室通过基因工程获取的三株里氏木霉工程菌，针对3株微生物的产纤维素酶活性进行了筛选，通过测定3株实验室获取的里氏木霉工程菌的酶活性，从而判断3株微生物的产酶量及生长情况，最终得出结论其中编号为25的里氏木霉工程菌酶活性较低；编号为107的里氏木霉工程菌，表现出酶活性变化幅度大，不稳定；编号为85的里氏木霉工程菌在实验过程中酶活性较高，且稳定，比较适宜于后续实验。同时根据产糖率的测定，得出编号85的里氏木霉工程菌有着较高的秸秆降解率，进一步验证了上一步实验的准确性，最终确定编号85的里氏木霉工程菌可进一步运用于后续实验。其次，对编号85的里氏木霉工程菌降解秸秆产物进行了研究，得出秸秆经过里氏木霉工程菌降解后产生物质为不含淀粉的多糖类物质。且根据气相色谱实验可知，该多糖是由鼠李糖C6H1205、阿拉伯糖C5HL005、木糖CSHL005、甘露糖C6H1206、半乳糖C6H1206等单糖组成。多糖的活性与其组成有很大关系，且研究多糖的组成是后续研究该种多糖活性的基础实验，因此本次实验为今后秸秆降解产生的多糖性质研究打下了基础，有利于秸杆资源的进一步开发利用。最后，本次实验对里氏木霉工程菌降解秸秆条件进行了优化，通过单因素实验法，得出在秸秆添加量为4、起始PH值55、培养温度30、转速200RMIN、接种浓度107个ML、发酵时间第5天、装液量为75ML时，编号为85的里氏木霉工程菌可达到最大酶活性。但是单因素法往往不能准确预测各个因素之间的交互作用，故本次实验后续利用PLACKETTBURMANPB方法筛选影响产酶的重要因素，得出对里氏木霉产纤维素酶影响的显著性排列为培养温度培养时间装液量接种浓度秸秆添加量转速初始PH值，其中，发酵温度、发酵时间、装液量影响最为显著，进一步利用BOXBEHNKEN法设计实验优化培养条件，最后通过响应面的分析可知，确定最佳培养条件为为培养温度32，发酵时间55天，装液量75ML。关键词里氏木霉工程菌；发酵产物；最佳培养条件万方数据西南交通大学硕士研究生学位论文第LL页ABSTRACTATTHEPRESENTSTAGEAT，STRAWPRODUCTIONISVERYLARGEINOURCOUNTRY，BUTFORNOWTHEREISNOEFFECTIVEWAYTOUSESTRAWINORDERTOACHIEVESUSTAINABLEAGRICULTURALDEVELOPMENTANDSOLVETHEPROBLEMOFRESOURCEUTILIZATIONOFSTRAWWHILEREDUCINGENVIRONMENTALPOLLUTIONPROBLEMSCAUSEDBYTHEBURNINGOFSTRAWANDOTHERIMPROPERHANDLINGCAUSEDTHEFIRSTEXPERIMENTWERESCREENEDFORTHEUNIVERSITYCOLLEGEOFLIFESCIENCEANDENGINEERINGLABORATORYOBTAINEDTHROUGHGENETICENGINEERINGPROJECTTHREESTRAINSOFTREESEISTRAINPRODUCINGCELLULASEACTIVITYWERESCREENEDTODETERMINETHEAMOUNTOFTHREEMICROBIALENZYMEPRODUCTIONANDGROWTH，ANDULTIMATELYCONCLUDEDWHICHNUMBERED25REESEIPROJECTACTIVITYLOWER；NUMBERED107FREESEIENGINEEREDBACTERIASHOWEDACTIVITYCHANGEDMUCH，ANDUNSTABLE；NUMBERED85REESEIENGINEEREDBACTERIAACTIVITYDURINGTHEEXPERIMENTHIGHERANDMORESTABLE，MORESUITABLEFORSUBSEQUENTEXPERIMENTSATTHESAMETIMEBASEDONTHEMEASUREDRATEOFSUGAR,NUMBERED85DRAWREESEIENGINEEREDBACTERIAHAVEAHIGHERRATEOFSTRAWDECOMPOSITION，FURTHERVALIDATETHEACCURACYOFTHEPREVIOUSSTEPOFTHEEXPERIMENT，TOFINALIZETHENUMBER85TRICHODERMAREESEIENGINEEREDBACTERIACANBEFURTHERUSEDFORSUBSEQUENTEXPERIMENTSSECONDLY，THEMAGNITUDEOFTRICHODERMAPRODUCTSWEREDIGESTEDSTRAWRESEARCH，DRAWSTRAWSAFTERTREESEIENGINEEREDBACTERIADEGRADATIONOFPOLYSACCHARIDESCONTAININGNOSTARCHMATERIALACCORDINGTOGASCHROMATOGRAPHYEXPERIMENTSANDFOUNDTHATTHEPOLYSACCHARIDELRHAMNOSEC6H120S，MONOHYDRATECSHLOOS，LARABINOSECSHL005，XYLOSEC6H1206，MANNOSEC6H1206，GALACTOSEANDC6H1206OTHERMONOSACCHARIDESPOLYSACCHARIDECOMPOSEDOFITSGREATRELATIONSHIP，ANDSTUDYTHECOMPOSITIONOFTHEPOLYSACCHARIDESAREPOLYSACCHARIDESACTIVEFOLLOWUPSTUDYONTHEBASISOFEXPERIMENTS，SOTHISEXPERIMENTISTHEFUTUREOFTHESTRAWDECOMPOSITIONPROPERTIESOFPOLYSACCHARIDESPRODUCEDBYTHEFOUNDATION，STRAWRESOURCESINFAVOROFFURTHEREXPLOITATIONFINALLY，THISEXPERIMENTALSOREESEIENGINEEREDBACTERIAPRODUCEAPOLYSACCHARIDEDEGRADATIONOFSTRAWFERMENTATIONCONDITIONSOPTIMIZEDBYSINGLEFACTOREXPERIMENT，OBTAINEDINSTRAWDOSAGE4，INITIALPH55，TEMPERATURE30，SPEED200RMIN，INOCULATIONCONCENTRATION10L|ML，THEFERMENTATIONTIMEOFTHEFIRSTFIVEDAYS，WHENTHELIQUIDVOLUMEIS75MLNUMBERED85REESEIENGINEEREDBACTERIACANREACHMAXIMUMACTIVITYUNIVARIATELAWS万方数据西南交通大学硕士研究生学位论文第LII页OFTENCANNOTACCURATELYPREDICTTHEINTERACTIONBETWEENVARIOUSFACTORS，SOTHISEXPERIMENTSUBSEQUENTUSEPLACKETTBURMANPBMETHODSOFSCREENINGANIMPORTANTFACTORAFFECTINGTHELEVELOFCONDITIONSWHENENZYMEPRODUCTION，OBTAINEDFIBERPRODUCINGTRICHODERMAREESEISIGNIFICANTINFLUENCELUCIFERASEARRANGEDASFOLLOWSCULTURETEMPERATUREINCUBATIONTIMELIQUIDVOLUMEINOCULATIONCONCENTRATIONSTRAWAMOUNTSPEEDINITIALPHVALUEAMONGTHEM，THEFERMENTATIONTEMPERATURE,FERMENTATIONTIME，WASTHEMOSTSIGNIFICANTAMOUNTOFIMPACTLOADING，FURTHERUSEOFBOXBEHNKENEXPERIMENTALDESIGNMETHODTOOPTIMIZETHECULTURECONDITIONS，ANDFINALLYBYTHERESPONSESURFACEANALYSISSHOWSTHAT，TODETERMINETHEOPTIMUMCULTURECONDITIONSFORTHECULTURETEMPERATURE32，FERMENTATIONTIME55DAYS，LIQUIDVOLUME75MLKEYWORDSSCREENINGOFTRICHODERMAREESEIENGINEERINGBACTERIA；OPTIMUMCULTURECONDITIONS；FERMENTATIONPRODUCTS万方数据西南交通大学硕士研究生学位论文第L页目录第L章绪论111研究背景。1111国内农业固体废物处理现状1112国内外农业固体废物秸秆的利用及发展现状1113运用微生物法利用秸秆资源的发展现状312降解秸秆微生物的研究进展4121产纤维素酶微生物的研究进展4122里氏木霉的研究进展413产纤维素酶微生物降解秸秆机理及产物测定研究进展5131产纤维素酶微生物降解秸秆机理研究进展5132产纤维素酶微生物降解秸秆产物测定研究进展614产纤维素酶微生物降解秸秆条件优化的研究进展6141单次因子实验设计法7142PLACKETTBURMAN设计7143响应面设计715论文研究目标、研究内容、拟解决的问题及技术路线8151研究目标8152研究内容8153拟解决的关键技术问题9154技术路线9第2章实验室获取里氏木霉工程菌的选择1121实验材料与方案11211实验材料1L212实验方案1322实验结果及分析16221葡萄糖标准曲线的绘制16221酶活性测定的结果及分析16222产糖率的测定结果及分析1923实验结论21万方数据西南交通大学硕士研究生学位论文第1I页第3章里氏木霉菌酶解秸秆产物研究2231实验材料与方案22311实验材料22312实验方案2332实验结果及分析25321降解产多糖的理化性质分析25322降解产多糖的单糖组分分析2633实验结论27第4章里氏木霉工程菌降解秸秆条件的优化2841实验材料与方案28411实验材料_284。12实验方案2942实验结果及分析31421葡萄糖标准曲线的绘制314。22里氏木霉工程菌产酶条件的单因素实验结果分析31423里氏木霉工程菌产酶条件的响应面法优化试验3843实验结论45结论及展望47结J沧47展望48致谢50参考文献51攻读硕士学位期间发表的论文56万方数据西南交通大学硕士研究生学位论文第1页第L章绪论11研究背景111国内农业固体废物处理现状从古至今，我国就是一个农业生产大国。随着时代的发展、科技的进步，我国粮食产量也有了很大提升。但与此同时，随着粮食产量的大幅提高，也伴随产生了大量的农业固体废弃物。其中产生量最大的农业固体废弃物就是秸秆。据统计，我国每年秸秆的产生，主要集中在水稻、玉米、小麦这三种粮食作物上，秸秆产生总量可达到7亿多吨【11。虽然在我国秸秆产量有着大幅的增加，但大部分地区对秸秆的利用率一直较低，主要处置方式依旧是随意焚烧或随意丢弃于农田内。秸秆内含有大量可利用资源，其中纤维素含量约占总量的30、蛋白质含量约占5，同时还含有少量的矿物质钙、磷等，是重要的生物质资源【21。因此大量农业固体废物秸秆的随意丢弃在一定程度上已经造成了较为严重的资源浪费及经济损失。同时，秸秆在燃烧时，会产生大量的有机及无机气态污染物，主要包括一氧化碳、二氧化碳、氮氧化物、苯等。产生的这些污染气体一旦进入大气，就会造成严重的大气污染情况，从而污染大气环境，这一污染现阶段也是我国农业面源污染的重要来源【3】O随着我国经济水平的提高、科技力量的进步及人民和国家环保意识的提高，农业秸秆之前被视为农业固体废物，现阶段我国研究人员都已经逐步认识到了农业固体废物秸秆的再利用价值。秸秆的资源化利用现阶段逐渐成为技术热点，同时随着秸秆的再利用，也会给我国经济的发展及环境保护作出贡献【41。112国内外农业固体废物秸秆的利用及发展现状近年来，为了实现农业可持续发展及解决秸秆的资源化利用的问题，国内外都出现了很多更加经济、环保的秸秆综合利用手段，秸秆利用技术主要包括秸秆能源化、万方数据西南交通大学硕士研究生学位论文第2页秸秆肥料化、秸秆饲料化及秸秆工业原料利用等卯。接下来重点介绍以下几种主要的秸秆资源化利用技术1秸秆能源化技术秸秆是重要的能源材料，经常作为农村的重要生活燃料被利用，但是存在燃烧率过低，同时产生较多污染物的问题。根据查阅文献资料总结，现阶段应用较广泛的秸秆能源化技术主要有，直燃供热、秸秆气化集中供气、秸秆发酵制沼气、秸秆压块成型及炭化等技术61。现阶段，国外一些国家已经实现采用大型秸秆锅炉供热、发电的技术，主要有英国、荷兰、丹麦等国家71。我国开始研究秸秆能源化技术的起步时间较晚，虽然现阶段的技术，已经有了一定的成果，也开发出了一些有效的利用系统，但是由于技术还不是很完善，有些技术在运用过程中会产生一些二次污染，造成总体利用效率过低等问题，所以现阶段我国在秸秆能源化技术方面的应用还需要进一步研究【8】O2秸秆肥料化技术稻秆肥料技术也称作为秸秆还田，即将秸秆粉碎后，抛洒于田地间，随着翻耕土地，秸秆进入土壤，在土壤内腐烂分解作为一种肥料的技术91。秸秆中含有一定量有用的元素，如碳C、氮叫、磷P、钾K等。秸秆肥料化还田后这些有用的元素可以重新作用于土壤，进一步增加了土壤的肥力，同时也减少了种植过程中化肥的使用量。秸秆除了直接还田外，还有多种利用秸秆的堆肥方式，将秸秆通过一些工艺，制成秸秆复合肥，使用后，进一步增加土壤肥力，可以增加农田的农作物产量。目前，国内外对于农业秸秆还田技术有较多研究及应用，且秸秆还田对农业生态系统呈现正效应，但是对于不同地区，不同耕作条件下产生的具体生态效应还缺少研究【101。下一步，研究人员应针对不同区域，根据实际情况对秸秆肥料化技术进行进一步研究。3秸秆饲料化技术秸秆中含有大量的纤维素、半纤维素类物质，直接作为饲料，饲养动物，无法被动物很好的消化11。所以在实际应用中，通常将秸秆通过物理法、化学法、生物法等万方数据西南交通大学硕士研究生学位论文第3页处理方法进行加工处理，使其饲料化，更好的被动物消化【12】。不同的处理法，由于操作原理不同，在运用过程中有着不同的特点，物理法，操作方法较简单，易于应用，但不能很好的增加秸秆的营养价值，效率不高；化学法，可以很好的提高秸秆的采食量以及在动物体内的消化率，但由于添加化学试剂，会造成残留过多化学试剂的问题，且该方法费用高；生物法，处理效率较高，能很好的提高秸秆饲料在动物体内的消化率，同时有效的增加了秸秆饲料的营养价值，但由于微生物处理对外在条件要求较高，如果大面积推广，目前的技术还不能很好的解决，且处理过程如果不能严格控制，容易造成秸秆饲料的腐烂【13】。4秸秆工业化利用技术现阶段，秸秆有较多的工业化应用方法，例如利用秸秆生产保温材料、利用秸秆造纸、秸秆作为菌种培养基、秸秆制作各类包装材料及板材、秸秆酿酒、提取淀粉竺【14寸。秸秆有着成本低，且环保的优点，现阶段有很多研究表明秸秆工业化应用有很好的发展前景，在我国，利用秸秆造纸有着很长的历史，但过去由于技术等原因，秸秆造纸纸浆会对环境造成污染，现阶段，我国已经在这方面取得的突破性进展，解决了对环境的污染的问题，秸秆造纸技术可以大规模推广【15】。113运用微生物法利用秸秆资源的发展现状秸秆有着很特殊及复杂的结构，秸秆内纤维素及半纤维素反复缠绕，所以一般的物理、化学方法很难将其降解。生物法可以较高效的利用秸秆资源，生物法是利用微生物产生的纤维素酶有针对性的降解秸秆内的木质纤维素，它相较于物理法有较高的效率，相较于化学法可以避免化学试剂使用造成的环境污染，是一种相对高效环保的方法，但运用生物法的关键是要获取有效的微生物【16】。自然界中如真菌、细菌和放线菌等均为产纤维素酶微生物。目前研究较多的是霉菌，其中木霉、曲霉、青霉均具有较强的酶活力，如里氏木霉TRICHODERMAREESEI、黑曲霉ASPERGILLUSMGER等171。现阶段，大量研究表明木霉在产纤维素酶微生物中具有较突出优点，主要为产纤维素酶酶量大且产生的酶系组成比较齐全，但它也存在比较明万方数据西南交通大学硕士研究生学位论文第4页显的缺点，如不能有效利用木质素、13葡萄糖苷酶的活性较低，产生较慢等18】。由于上述原因，使得木霉应用于较大规模的工业化生产受到限制，所以选育优良菌种成为了今后研究的重要课题【191。现阶段选育优良菌的主要方法即通过改变菌株的遗传结构，筛选和构建基因工程菌。优化菌株内原有的纤维素酶合成基因，通过实验室试验获得最优的培养条件，从而将产纤维素酶微生物及早运用于大规模工业化生产，同时以达到降低工业化生产成本、提高纤维素酶产量的目的【201。12降解秸秆微生物的研究进展121产纤维素酶微生物的研究进展在19世纪80年代就有人对降解纤维素的产纤维素酶菌种类进行研究【21】。20世纪以来，根据国内外文献及报道统计，产纤维素酶的菌株大概有53个属，多达近千种221。科研人员通过各种方法培育出多种产纤维素酶微生物，同时对产纤维素酶微生物降解纤维素性能进行深入研究，从而得出各种微生物的最优生长条件及对纤维素的最大降解效率【231。根据现阶段研究情况得出，微生物破坏秸秆所含的纤维素及半纤维素主要存在两种方式微生物先进入纤维素内部，然后逐步向外部侵蚀；微生物先附着于纤维素外部，然后缓慢向内部侵蚀【24，251。常见的产纤维素酶微生物主要是好气性纤维素分解菌和嫌气性纤维素分解菌口61。其中常见的微生物种类包括真菌、放线菌和细菌，这三种微生物中真菌对纤维素的降解能力是最强的，同时近些年对真菌类产纤维素酶微生物的研究也比较深入271。常见的产纤维素酶菌如纤维单胞菌属CELLULOMONAS、木霉TRICHODERMA、链霉菌属STREPTOMYCES、镰刀菌FUSARIUM、纤维素诺卡氏菌NOCARDIACELLULANS、芽孢杆菌属BACILLUS、青霉口EILICILLUM等等口81。122里氏木霉的研究进展里氏木霉TRICHODERMAREESEI是一种可以产生胞外纤维素酶的微生物，其产生的纤维万方数据西南交通大学硕士研究生学位论文第5页素酶是一种复合酶，是由内切葡聚糖酶、纤维二糖酶、13葡萄糖苷酶三种酶组分构成的291。其中纤维素酶降解纤维素的机理是，内切葡聚糖酶的作用在纤维素分子内部任意B1，4糖苷键上，使其断裂，从而使天然纤维素裂解为直链纤维素，接下来纤维二糖酶、B葡萄糖苷酶接着作用于直连纤维素，直到纤维素被分解为单糖或多糖类化合物30,31】。除此之外，里氏木霉还具有其他优点，如纤维素酶产量较高且产纤维素酶量稳定、产生纤维素酶为胞外酶易于分离提纯、培养过程简单易且于控制的32,33】。因此，里氏木霉是最常用微生物降解纤维素的一种产酶菌种【34】。本次实验主要运用西南交通大学生命科学与工程学院实验室通过基因工程获取的三株实验室编号分别为25、107、85的里氏木霉工程菌。13产纤维素酶微生物降解秸秆机理及产物测定研究进展131产纤维素酶微生物降解秸秆机理研究进展产纤维素酶微生物产生的纤维素酶可以高效的降解秸秆内的纤维素。秸秆内难降解的纤维素在微生物产生的纤维素酶作下可以被分解成易于利用及转化的小分子纤维素、纤维寡糖、纤维二糖、葡萄糖等【351。微生物产生纤维素酶水解纤维素是一个十分繁杂的过程，自从研究人员意识到微生物降解秸秆有很大应用前景后，就有大量人员参与研究产纤维素酶微生物降解秸秆机理，但是至今任未完全研究清楚其作用机理，但是众多研究普遍认同，必须同时依赖三种酶的共同作用才能顺利完成纤维素的全部水解过程361。这三种酶就是组成纤维素酶的葡聚糖内切酶EG、葡聚糖外切酶CBH、13一葡萄糖苷酶BG【3丌。这些酶起到协同作用，共同作用于纤维素，水解纤维素结构中的B1,4葡萄糖苷键【381，从而把纤维素水解成易于利用的小分子。具体降解过程现在普遍存在以下两种理论有些研究人员认为这些酶没有特定的作用顺序，只是葡聚糖外切酶CBH作用于纤维素表面，从而让内部结构复杂的纤维素分子断裂成为较容易水解的末端部分带有发生游离的分子、葡聚糖内切酶EG则作用于经葡聚糖外切酶CBH活化的纤维素，分解其B1，4糖苷键，产生结构较为简单的纤维多糖，B葡萄糖苷酶BG再将纤维二糖、三糖等分解【39】；另一些研究人员则持另一种看法，认为纤维素酶降解秸秆过程应该是由葡聚糖内切酶EG，随机水解131，4糖苷键，从而有大量的带非还原性末端的小分子纤维素产生，然后这些非还原性末端上的糖苷键被葡聚糖外切酶CBH水解，生成大量的纤维二糖及其它小分子纤维素，在13葡萄糖苷酶作用下水解成各种多糖及单糖分万方数据西南交通大学硕士研究生学位论文第6页二Z【40，4L】JO以上两种不同的理论，都证明了组成纤维素酶的三种酶之间存在着协同作。132产纤维素酶微生物降解秸秆产物测定研究进展秸秆内纤维素由于结构复杂，不能直接被利用，必须水解成易于利用的小分子化合物，才能被微生物利用，进行下一步发酵。产纤维素酶作用于秸秆主要产生单糖及多糖类物质，所以本次实验主要研究秸秆发酵产生哪些单糖。多糖是由初级结构、高级结构共同构成完整的多糖结构，初级结构包括1级结构，高级结构包括2、3、4级结构【42】。现阶段研究表明，对于结构的测定还存在一定的困难，且相关报道方面，测定L级结构文献要多于高级结构测定的文献。在测定多糖结构前需经过提取、分离、纯化来获得便于后续分析的多糖，然后经过各种方法对其性质进行分析判断，最终确定为多糖后再进行下一步的理化结构测定研究【43J。根据现阶段研究进展，可知有很多方法可以测定多糖的初级结构，现阶段常用的分析方法主要包括3类即化学分析法、仪器分析法、生物学方法MJ。化学分析主要优点即法操作较简单，主要有完全酸水解法、部分酸水解法、高碘酸氧化法、过碘酸盐氧化法、SMITH裂解法、甲基化反应等方法，现阶段化学法已发展较为成熟【45】；仪器分析法是在利用化学分析法为基础的情况下，利用各种仪器更加深入的分析多糖的结构特征，这种方法具有更加快速、准确的特点，现阶段在研究时有较多应用。现阶段多糖结构分析运用较多的仪器主要有比旋光光度仪、红外光谱仪、紫外分光光度计、液相色谱仪、气相色谱仪、质谱、电泳技术等461；生物学方法主要是酶法和免疫学法【47|。14产纤维素酶微生物降解秸秆条件优化的研究进展根据现阶段研究表明，影响微生物产纤维素酶的因素包括微生物接种量、培养基配置及反应条件培养温度、初始PH、摇床转速、培养时间等不同的影响因素。秸秆的降解率会随着各个因素的变化而不同，所以对培养条件的优化，可以提高产纤维素酶菌对秸秆的降解效率，从而在后续生产过程中，可以对其降解过程进行操控。但由于微生物降解秸秆的过程是一个复杂的过程，所以必须要通过建立准确的模型，多方面综合考虑影响因素以确定接近实际情况，合理的实验方案。现阶段国内外对于微生物发酵条件的优化多只采用一种试验方法或少数几种实验方法，但由于微生物培养的万方数据西南交通大学硕士研究生学位论文第7页特殊性，一种方法往往不能有很好的效果【481。现阶段，存在若干种试验设计及实验条件优化的方法，包括单次因子实验设计法、析因设计、全因子设计、部分因子设计、正交设计、PLACKETTBURMAN设计、均匀设计、响应面设计包括BOXBEHNKEN设计、中心组合设计等、人工神经网络及遗传算法等，众多试验设计和实验条件优化的方法【491。本次毕业设计主要运用单次因子实验设计法及响应面设计中的BOXBEHNKEN设计来实现里氏木霉工程菌降解秸秆条件的优化。141单次因子实验设计法单次因子实验设计法，又称“单因素法”，是目前实验室内最常用的培养条件优化法。这是一种假设各个影响因素之间不存在交互作用，每次只改变其中一个影响因素而其他影响因素不变的实验方法。该实验方法有很明显的特点，即简单、易于理解、得到实验结果后不需要专门的统计软件进行分析，但也存在显著缺点，即忽略了各个因素之间的交互作用，结果不够准确，在实验过程中如果影响因素较多，就会产生较大误差【50】。142PLACKETBURMAN设计PLACKETTBURMAN设计PB设计，是根据这种实验设计的发明者PLACKETT及BURMAN命名的。这种实验方法的设计原理是不完全平衡二水平试验，主要通过对每个因子取高低两个水平来进行分析【51|。当需要考虑的因素较多时可通过PB设计在最少实验次数的情况下找到对结果影响最大的主要因素，从而达到筛选实验主要因素的作用。一般情况下，PB设计可通过N次实验研究N1个影响因素，但一般情况下，为了达到更好的效果，实际估算因素都少于N1个，要在实际因素中添加多于1个的虚拟变量，估算误差【521。PB设计的优点是可以同时应用于多个实验因子，可以较为方便快捷的筛选出众多实验影响因素中的主要影响因素【53551。同时，PB设计的缺点就是虽然可以较为快捷的筛选出主要因素，但是无法直观的体现出各个因素间的相关作用。143响应面设计响应面设计法是一种数学方法与统计方法的结合，可以在多因素影响的实验中求解出最佳条件【56581。响应面设计与其他实验方法比较，响应面回归分析可以更加准确万方数据西南交通大学硕士研究生学位论文第8页的找到各个影响因素的最佳条件，且准确度高，同时可以建立连续变量曲面模型，通过模型中的曲面内找到实验的最佳控制点，快速有效的确定多个影响因素的最佳条件。响应面分析方法现阶段较多的应用于许多微生物培养阶段的优化【59】。现阶段，发酵过程的优化中较常用的响应面设计包括BOXBEHNKEN设计、中心组合设计【6们。其中BOXBEHNKEN设计是一般用于三因素实验设计，其中每个因素取3个水平，分别为最低值、平均值、最高值，然后设计实验表，根据实验表，完成试验后，运用响应面分析法对试验得到的数据进行进一步分析，得出最优的培养条件【671。15论文研究目标、研究内容、拟解决的问题及技术路线151研究目标在实验室条件下，主要针对农业固体废物资源利用展开研究。研究以农业固体废物秸秆为原材料，利用实验室既得的3种产纤维素酶微生物里氏木霉工程菌降解秸秆中纤维素类物质，通过对微生物产生纤维素酶的酶活性及分解产物中还原糖量的测定，得出这三株产纤维素酶微生物对秸秆的降解效率，同时对微生物降解秸秆产物性质进行定性研究。最后通过实验得出实验室获取的产纤维素酶微生物降解秸秆的最优条件。本次实验可以提高有工业生产价值的多糖类产物生成率，有利于提高微生物降解秸秆的效率，为农业固体废物秸秆的资源化利用和生物质能源的科学研究提供技术和实验数据支撑，同时为微生物在降解木质纤维素类物质的资源化利用奠定基础。152研究内容1通过对国内外相关研究论文及资料数据的研究，阐述国内外秸秆发酵的生产技术情况，最终确定本项目的研究方法及内容。综合我国现状及各方面情况分析现阶段能源紧缺的情况得出本次研究的必要性。2通过培养我校生命科学与工程学院实验室获取的三株产纤维素酶微生物里氏木霉工程菌，实验室编号分别为25、107、85；分别对这三株微生物进行实验室培养，最终通过测定每株里氏木霉工程菌的酶活性及还原糖量的测定，从而比较不同里氏木霉工程菌对玉米秸秆的降解效率，确定降解效率较高的里氏木霉工程菌，进行下一步的研究。3分离纯化利用实验室得到里氏木霉工程菌降解玉米秸秆产生的多糖产物，对万方数据西南交通大学硕士研究生学位论文第9页其产物的性质及成分进行研究，为秸秆类农业固废经产纤维素酶微生物讲解后产生多糖产物的应用指明方向。4通过控制培养条件，主要研究培养条件为秸秆添加量、初始PH、培养温度、培养时间、培养转速、接种浓度、接种量7项。同时利用DESIGNEXPERT软件，通过PLACKETTBURMANPB方法筛选影响产酶的重要因素，进而利用BOXBEHNKEN设计响应面分析确定重要因素的最佳水平，对玉米秸秆经里氏木霉工程菌降解的发酵条件进行优化，从而提高里氏木霉工程菌对秸秆的降解率。153拟解决的关键技术问题1通过试验得出活性较好的里氏木霉工程菌；2筛选出的氏木霉工程菌降解秸秆产生的产物性质进行研究；3对筛选出菌株发酵秸秆的条件进行优化研究；154技术路线本课题拟采用的技术路线如下图所示万方数据西南交通大学硕士研究生学位论文第1O页图11实验研究技术路线图万方数据西南交通大学硕士研究生学位论文第11页第2章实验室获取里氏木霉工程菌的选择本章节主要是通过对实验室初步获取的里氏木霉菌酶活性的测定，初步筛选出产纤维素酶较稳定，且产酶活性较高的菌株，并通过产糖率的测定进一步验证产酶活性较高的菌株有较高的秸秆降解能力，进而选择出对秸秆降解率较高的里氏木霉工程菌，本次试验对秸秆的综合利用和减少环境污染有重要意义。21实验材料与方案211实验材料2111实验所用微生物实验所用微生物是由西南交通大学生命科学与工程学院实验室通过基因工程获取的三株的产纤维素酶微生物里氏木霉工程菌，实验室编号分别为25、107、85，获得微生物均在4冰箱保藏备用。2112实验所用秸秆收集于成都市浦江县附近的玉米秸秆。2113实验所需培养基本次试验主要用到2种培养基。为马铃薯培养基PDA培养基，主要用于培养里氏木霉工程菌、另一种为秸秆发酵培养基MA培养基，用于秸秆与里氏木霉工程菌的共同发酵。1马铃薯培养基固体的制备马铃薯200GL、葡萄糖209L、琼脂，1520GL、去离子水1L、自然PH；2秸秆发酵培养基液体的制备KH2P04，2GL、NH42804，14GL、尿素，03GL，FES04。7H20，0005GL、MNS04H20，00016GL、ZNS047H20，00014GL、COCL2，0002GL、MGS047H20，03GL、CACL2，039L、蛋白胨075GL，葡萄糖10GL、秸秆粉末烘干、打磨过筛10G、去离子水1L、调PH值至485O；2114测定酶活性所需试剂及溶液本次实验通过2种不同方法测定纤维素酶的酶活性，分别为羧甲基纤维素还原ZKQ20150924万方数据西南交通大学硕士研究生学位论文第12页糖法酶活性、滤纸FPA酶活，来初步筛选出对秸秆降解率较高的里氏木霉工程菌，所需溶液及配置方法如下1005MOLL柠檬酸缓冲液的配制准确称取柠檬酸24G，取约250ML蒸馏水，将24G柠檬酸溶于蒸馏水中需煮沸直至完全溶解，待柠檬酸在蒸馏水中充分溶解后加入柠檬酸三钠48G，待完全溶解且冷却后，将上述溶液移至后500ML容量瓶内，定容到500ML备用PH值应约为48。2滤纸条的准备将准备好的滤纸放入烘干箱内中烘干，将水烘干的滤纸制成宽1C1CM2的方形小块备用。3羧甲基纤维素钠CMCNA溶液的制备称取200G羧甲基纤维素钠，在烧杯内缓缓加入柠檬酸缓冲液约200ML，加热至羧甲基纤维素钠CMCNA完全溶解，冷却后再次利用柠檬酸缓冲液稀释至300ML，用低浓度的盐酸或氢氧化钠调节配置好溶液的PH到约为48时，定容至200ML，贮存于冰箱中备用。2115测定还原糖量所需试剂及溶液配置13，5二硝基水杨酸DNS试剂称取酒石酸钾钠900G，溶于250ML蒸馏水中，不超过50情况下加热，随后在热溶液中依次加入3，5二硝基水杨酸31G，NAOH，100G，苯酚25G，无水亚硫酸钠25G，同时用玻璃棒不停搅拌至加入药品完全溶解，待溶液冷却后用蒸馏水定容至500ML，贮存于棕色玻璃瓶中，室温保存一周后使用。2葡萄糖标准液的配置将葡萄糖在烘箱内烘干2小时，至葡萄糖重量不再变化，称取10000MG，3HA蒸馏水溶解并在100ML的容量瓶内定容，此时葡萄糖溶液为标准葡萄糖溶液，浓度为1MGML。2116实验所用仪器本次实验过程中用到仪器均列于下表ZKQ20150924万方数据西南交通大学硕士研究生学位论文第13页表21实验所用设备列表设备名称型号超净工作台SWCJ2FD型高温高压灭菌锅YX400B生化培养箱SHP250恒温震荡培养箱ZHOY2102F电热干燥箱DQG一9030A电子分析天平DHG9030A高速离心机TDL5ZW立式冰箱海尔BCD219SK紫外可见分光光度计52212实验方案2121预处理秸秆本次试验仅在实验初始阶段简单处理秸秆。首先，称取约2009玉米秸秆，清洗干净后，用电热干燥箱烘干后，充分研磨粉碎，最后用60目筛网过筛，储存于玻璃瓶内备用。2122里氏木霉工程菌的活化从80低温冰箱中取出实验室编号分别为25、107、85的里氏木霉工程菌QM9414，在38。C40水浴环境中适当摇动并快速复苏，直到内部结冰全部溶解为止该过程约需50SEC100SEC。取内容物1001TL移至制备好的马铃薯PAD固体培养基内，用五区划线法划线。将划好线的平板培养皿放入恒温震荡培养箱内进行培养，设定参数为30，180RPMMIN；培养48小时后，将长满了里氏木霉的马铃薯PAD平板培养皿用封口膜密封，倒置放于4冰箱中备用；2123里氏木霉工程菌孢子悬液的制备制备09的生理盐水1L，分装于9个250ML锥形瓶中，同时包好锥形瓶，与包装好的试管、三角瓶、漏斗内含12层滤纸和涂棒一起放于高压灭菌锅中在温度121条件下，灭菌30MIN。取出所需仪器后，在超净工作台上取5ML生理盐水于长满里氏木霉的马铃薯PAD平板中，用涂棒将孢子刮下。用含12层滤纸的漏斗对里氏木霉工程菌孢子进行过滤。向上述含有孢子的滤纸中加入2ML配置好的生理盐水，转入试管内，混合均匀，制成孢子悬液。同时使用细胞计数器对溶液内孢子进行计数，ZKQ20150924万方数据西南交通大学硕士研究生学位论文第14页调整孢子悬液的孢子浓度为106个ML。2124里氏木霉工程菌对秸秆的降解将制备好的含有秸秆的液体培养基加入锥形瓶内，每个锥形瓶加入50ML配置好的液体培养基，将锥形瓶包装好后，放于高压灭菌锅中在温度121条件下，灭菌20MIN。每个锥形瓶内接种49112ML的里氏木霉工程菌孢子悬液，于恒温30、180RMIN的恒温震荡培养箱内进行培养。2125葡萄糖标准曲线的绘制取6只25ML清洗洁净的干燥的比色管，按照下表流程操作表22葡萄糖标准曲线的测定步骤试管编号123456加入蒸馏水量ML252015。10O50加入葡萄糖标准液量ML00510。152025加入柠檬酸缓冲液量ML222222加入DNS试剂量ML222222沸水浴10MIN，迅速用流水冷却并定容至25ML，同时在540NM下测吸光度2126酶活性的测定【68,691粗酶液的制备分别于第1、2、4、6、8、10天取出每个菌株的3个摇瓶，过滤，取少量滤液提取粗酶液。将少量粗酶液约5ML，置于高速离心机内，以3500RMIN，离心，10MIN，取上清液即为粗酶液。将剩余滤液密封保存于冰箱内，用于后续实验。2滤纸酶活性FPA的测定测定步骤如下A取2支25ML的具塞试管，在做降解试验的同时做空白对照试验，首先分别向每只试管内加入准备好的滤纸约50MG作为底物，再分别向每只试管内准确加入15ML的PH约为48的柠檬酸缓冲液溶液；B在实验试管内加入准备好的待测酶液050ML，对照试管内不加酶液，同时使试管内溶液浸没准备好的滤纸；C将准备好的试管塞盖，同时将试管置于50水中水浴加热，反应60MIN；ZKQ20150924万方数据西南交通大学硕士研究生学位论文第15页D待充分反映后，立即拿出试管，分别在每只试管内加入DNS试剂30ML，此时在空白试管中缓缓加入稀释好的待测定酶液O5ML，再次在60热水中水浴加热10MIN，取出后利用流水冷却；E调整分光光度计波长为540NNL，测量各个待测样品的吸光度，同时对照标准曲线得出还原糖的含量，最终计算出酶活性。3羧甲基纤维素还原糖法酶活性测定A取2支25ML有刻度有塞试管，一只作为样品管、一只作为空白对照管，首先分别在每只试管内加入准备好的用柠配置好的羧甲基纤维素钠溶液2ML，再分别向每只试管内准确加入15ML的柠檬酸缓冲液溶液；B在样品试管内加入待测酶液O50ML，对照试管内不加酶液；C将准备好的试管塞盖，同时将试管置于50水中水浴加热，反应60MIN；D待充分反映后，立即拿出试管，分别在每只试管内加入DNS试剂30ML，此时在空白对照试管中同样加入待测酶液05ML，然后，再次在60水中水浴加热10MIN，取出试管后利用流水冷却；E调整分光光度计波长为540NM，测量各个待测样品的吸光度，同时对照标准曲线得出还原糖的含量，最终计算出酶活性。2127还原糖量的测定【70】在第1、2、4、6、8、10天取出装有不同里氏木霉工程菌的3个锥形瓶，取少量滤液用于测定其产糖量。具体操作步骤如下A取2支25ML有刻度比色管，一只作为样品管、一只作为空白对照管，首先分别向每只试管内加入准备100ML配置好的DNS试剂，再分别向每只试管内准确加入100ML的样品溶液，加热煮沸约6分钟，用流水快速降温；B向比色管内加入蒸馏水，定容至25ML，将试管内试剂摇匀，利用紫外分光光度计在波长540NLLL下，分别测量各个待测样品的吸光度，以测出的吸光度值对照标准曲线求出还原糖的含量。ZKQ20150924万方数据西南交通大学硕士研究生学位论文第16页22实验结果及分析221葡萄糖标准曲线的绘制测出不同浓度梯度的葡萄糖标准溶液分别为01MGML、02MGML、04MGML、06MGML、O8MGML、1MGM1，不同浓度吸光光度值如表23所示，根据表23测量结果，以吸光度数值为Y轴，葡萄糖含量为X轴，准确制图，做出葡萄糖浓度标准曲线如下图，在测定范围内显色，R2值为09991，表明线性良好。表23葡萄糖标准曲线测量所得结果按照表23作图，可得葡萄糖标准曲线如下图所示。一苗渊。J一OO2O4O6O3112葡萄糖量W札图21葡萄糖标准曲线221酶活性测定的结果及分析2211酶活性的定义本实验中酶活取国际标准的定义方法，即为酶促反应中每分钟生成1UTOOL葡萄糖所需的酶量为1个酶活性单位，计量单位为IUML。酶活力IUML竺蔓堕鱼尘公式21ZKQ20150924万方数据西南交通大学硕士研究生学位论文第17页式中N表示粗酶液的稀释倍数；556为表示还原糖的摩尔系数；A吸光度对应的葡萄糖浓度MGMLV表示酶解反应之后试管内溶液体积；T表示反应时NMIN；VL表示所加酶液体积。2212滤纸酶活性FPA的测定数据将经过培养并分别于第1、2、4、6、8、10天提取的不同菌株的粗酶液进行滤纸酶活性FPA的测定，实验时每个菌株设定空白1组，测定结果如下表所示表24不同微生物滤纸酶活性比较按照表24作图，可得不同菌株滤纸酶活性变化曲线如下图所示柏里氐木霉工程菌编号；一25107一1MFNL一掣姆箍_一85”O1ZJ4，口，5，1U时间D图22不同菌株滤纸酶活性FPA曲线根据表24及图22可得出，不同菌株随降解秸秆时间的增长，测得的滤纸酶活性FPA在前均呈现先上升后下降的趋势，其中编号为25的里氏木霉工程菌酶活性变化趋势较平缓，酶活性最高出现在培养第4天，酶活性达到203IUML，对比另外两株里氏木霉工程菌，明显酶活性较低编号为107的里氏木霉工程菌酶活性变化趋势较明显，在培养前6天不断升高，6天以后又有明显下降趋势，且酶活性变化较大，其中酶活性在培养第6天达到最大值451IUML，但相较第一天酶活性仅91IUML，可万方数据西南交通大学硕士研究生学位论文第18页以看出虽然该菌株产酶量较高，但酶活性表现不够稳定