物的合成与表征及其生物活性的测定

郑州大学硕士学位论文哌嗪类化合物的合成与表征及其生物活性的测定姓名赵文伯申请学位级别硕士专业应用化学指导教师何占航20070501郑州大学2007届硕J二毕业论文摘要本课题研究的主要目的为合成含有前手性的哌嗪衍生物，通过微生物的筛选，初步探索其转化为手性哌嗪衍生物的条件，同肘对这些化合物进行生物活性测试，探明其是否具有活性；尽量探索出更多的合成路线，为本课题组的后续工作做好铺垫在本课题的研究过程中，我们使用乙氧羰基作为保护基团，选择了苯乙酮类化合物苯乙酮、对甲氧基苯乙酮、对氟苯乙酮和2,4二氟苯乙酮作为哌嗪的前手性基团，合成了一系列具有前手性的哌嗪衍生物。并对1乙氧羰基4苯乙酮基哌嗪氢溴酸盐这一系列化合物进行了抗肿瘤活性试验，另外还初步探索了2甲基哌嗪、扁桃酸和1环氧丙基哌嗪等化合物的合成路线。一论文工作期间合成化合物20个，其中未见文献报道化合物2个，从结构分析，可以用于微生物转化的前手性化合物有17个。二合成方法操作简便易行，产率较高，具有很好的工业应用前景。三1乙氧羰基4苯乙酮基哌嗪氢溴酸盐这一系列化合物对于人肺腺癌细胞A549J均有很好的抑制率，其ID，0均在375TMOL1,以内，特别是1乙氧羰基42，4二氟苯乙酮基卜哌嗪氢溴酸盐活性最强，当浓度是2344TTMOLL时抑制率已达385，且随着浓度的增加对细胞的抑制作用迅速增加，当9375PMOLL时大部分细胞已被抑制。闪此这一系列化合物具有潜在的抗肿瘤药用价值，也许能够改良吡酮酸类药物的抗肿瘤活性。这部分工作及其结果未见文献报道。四通过微生物转化的尝试。我们得到了苯甲酸，但这不是我们期望的产物，所以还需要应该进一步的筛选微生物。我们通过碱性水解的化学方法得到了产物之一，但是因产率太低，目前还不适用，以后可以进行酸性水解试验。五合成的1乙酰基3甲基哌嚷、1苯甲酰基3甲基哌唪、扁桃酸乙酯以及1环氧丙基哌嗪等类化合物均可以进行生物转化，这三条路线也非常有发展前途。关键词哌囔手性前手性生物活性微生物转化郭州大学2007届硕士毕业论文ABSTRACT佻MAINPURPOSEOFTHISSTUDYISTOSYNTHESISPROCHIRAIPIPERAZINEDERIVATIVESTOEXPLOREINITIALLYTHECONDITIONSWHICHTRANSFORMEDINTOCHIRALPIPERAZINEDERIVATIVESTHROUGHMICROBIALSCREENING,TOPROVEWHETHERTLLEYHAVEACTIVITYTHMUGHBIOACTIVITYTEST；ANDTOEXPLOREMORESYNTHESISROUTESFOROURFOLLOWINGWORKINTHISSTUDY,WEUSEDETHOXYCARBONYLASAPROTECTIONGROUP，ANDCHOSEACETOPHENONECOMPO蚰如ACETOPBENONE,PMETHOXYACETOPHCNONC，PFLUOROACETOPHENONEAND2,4DIFLUOROACETOPBENONEASPIPERAZINEPROCHIRAIGROUPTOSYNTHESIZEDASERIESOFPROCHIRALPIPERAZINEDERIVATIVESATTHESAMETIMEWETESTEDANTICANCERACTIVITYOFTHECOMPOUNDSSUCHAS1ETHOXYCARBONYL4ACETOPHENONEPIPERAZINEDIHYDROBROHIDE。MOREOVERWEINITIALLYEXPLOREDTHESYNTHETICROUTESOFMANYCOMPOUNDSSUCHAS2METHYLPIPERAZINE，MANDELICACIDANDLEPOXYPROPYLPIPERAZINE120COMPOUNDSHAVEBEENPREPAREDINTHISTHESIS，2OFWHICHHAVENEVERREPORTED17OFTHEMCALLBEUSEDFORMICROBIALTRANSFORMATIONFROMTHEPOINTOFSTRUCTURALANALYSIS2ASTHEMETHODISSIMPLE，EASY,ANDWITHRELMIVELYHIGHYIELD，ITISOFGOODUSEININDUSTRY3ASERIESOFCOMPOUNDSSUCHASIETHOXYCARBONYL4ACETOPHENONEPIPERAZINEDIHYDROBROHIDEHAVEGOODINHIBITIONRATIOONHUMANLUNGADENOCAREINOMACELLLINEA549，WHOSELD如WEREALLWITHIN375PMOLLESPECIALLYLETHOXYCARBONYL42，4CLIFFUOROACETOPHENONEPIPERAZINEDIHYDROBROHIDEISMOREACTIVETHANANYOTHERCOMPOUNDSTHEINHIBITIONRATEHASREACHED385WHENTHECONCENTRATIONISONLY2344PMOVL,ANDTHEMORETHECONCENTRATIONINCREASETHEMORETHEINHIBITIONRATEINCREASEQUICKLYMOSTCELLSWEREINHIBITEDWHENTHECONCENTRATIONIS9375PMOLLSOSOMEOFTHESECOMPOUNDSHAVESHOWNTHEPOTENTIALVALUEOFANTICANCERMEDICINAL，ITMAYBEABLETOIMPROVETHEANTITUMORACTIVITYOFPYRIDONECARBOXYLICACIDSTHERESULTSOFTHISPANSHAVENEVERREPORTED4THROUGHTHEMICROBIALTRANSFORMATION，WEGOTBENZOICACIDBUTITWASNOTTHE郑州大学2007届硕士毕业论文PRODUCTWHICHWEEXPECTEDSOFURTHERSCREENINGOFMICROORGANISMISNEEDEDWEOBTAINEDONEOFTHEPRODUCTSTHROUGHTHEALKALINEHYDROLYSISMETHOD，BUTTHISMETHODSTILLNOTAPPLICABLEBECAUSEOFTHELOWYIELDNCACIDICHYDROLYSISCANBETESTEDINFUTRUE51一ACETYL3METHYLPIPERAZINE,IBENZOYL3一METHYLPIPERAZINE，ETHYLMANDELATEANDOXIRANYLMCTHYLPIPERAZINEETCWHICHWESYNTHETIZEDCANALLBEUSEDFORMICROBIALTRANSFORMATIONTHESETHREEMUTESAFEALSOPROMISINGKEYWORDSPIPERAZINECHIRALPROCHIRAIBIOACTIVITYMICROBIALTRANSFORMATIONIIL郑州大学2007届硕十毕业论文第一章概论L哌嗪及其衍生物的主要用途11哌嗪及其衍生物在医药领域的主要应用哌嗪及其衍生物主要用于毗酮酸俗称喹诺酮类抗生素【L】，哌嗪利福霉素类抗生素21，驱肠虫药嘲等，这几个品种占哌嗪在医药工业中总用量的909，具体为111毗酮酸类抗生素毗酮酸类抗菌药是继磺胺类全合成抗感染抗菌药物之后的又一类疗效优异的抗感染化疗药物。自萘啶酸问世以来，经过三十余年的发展，成为一大类广泛用于I缶床的广谱、高效、低毒且与其它抗生素无交叉耐药的抗感染化疗药物。国内主要产品有诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、培氟沙星、氟罗沙星、芒氟沙星、司氟沙星、左氟沙星、加替沙星等LO多个品种。112哌嗪利福霉素类抗生素哌嗪利福霉素是利福霉素SV的半合成衍生物，主要用于结核病和麻疯病的治疗，其品种有利福平、利福喷丁、利福定等。1I3驱肠虫药由哌嗪合成的驱肠虫药己二酸哌嗪、磷酸哌嗪、枸橼酸哌嗪等是一种安全有效的抗蛔虫、蛲虫药，它能麻癣蛔虫，使虫体不能附着于宿主肠壁，随肠蠕动而持出，通常哌嗪与有机酸生成的有机盐类驱虫药主要用J人体，而无机哌嗪盐则多用作兽药。114其它药物枸橼酸乙胺嗪用作抗丝虫药；哌硝噻唑和磷酸哌喹用作消炎药【4】；盐酸羟嗪用作镇静药；奋乃静、盐酸氟奋乃静、兰氟拉嗪用作抗精神病药；强痛定用作镇痛药；硫乙挣嗪用作镇吐药；去氯羟嗪用作抗过敏药；还有改善脑LNL液循环药桂利嗪、氟桂利嗪研及改善性功能和心脑血管功能的伟哥等。此外，高效降压药脉平宁的主要成分足哌唑嗪；茶碱乙酸盐哌嗪可用J治疗烧伤、休克和高血压61；哌嗪基烷胺基的喹啉和毗啶具有抗癌活性78】；各种哌嗪基醇及其衍生物具有麻郑州大学2007届硕1J毕业论文醉性能91。12哌嗪及其衍生物在化工及其它产业的应用10JLL哌嗪及其衍生物可作为表面活性剂，合成橡胶、合成纤维、合成树脂的稳定剂，固化剂、乳化分散剂、抗氧化剂及防腐剂等。2手性21手性基本知识112L有机化学中把分子本身和它的镜像不能重合的分子定义为手性分子，并把分子中的“不对称碳原子”改称为“手性碳原子”，“不对称中心”称为“手性中心”手性分子呈现旋光性。不具有旋光性的“对称分子”则被称为“非手性分子”。前手性分子是指分子本身不具有手性，是可以和自己的镜像重合的，但经过反应后可以转化为手性分子的分子。任何物体都有它的镜象，一个有机分子的镜像也同人照镜子一样，在镜子里会出现相应的镜象。把有机分子球棍模型放在镜子前，可以发现有些分子的实物和镜像是可以重合的。例如甲烷，乙烷等分子的模型与其镜像，它们互为实物和镜像，具有对映关系。还有一些有机物，两个互为实物与镜像关系的分子是不能重合的。例如苯乙醇分子模型与其镜像是不能重合的。我们把具有对映而不能重合关系的两个分子，彼此互称为对映异构体ENANTIOMER。PASTEUR在100多年前曾指出宇宙是非对称的，如果把构成太阳系的全部物体置于一而跟随着它们的各种运动向移动的镜子前而，镜子中的影像不能和实体重合，生命由非对称作崩所主宰。手性分子的对映体町以有几乎完全相同的物理化学性质，甚至有相同的光谱，但是它们之间仍然存在有重要的差别，那就是和其它手性分子间反应性的差别。自然界中存在许多光学对映体，这些物质就象人的左右手，立体结构对称，左右相反，绝小能重合，其气味、味道以及作用都可能大相径庭，一方有益，而另一方则可能有害。22手性药物概述2L世纪无疑将是手性的世纪。我们周围的世界是手性的，它是生物系统的基本特征，是人类赖以生存的自然界的本质属性之一，生命现象中的化学过程都2郑州人学2007届硕十毕业论文是在高度的不对称的环境中进行的，构成有机体的物质大多都具有一定空间构型”习天然有机化学的研究成果表明，许多有重要应用价值的天然有机物是光学活性的，也即是具有旋光性的，例如，河豚毒素TETRODOTOXIN是一种从河豚鱼肝脏中分离出来的极毒物质，在神经生理研究中有重要的意义，其毒性与C9的立体构性有关C9为S构型天然得到的化合物是极毒的，而C9为R构型则毒性很小。许多中草药的有效成份也是具有光学活性的，例如，从治疟中草药青篙中分离出来的有效成份青篙素QINGILAOSU，其中的主要成份也是光学活性的。在合成药物中，许多近期的研究结果表明，含有手性中心的药物，其药效与分子的立体构型有密切关系。往往一种立体异构体有药效，而它的镜像分子则药效很小，甚至完全没有药效或具有相反的药效在药理研究上，将活性最高的立体异构体叫做EUTOMER，而活性最低的异构体称为DISTOMER希腊语，EUGOOD，DISBAD。在许多情况下，DISTOMER不但本身没有药效，还会部分抵消EUTOMCR的药效，有时还会产生有毒的代谢产物或引起严重的副作用。生物体内的手性环境，如酶、受体、抗体等与药物对映体的生物活性密切相关。生物体的酶和细胞表面受体是手性的，外消旋药物的两个对映异构体在体内以不同的途径被吸收、活化或降解【141药物对映体和它们的代谢物常常表现出不同的药理和药代特性，这两种对映体可能有相等的药理活性，或者一种可能是活性的，而另一种可能是无活性的甚至有毒的，或者两者可能有不同程度的或不同种类的活性I，从而造成使用外消旋体药物町能导致错误的药代行为和作用模式的严重后果。具体情况如下所述1手性药物分子两种对映体的药理作用相同，但药效差别很人。人们最熟悉的例子就是氯霉素，种广谱抗生素治疟药。只有D异构体具有杀菌作用，而L异构体则完全没有药效。2两种对映体药效相反。DISTOMER部分抵消EUTOMER的药效。巴比妥酸盐通常用作催眠镇痛药，一般S异构体具有抑制神经活动的作用，而R异构体却有兴奋作用。3DISTOMER或其代谢产物有毒或引起严重的刨作用。一个典型的例子就是六十年代西方发生的，”重的药物敛畸事件，即反应停THALIDOMIDE事件，经过对映体特异性研究发现，THALIDOMIDE的S异构体及其体内的两个代谢产物具有很强的胚胎毒性和致畸作用，而R异构体则是安全有效的11711埔】【19L。4两种对映体具有完伞不同的药理作用。最典型的郑州大学2007届硕1毕业论文例子是PROPRANOLOL，其S异构体是一种治疗心脏病的药物，称为心得安；而R异构体却是一种避孕药【201。凼此，自从1848年PASTEUR发现酒石酸的光学异构现象以来，立体化学STEREOCHEMISTRY和对映体选择性ENANTIOSELECTIVITY在药物开发和评价中的重要性逐步被人们认识，同时人们越来越认识到外消旋药物中对映异构体的错误使用是一种严重的药物污染，其毒副作用可能远比具有医药活性的对映异构体的疗效更大得多。从上述的实例可以看出，含有手性中心的药物分子，其外消旋体与两个分别的对映体在药效、药理作用、代谢物的性质等方面表现出很大的差别目前世界上研制出的新药含手性中心的越来越多。因此，药品的手性问题是当今医药科学研究人员所面临的最重要的问题之一。鉴于有机分子的主体结构与其生物化学活性有特殊的关系，1992年美国药品食品管理局FDA规定，今后凡研制含有不对称中心的药物，必须给出手性拆分的结果，必须说明每个对映体的身份并测定其活性强度、质量、纯度和药效，欧共体也采取了相应的措施。故开发手性合成技术生产光学纯药物已成为国际制药工业的共识。手性药物也因而受到世界各国的越来越多的关注和重视，并促使手性药物的合成在工业化过程中遵循市场经济的指导原则，发展低成本，高药效的手性药物生产工艺2Q。自九十年代以来，手性药物市场一直保持快速增长的态势。19951999年的5年内全球单一异构体药物销售额翻了一番，占世界药品市场份额从I5提高到3。而到了2003年全球单一异构体药物销售额达到1460亿美元，并以8的速度增长僻】。另外，手性化合物还在功能材料领域，如液晶、非线性光学材料、导电高分子等方面礁示山诱人的前景。随着人们对手性分子的认识的不断的深入，人们对单手性物质的需求量也越来越大，对其纯度的要求也越来越高。广阔的应用前景和巨大的市场发展推动了探索新的更有效的获得单于性化合物方法的研究。23获取手性化合物的方法231物理法物理法获得手性化合物主要是指从消旋化合物通过直接结晶法拆分2”。2311晶体机械分离拆分法晶体机械分离拆分法要求生成的晶体较大，在外观上能直接辨别。但足符合4郑州人学2007届硕毕业论文这些要求的例子很少，且操作过程烦琐。效率低下，能够实际应用的对象十分有限。2312手性溶剂结晶法手性溶剂拆分是根据外消旋体的两个对映体与手性溶剂的溶剂化作用力的差异来实现拆分的。但这种方法需要寻找特殊的手性溶剂，且适于拆分的外消旋体混合物的范围相当狭窄，故实际工业生产的意义不大2313接种晶体析解法在一个外消旋体混合物的热饱和溶液中加入纯对映体之一的品种，然后冷却，则同种对映体将附在晶体上析出，滤去晶体后，母液重新加热，并补加外消旋混合物使之饱和。然后加入另一种对映体的晶种，冷却使另一种对映体析出渊。此类工艺简单，成本低，效果好，因此是比较理想的大规模拆分方法。232化学法制备手性化合物化学法制备手性化合物主要有两种途径，一种是外消旋体拆分另一种是前手性化合物的不对称合成。2321化学法拆分化学法拆分F25】主要是通过化学反应的方法，将外消旋体中的两种对映体转化为非对映异构体，然后利用非对映体之间物理性质和化学性质的不同将两者分开。化学法拆分主要有三种方法经典成盐拆分法吲包结拆分【拍】；组合拆分【期2322前手性化合物的不对称合成不对称合成是使用一种对映体试剂或催化剂，与某种底物进行反应，使之只形成一个对映体的手性化合物的合成方法【191。不对称氢化的经典催化剂是R或SBINAP5叹苯基磷基J联苯与铑或钌络合物。233生物法制备手性化合物生物合成手性化合物将成为手性药物牛产取得突破的关键技术。牛物法手性合成是利用酶促反应或微生物转化的高度立体、位点和区域选择性将化学合成的外消旋衍生物、前体或前手性化合物转化成单一光学活性的产物【281生物法的优点为反应条件温和通常在20一30“C、立体及位点选择性强、副反应少、收率高、光学纯度高100EE及环境友好等。手性化合物的生物合成主要经过了两种阶段的发展。早期是利用水解酶类郑州人学2007届硕上毕业论文120L，如酯酶、蛋白酶、酰胺酶、腈水合酶、酰化酶等，对外消旋底物进行不对称水解拆分制备手性化合物1291这种方法的缺点是必需先合成外消旋PL标产物，拆分最高收率不超过50，需将另外一对映体消旋化，经过循环最终转化成目标产物。最近的发展是微生物或酶直接转化，通过利用氧化还原酶、合成酶、裂解酶、水解酶、羟化酶，环氧化酶等，直接从前体化合物不对称合成各种复杂的手性醇、酮、醛、酯、胺衍生物，以及各种含磷、硫，氮及金属的手性化合物。该法不需制备消旋化合物，可将前体100的转化为手性目标产物，因此具有更大的工业价值【30】。234色谱拆分法色谱拆分法分为两类分析级水平和制各级水平。用于分析领域的色谱拆分法包括毛细管气相色谱GC【3“、高效液相色谱HPLC【32】、超临界流体色谱CSFCD3、胶带电动色谱MEKC341等。在制备领域中，高效液相色谱的应用较为广泛，己成为对映体拆分的重要手段之一。235手性膜拆分法膜分离具有低能耗、稳定性强、易于连续操作等优点，是大规模进行手性拆分中比较有潜力的方法之一蚓。手性拆分的膜系统可以分为三类第一类为用于专一性底物催化的膜系统；另外两类系统是以非专一反应为基础的，一类为支撑液膜，另一类为致密固膜。3微生物转化反应在药物合成中的应用31概述近半个世纪以来，通过微牛物学科与有机化学及牛物化学的交叉，初步掌握了生物代谢产物中的化学组成及生命活动中酶和酶催化反应的基本规律，使微生物学科提高到分子水平，同时积极地向其它学科渗透。微生物学家们应用生物技术来帮助有机化学和生物化学工作者，解决一些疑难和复杂的化学合成和代谢产物的形成问题，制备了许多原来难于大规模工业生产的天然药物和人工半合成药物，推动了制药工业的发展。1864年巴斯德发现乙酸杆菌能将乙醇氧化为乙酸，使人们能用纯菌种乙酸6郑州人学2007届硕十毕业论文杆荫BACTCRIAMXYLINUM将乙醇氧化成乙酸后，人类才开始了通过微牛物方法合成化学物质。利用这种微生物作用来进行某种化学反应称之为微生物转化反应MICROBIALTRANSFORMATION或MICROBIALBIOCONVERSION。半个世纪以来，微生物转化在药物研制中一系列突破性成果给医药工业创造了巨大的社会效益和经济价值。随着生物学科进一步发展，特别是固定化细胞，诱变、基因重组和重捧等重要生物技术的发展，不仅使微生物转化的转化率成倍地提高，并且能将几种不同合成基因构建于同一个工程萄中，使一次培养同时进行几步转化反应，给微生物转化在药物合成中的应用带来更美好的前景。微生物转化反应目前己广泛地用于激素、维生素、抗生素和生物碱等各类药物的研制中微生物转化反应几乎对所有化学反应都能应用，甚至能应用于有些化学反应很难进行甚至不能进行的化学反应。32微生物转化反应的特点与有机化学合成和酶法合成相比，微生物转化反应具有以下特点11高度的立休选择性微生物转化反应属于酶的催化反应，保持了酶催化反应所具有的高度立体选择性40H411；它不仅对结构有化学选择性CHEMOSELECTIVITY和非对映异构体选择性DIASTEREOTOPESELECTIVITY，并且有严格的区域选择性REGIOSELECTIVITY和对映异构体选择性ENANTIOPESELECTIVITY。对于手性药物合成来说，具有严格的立体结构选择性非常重要。生理活性很高的激素、抗生素以及心血管系统和神经系统等药物的药效对立体结构的要求很高。往往具有严格的对映体立体构型要求，这足有机化学合成方法难以达到的。21微生物转化反应条件温和、设备简单、环境友好，反应速率快微生物转化反应一般都在常温和PH70左右进行催化合成，无需高压，强热等苛刻条件。因此，设备简单，反应条件温和，生产安伞原料除底物和普通培养基外没有其他化学品，因此一般无公害。微生物转化反应是酶催化反应，在最适条件下，酶能在秒钟内使LO乙106个底物分子转变成产物PQ。3微生物转化收率高，成本低。微生物转化反应避免了复杂的分离纯化酶的过程，降低了成本和酶活性在分离过程中的损失；微生物转化反应是在全细胞内进行，保持原有整体酶系统比较郑州大学2007届顾J二毕业论文符合生物催化所需环境与条件；在氧化还原等催化反应时不需添加辅酶；辅酶非常不稳定，难以分离制取，而且价格昂贵，这是酶法合成中很难克服的困难，而微生物细胞本身具有辅酶再生能力。微生物转化反应可以持续进行，反应量大，收率高，可大规模工业生产。加上设备和原料简单易得等优点，生产成本不仅低于酶法合成，并且也低于化学合成【轫。4微生物转化可以减少反应步骤将几步中间体合成中转化酶的合成基因，通过基因重组构建于同一个工程菌中，在发酵法转化时需几步催化合成的中间体就能一步转化成功D71。当然，与酶转化方法比较，微生物转化也存在一些缺点，如微生物中众多的酶系存在可能会催化一些不希望发生的副反应；由于微生物复杂的培养基组成及代谢产物，可能影响目标产物的分离提纯；此外，微生物与酶催化反应的最佳条件可能会有一些差别，从而影响转化效率等。3_3微生物转化反应的一般试验过程微生物转化反应【”1试验过程如下选择所需要的菌种一培养一选择适宜的转化方式一转化发酵培养或静息细胞转化一转化液的分离提取一产品精制。1选择荫种，这是转化反应的关键；2培养基的选择，按菌种的特征和转化反应的需要配制培养基；3加转化底物，一是选择适当的菌种生长期加底物，二是选择加底物的方法如固体投料或液体投料和方式如连续或间隙投料；4添加诱导剂或抑制剂，添加诱导剂提高酶的活力和生长量，添加抑制剂是抑制酶的副反应或抑制其他反应不良酶的生长；5控制好转化反应培养时间。使酶达到最人反应活力，底物转化反应达剑最大反应完全值；6调控好转化反应过程中各项影响因素，如开始加底物的时间、适宜的转化温度、PH、菌体或菌丝的浓度等；7控制好转化反虑的终点，使产物积累达到最大值；8分离纯化转化产物，此时转化产物己与微生物转化系统分开，可用物理或化学方法将产物分离提纯。8郑州大学2007届硕士毕业论文34微生物转化技术的类型按照转化过程中细胞生长与否。可将微生物转化技术捌分为转化发酵培养和静息细胞转化1转化发酵培养即微生物边生长边转化。在微生物细胞培养前或培养一段时间后，将底物直接加到微生物生长培养基中，微生物自身繁殖生长的同时对底物进行微生物转化。这是微生物转化法最简单和最常用的一种方法该法的优点是转化容易、效率高，缺点是产品的后处理分离纯化困难。2静息细胞转化法。静息细胞也称为休止细胞。此法是将微生物培养至一定阶段后分离菌丝体，将其重新悬浮于不完全培养基中，使其不再继续生长，然后加入底物，在适宜的温度、PH和振荡条件下转化至反应终点此法的优点是产物后处理简单，没有培养基成分的污染。本文在微生物转化尝试的过程中即采用了静息细胞转化法35微生物法还原羰基化合物制备手性药物中间体351微生物法还原羰基化合物的原理利用“环境友好”的微生物进行手性药物的不对称合成是一个极具吸引力的研究方向。微生物催化还原前手性羰基化合物可以得到手性的羟基化合物，可以用于合成各种光学活性的手性药物。反应示意如图11所示I删【2】F411【42431。图11微生物法还原羰基化合物的原理FI91IPRINCIPLEOFREDUCTIONOFCARHONYLCOMPOUNDSWITHMICROORGANISMSR乒R9HRRR29OXIDOREDUCTASEOHRRR2郑州大学2007届硕士毕业论文微生物产生的能够还原羰基化合物的氧化还原酶主要属于醛酮还原酶系ALDOKETOREDUCTASESUPERFAMILY4445醛酮还原酶系中的大部分酶可以代谢大量底物。微生物细胞中的氧化还原酶一般都是由一系列同功酶构成的混合酶，其中一些氧化还原酶可还原底物生成某一种构型的产物，而另一些氧化还原酶可还原底物生成另一种构型的产物。当生成其中一种构型产物的酶活性丧失或活性受到抑制，而生成另一种构型产物的酶活性充分发挥时，还原反应具有很好的立体选择性；若生成两种构型产物的酶活性发挥相当的作用则还原反应的立体选择性不好。微生物法还原都需要辅酶EOENZYMESORCOFACTERS的参与，以进行化学当量的还原或氧化，可逆地催化还原酮或醛羰基。大多数的氧化还原所需的辅酶是NADH辅酶D或NADPH辅酶ID。由于酶催化的氧化还原反应需要价格昂贵的辅酶，往往需要高代价使其再生循环。这样利用全细胞进行反应显得更加方便实用。微生物细胞含有可以接受广泛非天然底物的多种脱氢酶、所有必需的辅酶和再生途径，这样辅酶循环可由细胞自动完成。进行不对称还原反应时也可以加入少量廉价的碳源如蔗糖和葡萄糖作为辅助底物实现辅酶的再生。352微生物法还原制备手性药物中间体的实饲许多肾上腺类药都具有争氨基醇的结构单元，是一类用途广泛的口或P肾上腺能受体激动剂或拮抗剂，临床用于治疗许多疾病，如高血压、心绞痛、焦虑、支气管炎以及其它的心血管疾病和肺病。已经发展了多种生物还原途径合成这类化合物146，其中最主要的是利用生物催化还原卤代酮、羰基酯酸得到相应的手性卤代醇和羟基酯酸，再通过多步化学转化制得，也可以通过生物还原前手性的氨基酮直接制备。BMS2106203是一种受体激动荆，其合成中间体R醇2可巾SPINGOMONASPAUCIMOBILISSCL6113菌体催化还原制得M图12。3吡啶乙醇胺6也是一种阢肾上腺能受体激动剂，一条实用的合成路线是利用CANDIDASORBOPHILA催化不对称还原4得到关键的手性中问体3吡啶乙醇胺5例I3，产率达到75，手性选择性EC值达到995以上【4引。R地诺帕11DENOPARMINE，9是首例具有I_J服活性和长效性治疗心脏病的药物，人们曾用一株具有高还原活力的白地霉菌株GEOTRIEHUMSPG38还原P羰基羧酸酯7得到相应光学纯的羟基酸LO郊州大学2007届硕士毕业论文8中间产物，最终成功地合成了V【491图1Q。索他洛尔SO协101因为含有酸性的甲磺酰胺部分，是一种独特的抗心率失常新药。其D型异构体是一种纯的IU类抗心率失常药物。利用微生物菌株催化还原。A氯代酮00得到的光学活性的相应氯代醇产物11成功制备了D索他洛尔12侧图154课题研究的内容及社会意义哌嗪及其衍生物是医药、农药，染辩等的重要中F司体，哌嗪及其系列化合物是化工产业和医药产业之间承上启下的重要产品，随着哌嗪环上引入不同的取代基可以产生不同的生物活性近年来吡酮酸类抗生素发展非常迅速，现已经发展到第四代，特别是在第二代吡酮酸类抗生素中引入了碱性哌嗪基团，使其具有良好的组织渗透性，在大多数组织中的浓度大于血药浓度，所以在以后吡酮酸类药物中都继承了含有碱性氨基这一发现。目前在这类药物中使用的哌嗪及其衍生物主要有哌嗪、2甲基哌嗪、N甲基哌嗪、1乙酰基哌嗪和3,5二甲基哌嗪等。在这类化合物中，只有2一甲基哌嗪和3,5二甲基哌嗪具有手性，但目前仍以外消旋体入药对于外消旋体药物来讲，由于两种对映体各有一半，等于有50的杂质，增加了药物的毒副作用。因此用单一对映体EP手性药物供药成为现代医药行业的一项迫切任务。现行手性药物的制造途径主要有3种从天然产物中提取手性药物；微生物转化与拆分法分离手性药物；不对称催化合成手性药物。随着近年来在生物科学方面突飞猛进的发展，已经取得了很多关于微生物生物转化方而的成果。这项技术也同趋成熟。作为目前研究最多的单一手性化合物的合成方法，微生物转化一定会成为今后制药工业的一大热点。存本课题的研究过程中，我们选择了使用苯乙酮类化合物苯乙酮、对甲氧基苯乙酮、对氟苯乙酮和2，4二氟苯乙酮作为哌嗪的前手性基团。选择这类化合物主要原因如下N因有许多药物中都含有手性醇羟基，大多都是通过对羰基进行还原得到的，所以微生物转化在羰基还原得到手性醇羟基这个方向研究的比较多，转化方法、条件也相对比较成熟。2已知的毗酮酸类抗生素中哌嗪基团上还没有含有苯乙酮基结构，更不用郑州大学2007届颂J二毕业论文说含有手性醇羟基了，也许在这类抗生素上面引进这些基团可能得到具有更好生物活性而且毒副作用更小的药物。另外因为带有氟取代基能够明显改善吡酮酸类药物的活性，我们还特别选取了含有氟取代基的化合物。这一系列化合物本身具有潜在的镇痛、镇静作用，有可能从中得到可以取代阿片类药物的新药，以改善目前阿片类药物因有成瘾、呼吸抑制和减少胃蠕动等副作用而直得不到广泛应用的情况，减轻困扰数以千万计病人的严重急慢性疼痛包括肿瘤疼痛、术后疼痛等。3对于这一系列化合物目前研究得比较少，少有的几篇文献也多为专利。特别是在这一系列化合物中，含有甲氧基和2,4二氟基团的化合物目前还没有报道4苯乙酮含有苯环，更容易得到各种取代基的衍生物，原料价廉易得。51该类化合物结构简单，合成相对比较容易，用来进行微生物转化，有利于控制成本。本课题综合了哌嗪和手性这两个在当今药物合成领域的所涉及到的重要内容，研究的主要目的为1合成出一系列含有羰基的哌嗪衍生物。尽量合成一些含有能够增加生物活性基团的未见报道的化合物。2对这些化合物进行生物活性测试，探明其是否具有生物活性，找出生物活性比较高的化合物。针对我们期望合成的这一系列化合物的生物活性测试，目前还没有文献报道。3通过微生物的筛选，初步探索羰基还原为醇羟基的条件，尽量找山具有还原羰基活性的微生物。4尽量探索出更多的能够得到前于性化合物的合成路线，为奉课题组的后续工作做好铺垫。12郑州大学2007届硕I毕业论文图12微生物法制备BMS210620的手性中问体FIG12PREPARATIONOFCHIRALINTERMEDIATEOFBMS0210620WITHMICROORGANISMS图13微生物法制各3吡啶乙醇胺的手性中间体FIG13PREPARATIONOFCHIRALINTERMEDIATEOF3INDOLETHANOLAMINEWITH铲坼4图14微生物法制备R地诺帕明的手性中问体FIGI4PREPARATIONOFCHIRALINTERMEDIATEOFR一DENOPARMINEWITHMICROORGANISMSGMLFIDAKNSP小PMOENOM图15微生物法制备D索他洛尔的手性中HJ体FIG15PREPARATIONOFCHIRALINTERMEDIATEOLDSOTALOLWITHMICROORGANISMS洲。硅13DSOLAL01人HCI唧妒。矿一铲一MH一一一P吖M世V。一铲一旷妁一萨掣旷郑州大学2007届硕士毕业论文5试验设计哌嗪作为医药中间体，其价值最大的结构就是单取代哌嗪，如果哌嗪为二取代化合物时，其可利用价值就大大减小了，但又因为哌嗪结构的对称性1,4JT立的N具有等活性，因此，如何控制反应条件使反应的第一步不发生或少发生L，4二取代。成为我们所要考虑的关键之一单取哌嗪衍生物的合成一般有以下几种控制方法1不必保护胺基直接以水合哌嗪为原料，以醋酸为溶剂反应151】2通过控制反应时的PH值为4555进行单取代；应LS21；31先保护一个胺基然后再酰化或烷基化和脱保护的方法。如甲酰基保护法、乙氧基保护法、乙氧羰基保护法以及成盐保护法等53L；4在相转移催化剂存在下进行单取代反应【斟J【捌；5均相反应，通过控制反应物的初始比例、反应过程中的滴加速度及反应温度来控制反应的方向性“。综合考虑了以上方法，我们设计了三种方案11直接合成得到卜苯乙酮基哌嗪及其衍生物。然后使用1苯乙酮基哌嗪作为唯一的碳源和氮源筛选出活性微生物，通过静息细胞转化法转化得到微生物转化得到S或者R的12羟基2苯乙基哌嗪。其路线图N孓弋IHAC,H,O弋Y晰篁2N扣HN卜。厂、尸弋7弋P一。2首先合成1乙氧羰基哌嗪，和溴代苯乙酮反应得到L一乙氧羰基4苯乙酮基哌嗪。然后使用1乙氧羰基4苯乙酮基哌嗪作为唯一的碳源和氮源筛选出活性微生物，通过静息细胞转化法转化得到微生物转化得到S或者R的12一羟摹2一苯乙基哌嗪或者得到1苯乙酮基哌嗪。其路线图鞣厂L而一几Z庐O郊州大学2007届硕士毕业论文O恭A面SH2茄0P吣UAMFONNATION31得到L乙氧羰基4苯乙酮基哌嗪后，使用碱性水解的方法得到L一苯乙酮基哌嗪，然后使用1苯乙酮基哌嗪作为唯一的碳源和氮源筛选出活性微生物，通过静息细胞转化法转化得到微生物转化得到S或者R的L一2羟基2苯乙基哌嗪。其路线图竺慧GZPLDI霎LONU郑州大学2007届硕士毕业论文第二章试验部分L试验方案一11双取代苄基哌嗪的合成111主要仪器和试剂北京科仪电光仪器厂XT4A显微熔点测定仪温度计未校正，DPX400型超导核磁共振仪，郑州凯鹏实验仪器有限公司DLSB525型低温冷却循环泵，上海司乐仪器有限公司8L_2型恒温电磁搅拌器无水哌嚷为进口分装，苄基氯为工业品重蒸，临硝基苄基氯，对硝基苄基氯为本实验室合成，青岛海洋化工厂生产的GF254硅胶，无水乙醇、毗啶市售分析纯。112化合物的合成与表征合成路绀571”I591厂_、弋C心R2RKOZRN咿OC友R一“昵一。1I211,4二苄基哌嗪RL，R2H取无水哌嗪439005M01于100ML三口烧瓶中，加入无水乙醇10ML，KOH289O05TOOJ，冰水浴控制温度小于10“C，滴加苄基氯58ML005T001，点板跟踪反应，O5H反应即完成。过滤，用乙醇直接重结晶，得白色丝絮状结晶639，产率48，熔点89“C。1,4二苄基哌嗪。HNMRDMSO8236CS，8H，NCH2；344S，4H，CH2；721731M，IOH，ARHA11221,4二临硝基苄基哌嗪R产H，R2N02取无水哌嗪2159O025MOI于100ML三口烧瓶中，加入无水乙醇5ML，毗啶4ML005M01，冰水浴控制温度小于10“2，取临硝基苄基氯8589O05T001溶R5ML无水乙醇中。缓慢滴加进三口烧瓶中，搅拌反应O5H，过滤。用无水乙醇重结晶，得白色针状结晶8IG，产率91，熔点142143“C。1,4二临硝基苄基哌嗪IHNMRCDCIL36241S，8H，NCH2；377S，16郑槲大学200“7届硕毕业论文4H，CH2；738T,2H,ARH；752T,2H，ARH；757D，2H，ARH；779D，2H，AROH。1123L二对硝基苄基哌嗪RJN02，R2H取无水哌嗪21590025MOI于IOOML三口烧瓶中，加入无水乙醇5ML，吡啶4ML005M01，冰水浴控制温度小于IOC，取对硝基苄基氯S5SGO05T001溶于5ML无水乙醇中，缓慢滴加进三口烧瓶中，搅拌反应05H，过滤，用无水乙醇重结晶，得浅黄色针状结晶GAG，产率94，熔点214215“C1,4二对硝基苄基哌嗪THNMRCDCIL3嫡250S,8H,NCH2；361S,4H，C112；751D，4H，ARH；817D,4H，AR哪。2试验方案二21单取代酰基哌嗪的合成211主要仪器和试剂北京科仪电光仪器厂XT4A显微熔点测定仪温度计未校正，郑州凯鹏实验仪器有限公司DLSB525型低温冷却循环泵，上海司乐仪器有限公司812型恒温电磁搅拌器无水哌嗪为进口分装，青岛海洋化工厂生产的GF254硅胶，苯甲酰氯和乙酰氯自制，其它试剂均为市售分析纯。212化合物的合成与袁征合成路线【52160厂、9H20，MEOH，D毗取产物L乙氧羰基Q对甲氧基乙酮基哌嗪氢溴酸盐20OGO052M01加入100ML锥形瓶中，加AKOH56901M01，95的乙醇20ML，加热回流2H，测毛细管电泳附图5过滤，减压蒸干溶剂，加入水20ML，用盐酸调节PH到3，用氯仿萃取，然后用NAOH水溶液调节水相PH值到10。再用氯仿萃取，蒸干氯仿，加入乙醇，用盐酸调节PH值到5，从乙醇中析出浅绿色固体079O0023M01。产率44。分解温度210“2。1对甲氧基乙酮基哌嗪盐酸盐IHNMRD20363T,8H，NCH2；380S,3H，C1130；490S，2H，CH2；700他2H,ATH；7S6TD，2H,ARHCT3H20C12N202元素分析值计算值AC50595088；H669656；N918912。4其他化合物的合成41主要仪器和试剂北京科仪电光仪器厂XT4A显微熔点测定仪温度计未校正，DPX400型超导核磁共振仪，WATERSQUANTA4000型毛细管电泳仪选用电压20KV，上样缓冲液为0IM的硼酸盐缓冲液，PH值为80，进样时问为2S，郑州凯鹏实验仪器有限公司DLSB525型低温冷却循环泵，上海司乐仪器有限公司812型恒温电磁搅拌器。2甲基哌嗪、扁桃酸为进口分装，氯甲酸乙酯购自江苏嘉隆化工有限公司，环氧氯丙烷为T业品用时重蒸，苯甲酰氯自制，其它试剂均为市售分析纯。42化合物的合成与表征4212甲基哌嗪衍生物的合成11I乙氧羰基3甲基哌嗪合成路线“I厂弋9H20，MEOH，卜厂L一一O卢ID洲上。石巷I。一I。一L聱L32卜外飘冈垂呱嗓城任“补及胜FI932RINGOPENINGREACTIONOF1EPOXYPROPYLPIPERAZINEINALKYSURROUNDINGF一L。一OY。O卢L。一OY“I一DYBDY蹦耐郑州大学2007届硕士毕业论文2生物活性结果与讨论四种化合物对人肺腺癌细胞A549细胞作用48H后的抑制率结果如表3I。表31四种化台物的抑制率TABLE31INHIBITIONRATIOOFFOURCOMPOUNDS丧憋O。000234375468759375J875375L乙氧羰基4荤乙酮基哌嗪氢溴酸盐0282443776216AL乙氧羰基一4对甲氧基乙酮基哌嗪017923474491L6255氢滇酸盐B卜乙氧羰基4对氟乙酮基卜哌嗪氢溴OOO2384481852525926酸盐CL乙氧羰基42，4二氟乙酮基哌嗪000385486562氢溴酸盐D一图33抑制率的曲线图FI933CURVECHARTOFINHIBITIONRATIO阳柚舯GM塑。曩埒0101E却苫砷柚化合物浓度蝉,NOLL从图33可以看出四种化合物对A549细胞均有抑制作用，均在较小的浓度时便可产生强的抑制效应，且其抑制作用均随着浓度的增加而增加。它们对细胞的抑制率大小顺序依次为DCBA，其中D活性最强当浓度是234375TTMOLL时抑制率已达385，且随着浓度的增加对细胞的抑制作用迅速增郑州大学200届硕毕业论文加，当9375TTMOFL时大部分细胞已被抑制；C作用相对缓和，浓度在1875TTMOFL以后其抑制作用几乎处于平台期从曲线图中还可以看出，B浓度小于375TTMOL1,时，其抑制性稍高于A，但375ILMOLL时，其抑制率几乎相等，说明两者在高浓度时作用几乎相同所以在这一系列化合物中，其IDSO均在375|UILO哪以内，特别是台有氟取代基可以明显增加生物活性，可能是因为氟取代基的加入增加了分子的稳定性，使其和受体结合的能力增强，另外氟原子能够抑制DNA螺旋酶的活性抗肿瘤吡酮酸类药物也是目前引入注目的研究热点，我们合成的这一些列化合物也许会改良吡酮酸类药物的抗肿瘤活性。本部分工作及结果未见文献报道。3微生物转化结果与讨论1乙氧羰基_4苯乙酮基哌嗪氢溴酸盐转化48H后测毛细管电泳，结果如图32，图中共有四个峰，第一个峰为加入的底物1乙氧羰基4苯乙酮摹哌嗪氢溴酸盐，第二个峰为产物2未知，第三个峰为内标扁桃酸，最后一个峰为苯甲酸。图33为提纯后的苯甲酸毛细管电泳图。我们所筛选的YWC1菌种在微生物转化过程，能够将1乙氧羰基4苯乙酮基哌嗪降解，得到苯甲酸，其机理町能为微生物中含有水解酶和单加氧酶，首先氧化加入一个氧原子，然后水解得到苯甲酸，而另一端可能水解得到了乙酸和C02，所以哌嗪环没有检测出来。本期望得到S或者R的L2一羟基一2苯乙基哌嗪或者得到1苯乙酮基哌嗪，但从目前的结果来看，这种微牛物还不合适，我们还需要重新筛菌，希望能找到更合适的微生物。4结论本文得到的结论I共合成各种化合物20个，2个化合物未见文献报道，其中17个化合物具有前手性基团，可以进行微生物转化。2合成方法操作简单，产率较高，有一定的工业应用价值。3I乙氧羰基4苯乙酮基哌嗪氢溴酸盐这一系列化合物的生物活性较高，郑州大学2007届硕士毕业论文特别是含有两个氟基团的。对于人肺腺癌细胞A549细胞，其IDSO均在375岬OL，L以内，具有潜在的药用价值4通过微生物转化的尝试，我们得到了苯甲酸，但这不是我们期望的产物，所以还需要进一步的筛选菌种来转化。我们通过碱性水解的化学方法也得到了产物之一。但是因产率太低，目前还不适用，以后可以进行酸性水解试验。5合成的1乙酰基3甲基哌嚷、1苯甲酰基3甲基哌嗪、扁桃酸乙酯以及1环氧丙基哌嗪等均可以进行微生物转化，这三条路线也非常有发展前途。图3448H转化液的毛细管电泳图FI934CAPILLARYELECTRO