长期环境电磁辐射对SRA0104和Balbc+3T3细胞生物学特性的影响及机制探讨

硕士学位论文长期环境电磁辐射对SRA01/04和BALB/C3T3细胞生物学特性的影响及机制探讨安广洲培养类别全日制学位类型学术学位一级学科专业类公共卫生与预防医学二级学科专业军事预防医学研究方向生物电磁学指导教师丁桂荣教授培养单位军事预防医学院放射医学教研室二O一三年五月第四军医大学THEFOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY分类号R146UDC密级公开独独创创性性声声明明秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名日期保保护护知知识识产产权权声声明明本人完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定，即研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位为第四军医大学。本人保证毕业离校后，发表论文等使用本论文工作成果时第一署名单位仍然为第四军医大学。学校可以公布论文的全部或部分内容（含电子版，保密内容除外），可以采用影印，缩印或其他复制手段保存论文；学校有权允许论文被查阅和借阅，并在校园网上提供论文内容的浏览和下载服务。同意学校将论文加入中国优秀博硕士学位论文全文数据库和编入中国知识资源总库等，并可浏览和下载，同时享受中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程规定的相关权益。论文作者签名导师签名日期第四军医大学硕士学位论文目录缩略语表1中文摘要3英文摘要6前言10文献回顾11正文25第一部分50HZ工频电磁场对SRA01/04和BALB/C3T3细胞生物学特性的影响及机制探讨251前言252材料253方法284结果325讨论47第二部分1950MHZ射频电磁场对SRA01/04和BALB/C3T3细胞生物学特性的影响491前言492材料493方法504结果525讨论56小结58参考文献59个人简历和研究成果70致谢71第四军医大学硕士学位论文1缩略语表缩略词英文全称中文全称BALB/C3T3BALB/CMICEEMBYOFIBROBLASTSBALB/C小鼠胚成纤维细胞C6RATGLIOMACELLS大鼠胶质瘤细胞CYCLIND1CYCLIND1周期蛋白D1DMSODIMETHYLSULFOXIDE二甲基亚砜DMEMDULBECCOSMODIFIEDEAGLEMEDIUMDMEM培养基ELFEMFEXTREMELYLOWFREQUENCYELECTROMAGNETICFIELDS极低频电磁场PFEMFPOWERFREQUENCYELECTROMAGNETICFIELDS工频电磁场GJICGAPJUNCTIONINTERCELLULARCOMMUNICATION细胞间隙通讯HHOUR小时HZHERTS赫兹IARCINTERNATIONALAGENCYFORRESEARCHONCANCER国际癌症研究机构KYSE150HUMANESOPHAGEALSQUAMOUSCARCINOMACELLS人食管鳞癌细胞株MINMINUTE分钟MTT34,5DIMETHYLTHIAZOL2YL2,5DIPHENYLTETRAZOLIUMBROMIDE3（4,5二甲基噻唑2）2,5二苯基四甲基偶氮唑盐ODOPTICALDENSITY光密度值PBSPHOSPHATEBUFFERSALINE磷酸盐缓冲液PCNAPROLIFERATINGCELLNUCLEARANTIGEN增殖细胞核抗原PIPROPIDIUMIODIDE碘化丙啶第四军医大学硕士学位论文2缩略词英文全称中文全称PVDFPOLYVINYLIDENEDIFLUORIDE聚二乙烯RFRADIOFREQUENCYELECTROMAGNETICFIELDS射频电磁场RTERATTRACHEALEPITHELIALCELLS大鼠支气管上皮细胞SARSPECIFICABSORPTIONRATE比吸收率SRA01/04HUMANEYELENSEPITHELIALCELLS人眼晶状体上皮细胞WWEEK周第四军医大学硕士学位论文3长期环境电磁辐射对SRA01/04和BALB/C3T3细胞生物学特性的影响及机制探讨硕士研究生安广洲导师丁桂荣教授第四军医大学军事预防医学院放射医学教研室，西安710032资助基金项目国家自然科学基金面上项目（31170798）国家973计划（2011CB503705）中文摘要各种家用电器、输电线路等产生的工频电磁场和移动通讯设备产生的射频电磁场是日常生活中最常见的两类电磁辐射。由于二者的辐射强度越来越大，人们暴露在其中的时间越来越长，有关这两类电磁场对人体健康的影响已经受到广泛关注。流行病学研究结果发现，长期暴露在包括工频电磁场在内的极低频电磁场中的人们易患白血病，脑瘤及乳腺癌，而长期手机辐射则与听神经瘤和脑胶质瘤发生密切相关，因此，国际癌症研究机构IARC分别于2002年和2011年将极低频电磁场和射频电磁场列为人类可疑致癌物。目前，关于这两类电磁辐射致癌效应的研究尚缺乏足够的实验依据。体外细胞转化实验是模拟整体致癌启动和促进过程的一种体外实验方法。研究表明，体外培养细胞其细胞形态、周期、增殖和凋亡等生物学特性的改变与细胞的恶性转化密切相关，但迄今为止，有关长期环境电磁辐射对哺乳类细胞生物学特性的影响研究尚未见报道。为了探讨工频电磁场和射频电磁场与肿瘤发生的关系，本实验以对电磁辐射较为敏感的两种细胞株人眼晶状体上皮细胞（SRA01/04）和小鼠胚成纤维细胞（BALB/C3T3）为研究对象，观察了50HZ工频电磁场和1950MHZ射频电磁场长期暴露对SRA01/04和BALB/C3T3细胞形态、周期、第四军医大学硕士学位论文4增殖、凋亡、迁移力以及恶性转化能力的影响进行了研究，明确了本实验条件下的电磁辐射对SRA01/04和BALB/C3T3细胞生物学特性的影响，并探讨了其相关机制。方法将处于指数生长期的SRA01/04和BALB/C3T3细胞假暴露或暴露于磁场强度为23MT，频率为50HZ的工频电磁场中，每天连续暴露2H，每周暴露5天，连续暴露11周将处于指数生长期的SRA01/04和BALB/C3T3细胞假暴露或暴露于频率为1950MHZ，比吸收率（SPECIFICABSORPTIONRATE，SAR）为279W/KG的射频电磁场中，每天暴露1H，每周暴露5天（周一至周五），连续暴露4周。暴露结束后立即收集细胞，相关检测方法和指标如下1利用MTT法检测细胞存活力2利用流式细胞术检测细胞周期与凋亡3利用免疫蛋白印迹法（WESTERNBLOT）检测蛋白表达水平4利用划痕实验检测细胞迁移能力5利用软琼脂克隆和平板克隆实验检测细胞的恶性转化能力结果1工频电磁场暴露11周，与假暴露组相比，SRA01/04细胞形态变圆，部分细胞可见异染色体边集，BALB/C3T3细胞形态无明显改变。射频电磁场暴露4周，SRA01/04细胞和BALB/C3T3细胞形态无明显变化。2MTT结果显示与假暴露组相比，SRA01/04细胞经工频电磁场暴露4周，细胞存活力明显降低P005，暴露11周后细胞存活力明显升高P005。3流式对细胞周期的检测结果显示与假暴露组相比，SRA01/04细胞经工频电磁场暴露4周，处于S期的细胞比例明显减少P005，暴露11周后处于S期的细胞比例增大，处于G1期的细胞比例减小P005。4蛋白免疫印迹（WESTERNBLOT）结果显示与假暴露组相比，经工频电磁场暴露11周，SRA01/04细胞增殖细胞核抗原（PROLIFERATINGCELLNUCLEARANTIGEN，PCNA）和CYCLIND1蛋白水平明显增加P005。同样，经射频电磁场暴露4周，与假暴露组相比，两种细胞的凋亡水平也未发生明显改变P005。6划痕实验结果显示与假暴露组相比，SRA01/04细胞和BALB/C3T3细胞经工频电磁场暴露11周，细胞迁移能力无明显变化P005。7软琼脂克隆形成实验结果显示SRA01/04细胞和BALB/C3T3细胞经工频电磁场暴露11周，假暴露组和暴露组均未见克隆形成。8平板克隆形成实验结果显示工频电磁场暴露11周，SRA01/04细胞和BALB/C3T3细胞未在平板上形成型转化灶（即转化细胞克隆）。结论111周工频电磁场暴露对SRA01/04和BALB/C3T3细胞的生物学特性可产生不同程度的影响，且细胞种类不同，工频电磁场引起的生物学效应也有差异。2PCNA和CYCLIND1参与了工频电磁场诱导的细胞增殖和周期分布的改变。311周工频电磁场暴露不能诱导SRA01/04和BALB/C3T3细胞的恶性转化。44周射频电磁场暴露对SRA01/04和BALB/C3T3细胞的增殖、细胞周期分布和凋亡没有明显影响。关键词工频电磁场；射频电磁场；SRA01/04细胞；BALB/C3T3细胞；生物学特性第四军医大学硕士学位论文6BIOLOGICALEFFECTSOFLONGTERMENVIRONMENTALELECTROMAGNETICEXPOSUREINSRA01/04ANDBALB/C3T3CELLSCANDIDATEFORMASTERANGUANGZHOUSUPERVISORDINGGUIRONGDEPARTMENTOFRADIATIONMEDICINE,FACULTYOFPREVENTIVEMEDICINE,FOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY,XIAN710032,CHINASPONSOREDGRANTSNATIONALNATURALSCIENCEFOUNDATIONOFCHINA31170798ANDNATIONALBASICRESEARCHPROGRAMOFCHINA2011CB503705ABSTRACTNOWADAYS,HUMANLIVINGENVIRONMENTWASSURROUNDEDBYPOWERFREQUENCYELECTROMAGNETICFIELDPFEMFANDRADIOFREQUENCYELECTROMAGNETICFIELDSRFMAINLYGENERATEDBYHOUSEHOLDAPPLIANCEANDWIRELESSCOMMUNICATIONEQUIPMENTSRESPECTIVELYASINTENSITYOFPFEMFANDRFBECOMESMOREANDMOREHIGH,ANDEXPOSURETIMEOFHUMANBEINGSINCREASES,THEPOTENTIALHARMFULEFFECTSOFPFEMFANDRFONHEALTHHAVEBEENPAIDMUCHATTENTIONEPIDEMIOLOGICALSTUDIESSHOWEDTHATLONGTERMEXPOSURETOPFEMFCOULDENHANCETHEINCIDENCEOFLEUKEMIA、BRAINTUMORSANDBREASTCANCER,INADDITION,LONGTERMEXPOSURETORFWOULDINCREASERISKSOFACOUSTICNEUROMAANDBRAINGLIOMATHEREFORE,INTERNATIONALAGENCYFORRESEARCHONCANCER（IARC）HASCLASSIFIEDTHEMAS“POTENTIALHUMANCARCINOGENS2BIN2002AND2011RESPECTIVELYATPRESENT,THEREISNOTADEQUATEEXPERIMENTALEVIDENCETOSUPPORTTHISVIEWPOINTITISWELLKNOWNTHATCHANGESOFCELLMORPHOLOGY,CELLCYCLE,PROLIFERATIONANDAPOPTOSISHAVECLOSERELATIONSHIPSWITHCELLMALIGNANTTRANSFORMATIONTOEXPLORETHEASSOCIATIONOFLONGTERMEXPOSUREOFPFEMFORRFANDTUMORIGENESIS,SRA01/04ANDBALB/C3T3CELLSWERE第四军医大学硕士学位论文7USEDINTHISSTUDY,ANDCELLMORPHOLOGY,CELLCYCLE,PROLIFERATION,APOPTOSISORCELLTRANSFORMATIONWEREOBSERVEDAFTER11WEEKSPFEMFEXPOSUREOR4WEEKSRFEXPOSUREMETHODSSRA01/04ANDBALB/C3T3CELLSINEXPONENTIALLYGROWINGPHASEWERESHAMEXPOSEDORCONTINUOUSLYEXPOSEDTO50HZPFEMFAT23MTFOR2HONEDAY,5DAYSEVERYWEEKSRA01/04CELLSANDBALB/C3T3CELLSINEXPONENTIALLYGROWINGPHASEWERESHAMEXPOSEDOREXPOSEDTO1950MHZRFATASPECIFICABSORPTIONRATESAROF279W/KGFOR1HADAY,5DAYSEVERYWEEKAFTER11WEEKSEXPOSURETOPFEMFOR4WEEKSEXPOSURETORF,CELLSWERECOLLECTEDINSTANTLY1CELLVIABILITYWASDETECTEDBYMTTASSAY2CELLCYCLE、APOPTOSISWASDETECTEDBYFLOWCYTOMETRY3PROTEINEXPRESSIONWASDETECTEDBYWESTERNBLOT4CELLMIGRATIONRATEWASDETECTEDBYSCRATCHADHESIONTEST5CELLTRANSFORMATIONWASDETECTEDBYSOFTAGARCOLONYASSAYANDPLATECLONEFORMINGTESTRESULTS1COMPAREDWITHSHAMGROUP,THESHAPEOFSRA01/04CELLS,BUTNOTBALB/C3T3CELLSBECAMEROUND,ANDHETEROCHROMATINGATHEREDATTHEEDGEOFSOMECELLSAFTER10,11WEEKSEXPOSURETOPFEMFINADDITION,BOTHSRA01/04ANDBALB/C3T3CELLSDIDNOTSHOWANYCHANGEINCELLMORPHOLOGYAFTER4WEEKSEXPOSURETORF2MTTASSAYRESULTSSHOWEDTHATCOMPAREDWITHSHAMGROUP,THEVIABILITYOFSRA01/04CELLSSIGNIFICANTLYDECREASEDAFTER4WEEKSEXPOSURETOPFEMFP005HOWEVER,THEVIABILITYOFSRA01/04CELLSSIGNIFICANTLYINCREASEDAFTER11WEEKSEXPOSURETOPFEMFP0053CELLCYCLEDISTRIBUTIONASSAYRESULTSSHOWED,COMPAREDWITHSHAMGROUP,SRA01/04CELLSINSANDG1PHASESIGNIFICANTLYDECREASEDANDINCREASEDRESPECTIVELYAFTER4WEEKS第四军医大学硕士学位论文8EXPOSURETOPFEMFP005SRA01/04CELLSINSANDG1PHASESIGNIFICANTLYINCREASEDANDDECREASEDRESPECTIVELYAFTER11WEEKSEXPOSURETOPFEMFP0054WESTERNBLOTRESULTSSHOWEDTHEPROTEINLEVELSOFPCNAANDCYCLIND1SIGNIFICANTLYINCREASEDINSRA01/04CELLSAFTER11WEEKSEXPOSURETOPFEMFP0056INSCRATCHADHESIONTEST,11WEEKSEXPOSURETOPFEMFDIDNOTCHANGECELLMIGRATIONRATEOFSRA01/04CELLSANDBALB/C3T3CELLSP0057INSOFTAGARCOLONYASSAY,NOCOLONYWASFOUNDINSRA01/04ANDBALB/C3T3CELLSAFTER11WEEKSEXPOSURETOPFEMF8INPLATECLONEFORMINGTEST,NOMALIGNANTTRANSFORMATIONFOCUSWASFOUNDINSRA01/04ANDBALB/C3T3AFTER11WEEKSEXPOSURETOPFEMFCELLSCONCLUSIONS111WEEKSOFPFEMFEXPOSURECOULDHAVESOMEBIOLOGICALEFFECTSINSRA01/04ANDBALB/C3T3CELLS,ANDDIFFERENTCELLLINESHAVEDIFFERENTSENSITIVITYTOPFEMF2PCNAANDCYCLIND1WEREINVOLVEDINPFEMFINDUCEDCELLPROLIFERATIONANDCELLCYCLEDISTRIBUTIONCHANGE311WEEKSOFPFEMFEXPOSURECOULDNOTINDUCECELLTRANSFORMATIONINSRA01/04ANDBALB/C3T3CELLS44WEEKSOFRFEXPOSURECOULDNOTHAVEOBVIOUSEFFECTSONCELLPROLIFERATION,CELLCYCLEDISTRIBUTIONANDAPOPTOSISINSRA01/04ANDBALB/C3T3CELLS第四军医大学硕士学位论文9KEYWORDSPOWERFREQUENCYELECTROMAGNETICFIELDRADIOFREQUENCYELECTROMAGNETICFIELDSRA01/04CELLSBALB/C3T3CELLSBIOLOGICALEFFECTS第四军医大学硕士学位论文10前言工频电磁场和射频电磁场是人类生活中最常见的两类电磁辐射。前者主要由家用电器、电子设备和输电线路产生，后者主要由移动通讯设备产生。随着科技的发展和人们对上述产品需求的增多，它们产生的电磁辐射强度不断增加，辐射范围日益扩大，人类暴露在其中的时间也越来越长。流行病学研究提示，长期工频或手机射频电磁场暴露和某些肿瘤的发生密切相关，如长期工频电磁场暴露与儿童白血病，长期手机射频电磁场暴露与脑部肿瘤。但目前关于这两类电磁辐射致癌效应的研究尚缺乏强有力的实验依据。因此，关于工频和手机射频电磁场是否具有致癌效应至今尚无法给出确定性结论。体外细胞转化实验是研究各种理化因素致癌效应及机制的常用方法，可模拟体内细胞受致癌物作用后向肿瘤细胞演变的过程。研究表明，体外细胞转化与细胞生物学特性的改变密切相关。迄今为止，关于长期环境电磁辐射，尤其是4周以上暴露对哺乳类细胞生物学特性的研究尚未见报道。本课题以对电磁辐射敏感的SRA01/04和BALB/C3T3细胞为研究对象，探讨了50HZ和1950MHZ环境电磁辐射长期暴露对细胞生物学特性的影响及相关机制，为明确环境电磁辐射与肿瘤发生的关系提供了理论和实验依据。第四军医大学硕士学位论文11文献回顾电磁辐射（ELECTROMAGNETICRADIATION）又称电磁波，是相互垂直的电场和磁场，交替产生并交变震荡，以光速向前传播，具有波粒二相性。电磁辐射可按其频率分成若干频率段，形成电磁波谱，见图1。这些电磁波具有相同的波速，但波长和频率各不相同，波长越短，频率越高，能量也越大，对物质的穿透力越强，生物学效应也就越明显。生活中的电磁辐射主要是工频电磁场和射频电磁场，这两种电磁场通常不会引起物质分子的电离，但能引起分子转动、震动或电子能级状态的改变，称为非电离辐射。图1电磁波谱人体是非常复杂精妙的电磁兼容系统，也是对内外电磁干扰有感应的容积导体，是电磁辐射的作用对象，电磁辐射作用人体后可产生累积效应，对人体有长远影响。在电磁辐射对机体影响的机制研究中，遵循着从“物理机制”到“生化反应”再到“后续效应”的规律，即当观察到电磁辐射有某种生物学效应时，首先要清楚电磁辐射作用的物理机制，如电磁辐射是如何改变生物大分子的微观结构和运动状态的，再比如电磁辐射是如何影响某些生物电活动（如脑电波、心电活动等）的。然后进一步探索靶分子改变后会有哪些生化反应受到影响，最后确定对人体健康的具体影第四军医大学硕士学位论文12响。因此，阐明工频和射频电磁场产生生物学效应的物理机制是非常重要的。工频电磁场属于极低频电磁场（EXTREMELYLOWFREQUENCYELECTROMAGNETICFIELDS，ELFEMF），主要来源于电子产品和家用电器。ELFEMF作用于人体后，可使介质极化，介电常数因此变为复数。一些生物大分子和水分子都具有偶极距，ELFEMF能改变这些分子的相对位置，也能使生物大分子所包含的原子集团或原子之间发生相对位移，这样就改变了生物大分子（如DNA或蛋白质）的构象和构型。ELFEMF还会改变电子和质子的传导特性，出现复电导率，还能引起细胞膜上离子通道的变化。此外，ELFEMF还可改变细胞固有的振动频率，由于细胞振动的频率比较低，接近ELFEMF的频率，可通过共振吸收原理，吸收外场的能量。射频电磁场（RADIOFREQUENCYFIELDS，RF）与ELFEMF相比，有一些不同的作用特点，如RF导致介质的极化状态和程度与ELF不同，这与频率相关，所以就造成了体内电磁效应的弛豫现象，即外加电磁波消失后，介质的极化状态总要滞后一段时间，才能“跟上”外电磁辐射的变化，这段滞后的时间称作弛豫时间。外加电磁辐射的频率越高，其取向过程需要的时间越长（即弛豫时间越长），这种变化造成了磁导率或介电常数随着外加电磁辐射的频率而改变。这种取向极化还与生物介质的性质有关，最终导致了介质的热效应，这是RF对生物作用的一个特点。这种极化可以引起具有偶极距的生物大分子构象的改变，使它们的偶极距偏向外场作取向运动。对于原来没有偶极距或有很小偶极距的分子，在外场的作用下，会使正负电荷原子或分子集团相对移动一段距离，造成正负电荷中心分离的增大，从而诱导出新的偶极距，或使原来的偶极距增大，导致离子和电子的极化。从而，也必将引起组织中的分子和原子集团等的构象和构型的改变，于是便造成了分子的生物功能和生物组织的电磁特性的改变，产生多种多样的生物学效应。以上是工频电磁场和射频电磁场产生生物学效应的物理机制，在此基础上，工频电磁场和射频电磁场可产生多种生物学效应，但由于每种电磁辐射的参数、暴露方式、作用对象、实验设计的不同，生物学效应也不尽相同。关于它们的生物学效应许多学者围绕“是否致癌”这一热点问题做了大量工作。流行病学和动物实验多是检测ELFEMF或RF是否提高了某种肿瘤发生率，或协同其它致癌因素提高了肿瘤发病率，离体实验多是检测ELFEMF或RF是否影响了与细胞恶性转化密切相关的细胞形态和生物学指标，但至今尚未得出确定性的结论。第四军医大学硕士学位论文13一、细胞的恶性转化1体外细胞恶性转化技术细胞恶性转化是指在体外一种或多种致癌因子的诱导下，细胞在形态、生长控制、行为或功能上获得某种肿瘤所具有的恶性特征或特性。利用这种暴露于致癌物后产生的由正常细胞转变为恶性细胞的可检测的表型，进行致癌物检测的技术，即体外细胞转化检测技术1。与动物实验相比，细胞体外转化实验不仅充分反应了细胞与致癌物的相互作用，还缩短了实验时间，减少了实验动物的使用。已有大量数据表明，该方法在致癌物检测上具有很高的灵敏度和特异性，其检测人类致癌物的敏感性可达到70802，因此被欧洲替代方法研究中心、国际癌症研究署等众多机构评价为一种有效筛选致癌物的方法3,4。HANAHAN和WEINBERG近期在CELL杂志上将肿瘤总结为十大典型特征5（1）维持细胞增殖的信号；（2）回避生长的抑制因子；（3）抵抗细胞的凋亡；（4）促进细胞的无限复制；（5）诱导血管生成；（6）侵袭和转移；（7）逃避免疫；（8）促进肿瘤的炎症；（9）细胞能量失控；（10）基因组不稳定和突变。从这十大特征可以看出细胞的恶性转化与细胞增殖、凋亡、迁移力等生物学特性的改变密切相关，正常细胞转化为恶性细胞以后，细胞形态会出现改变，比如细胞形态变的不规则，细胞核增大并出现异型性改变，核深染，核浆比升高，细胞排列紊乱，出现复层生长现象，这些标志性的变化均可在体外转化实验中检测出来。理论上，任何正常细胞系都可用来进行体外细胞诱导的转化，但受自发转化率、敏感性和稳定性等因素影响，目前得到普遍认可和使用的细胞系主要有BALB/C3T3、叙利亚金黄地鼠胚胎（SHE）和C3H/10T1/2细胞。这些细胞中，BALB/C3T3细胞因其较高的转化敏感性和稳定的自发转化率被广泛使用。另外，人眼晶状体上皮细胞株（SRA01/04）是对工频电磁场和射频电磁场都比较敏感的细胞6,7，也被用于此类实验。2细胞恶性转化过程在细胞恶性转化过程中，致癌物不能直接把正常细胞转化为癌细胞，MOOLGAVKAR等综合前人的研究结果以干细胞为例总结出了正常细胞恶性转化的过程8，见图2。第四军医大学硕士学位论文14注S正常干细胞I启动细胞N瘤细胞T终末细胞1第一次事件发生率2第二次事件发生率2中间干细胞分裂率2中间干细胞进入终末状态率图2细胞恶性转化的两阶段模型正常细胞转化为完全恶性细胞是一个复杂的过程，MOOLGAVKAR把细胞恶性转化过程分两个阶段，致癌物在第一阶段改变了部分正常干细胞的遗传物质，将它们变成了易于恶性转化的启动细胞（INITIATEDCELL），此时细胞增殖能力加强。在第二阶段，启动细胞可被致癌物作用或自身突变成为具有恶性特征的细胞（NEOPLASTICCELL），此时细胞可形成良性肿瘤，再经过演化阶段就能转化为完全瘤细胞并具有全部恶性表型（如侵袭性，转移能力，激素非依赖性），此时细胞形成的肿瘤就是恶性肿瘤。由于1、2与致癌物的剂量和时间有关，这也就解释了致癌物的剂量为什么能影响肿瘤发生率，也较好的解释了与年龄相关的肿瘤。这一模型常被用于研究肺癌与吸烟的关系，以及乳腺癌与激素、辐射以及遗传的关系。中间阶段的出现提示了在癌变过程中遗传物质首先出现改变。这一模型被大量实验室数据和人类遗传肿瘤的研究如成视网膜细胞瘤的研究9所证实。TERZAGHI等在研究大鼠支气管上皮细胞（RTE）恶性转化时发现，正常的未暴露致癌物的大鼠支气管上皮细胞原代培养后经过10次细胞倍增就会衰老变为终末细胞而死亡，而体内或体外暴露于致癌物的支气管上皮细胞就会无限增殖，如果按照一定密度将这些暴露致癌物后的细胞接种在平皿中进行克隆实验，810天后就会形成小的克隆，之后大部分细胞就会衰老死亡，仅0520的细胞克隆会继续增长，这些细胞称为EGV（ENHANCEDGROWTHVARIANTS），将EGV消化分离后继续接种进行克隆实验，发现一半数目的克隆变成永生细胞，称为IGVIMMORTALGROWTHVARIANTS，经第四军医大学硕士学位论文15过520次传代后这些永生化克隆细胞的3050又会变成恶性细胞，即NGV（NEOPLASTICGROWTHVARIANT）。有理由相信，EGV就是转化过程中的启动细胞，这种细胞接触的致癌物剂量越大，时间越久，其转化为恶性细胞的转化率（即2）也越高10,11，其它实验也发现了同样规律12,13。3细胞恶性转化机制31原癌基因和抑癌基因原癌基因是进化上高度保守，调控细胞增殖和生长的正常细胞基因，是机体正常生命活动必须的基因。当原癌基因的调控区或结构发生变异，基因产物出现量的变化或活性出现改变时，细胞就会过度增殖，形成肿瘤。原癌基因可分为SIS家族（编码生长因子），包括INT2、SIS等；ERB家族（编码生长因子受体），包括ERBB1、ERBB2、KIT、FMS、MAS、ROS等；SRC家族（编码酪氨酸蛋白激酶），包括SRC、YES、ABL、FGR、FES、LYN等；RAS家族编码小蛋白，包括HRAS、NRAS、KRAS等；RAF家族编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，包括MOS、RAF、PIM1、CRK等；MYC家族编码转录因子结合蛋白，包括MYC、JUN、FOS等1416。原癌基因的表达水平一般较低，而且受生长调节，它们的表达有以下特点细胞类型特异性；具有分化阶段特异性；细胞周期特异性。原癌基因突变后会变为致癌的癌基因，表达水平升高，表达次序发生紊乱，不再具有细胞周期特异性。抑癌基因激活时抑制细胞的增殖和迁移，起负性调控作用，生理情况下对细胞的生长、发育和分化起重要作用。当抑癌基因失活，或其产物失活时，调控细胞负性生长的信号消失，就可导致肿瘤的发生。现今已发现10多种抑癌基因，常见的抑癌基因包括P53、WT1、RB、APC、NF1、NF2、DCC等。其中P53基因是研究热点，它能抑制多种肿瘤的产生，一旦突变通常会促进癌变，它的突变出现在人类50左右的肿瘤中。它的变异常见于癌及癌前期损伤，这可能是散发及原位癌发生的重要原因17。抑癌基因可通过灭活癌蛋白、抑制细胞增殖、维护细胞间的联系和粘着来发挥作用。细胞的恶性转化主要是细胞由原癌基因的激活和抑癌基因的失活引起，基因突变、染色体移位、基因扩增和基因的插入均可导致抑癌基因的失活和原癌基因的激活，于是就造成了诱导细胞增殖的信号和限制细胞生长、诱导细胞衰老或分化的信号之间的失衡，细胞的周期失控，增殖加强，凋亡减少，从而导致细胞恶性转化，第四军医大学硕士学位论文16见图3。癌基因的致癌作用和抑癌基因的抑癌作用不是单个基因的行为，而是几个甚至许多基因表达共同协同的结果。图3细胞信号调控网络及肿瘤发生的相关主要蛋白32表观遗传学正常细胞在完全恶性转化的过程中除了基因的变化还存在表观遗传学的变化。在细胞恶性转化过程中环境因素和基因都会引起表观遗传学的变化。表观遗传学变化如DNA甲基化和组蛋白的后转录修饰与细胞恶性转化存在密切关系。早期关键的表观遗传学变化比细胞永生化发生早，这些变化与细胞越过周期检测点和端粒酶失功能同时发生。在细胞由永生化向完全恶性细胞转化过程中，表观遗传学机制使这一演化更加直接发生，而不像细胞永生化前逐步改变。实验证明DNA不连续区段的大量甲基化和组蛋白的修饰一起导致了长区段的表观遗传学沉默，这种表观学的损伤是癌变过程中普遍而重要的事件，在一系列人类肿瘤细胞系和临床肿瘤中都可发第四军医大学硕士学位论文17现1821。33细胞周期肿瘤是细胞周期性疾病，细胞周期失控，细胞过度增殖失控被认为是肿瘤发生的关键机制。细胞周期（CELLCYCLE）是指从一次细胞分裂结束开始，到下次细胞分裂结束为止的过程，DNA的合成和细胞分裂是细胞周期的两个主要事件。在细胞进化过程中，细胞建立并发展了一系列调控机制，用来确保细胞周期严格有序的交替和各时相依次有序变更。现已发现与细胞周期调控有关的分子有很多，大体上可分为3大类CYCLIN周期蛋白、CDK周期蛋白依赖性激酶、CKI周期蛋白依赖性激酶抑制剂，这些基因是细胞周期基因CELLDIVISIONCYCLEGENE,CDC，其中的CDKS是调控网络的中心，CYCLINS对CDKS进行正性调控，CKIS对CDKS进行负性调控，它们是细胞周期调控的分子基础。肿瘤是一种细胞周期调控机制受到破坏的渐进性疾病，因此对正常细胞周期调控机制和肿瘤细胞周期调控机制的重大发现，对认识肿瘤发生和演进、临床诊断与防治有特别重要的意义。CDKS是一类依赖CYCLIN的蛋白激酶，在细胞周期调控的网络中处于核心地位22，现今已发现7个成员，即CDK17，CDKS在细胞一个周期中的含量是稳定的，但在细胞周期不同时相中，有不同的CYCLINS集聚与对应的CDKS结合并被激活。CDK激活的底物主要包括E2F、PRB、P103和P107等，具有启动DNA合成、促进细胞周期各时相转变、增加细胞分裂、推进细胞周期运行的功能。个别CDK分子不参与细胞周期的调控，而是具有调控细胞的分化和凋亡的功能。CDK25参与细胞G1期向S期的转变，其中的CDK2和CDK4在肿瘤发生中的作用研究较多。CDK4是在细胞G1期运行的重要分子，某些肿瘤细胞株有CDK4基因的突变、扩增或高表达（如胃癌、乳腺癌、淋巴癌、头颈鳞癌等），当癌细胞被诱导分化时，CDK4表达下调，它的活性和稳定性也随之降低。CYCLINS的表达具有十分典型的时相特异性和周期性。细胞内外各种信号传导激活转录因子，各转录因子相互作用和转录因子与靶基因作用后，通过影响CYCLINS的表达水平然后作用于相应的CDK，从而对细胞周期进行调控。现今已发现哺乳动物的CYCLINS有9大类，包括CYCLINA、B1、2、C、D1、2、3和E等，其中对CYCLIND的研究比较深入，它有三个亚型。CYCLIND是细胞周期运行起始因子，也是生长因子的下游分子。一般处于G0期的细胞在生长因子的作用下，通过G蛋白RAS、第四军医大学硕士学位论文18MAPK有丝分裂原激活蛋白激酶等信号传导途径使得CYCLIND在G1期表达增加，CYCLIND与细胞中的CDK4与CDK6结合，通过CYCLINDCDK4/CDK6通路调节细胞越过G1期的限制点CHECKPOINT23,24，MOTOKURA等发现，CYCLIND在正常细胞的调控和癌变的过程中都发挥着重要作用，其高表达可激活CDK4和CDK6，缩短G1期，减少细胞增殖对有丝分裂原的依赖，引起细胞周期调节的失控和细胞的异常增殖，最终导致肿瘤的发生25。CKI是CDK的抑制剂，可阻止细胞通过CHECKPOINT限制点，具有抑癌基因的活性，不过与抑癌基因P53不同，CKI的作用原理是直接和CYCLINCDK复合物或CDK结合，调控细胞周期的进程。34细胞增殖细胞增殖失控是细胞恶性转化的机制之一。PCNA是癌症常见的肿瘤标记物，PCNA又称周期素，是分子量为36KD的核蛋白，是DNA聚合酶的辅助蛋白。1978年BLIYACHI实验组在用系统性红斑狼疮患者血清中的自身抗体进行免疫荧光染色时首次发现PCNA，因其出现于增殖期的细胞核中，所以称之为增殖细胞核抗原。PCNA的主要功能包括DNA聚合酶辅助蛋白DNA聚合酶是哺乳动物细胞DNA复制主要的聚合酶，PCNA作为其辅助蛋白直接参与了DNA复制，并确保DNA聚合酶在DNA复制过程中不会从DNA链上脱落。参与DNA损伤的修复当DNA发生损伤时，检验点的蛋白可检测到损伤并发出信号阻断细胞周期，PCNA可与检验点蛋白HUSL、RAD9相互作用，协调DNA损伤修复与周期阻滞两个功能的转换26。参与细胞周期的调控PCNA能和CYCLIN、CDK以及CKI相互作用，调节细胞周期各时期的转换27。与P21的相互作用P21是多个CDK的抑制因子，P21通过与PCNA结合和CDK/CYCLIN形成四聚体，从而抑制CDK的活性，对细胞周期起负性调控作用。在处于增殖状态的细胞周期中，PCNA的含量会发生明显变化，它在G0GL期几乎不表达，G1晚期其表达呈大幅度增加，S期达到顶峰，G2M期开始下降。它被广泛用于临床诊断，在包括乳腺癌、胃癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、鼻咽癌的多种肿瘤中，与癌症的分化、转移、浸润、复发以及预后有关。35细胞凋亡细胞凋亡又叫细胞程序性死亡，是受高度精密调节的、有序的走向死亡的过程。第四军医大学硕士学位论文19癌细胞是永生的细胞，癌症的发生不仅与细胞的异常增殖有关，也与异常的细胞凋亡有关。正常细胞的生长受到精密的调控，而癌细胞却具有无限生长的特性。研究发现，癌细胞的无限生长是癌细胞凋亡受到抑制的结果，所以凋亡障碍同癌症的发生发展有密切关系。凋亡是维持体内细胞数量平衡的关键要素，通过消除不健康的细胞发挥作用。细胞凋亡的诱因很多，如生长因子撤除、DNA的损伤、FASL和TNF作用、糖皮质激素的作用、细胞之间的接触等。细胞凋亡的机制很复杂，除涉及诸如凋亡因子、适配蛋白、受体、启动蛋白、效应蛋白、抑制蛋白等多种蛋白的相互作用外，还涉及内质网和线粒体。研究发现，细胞凋亡有2个主要的独立凋亡途径，一个是激活死亡受体途径，另一个是线粒体细胞色素C途径。抗凋亡因素的途径有BCL2家族，具有抑制凋亡作用的BCL2和BCLXL可抑制CASPASE3活性从而抑制凋亡28。高水平的BCL2蛋白可抑制细胞的死亡，延长细胞的寿命，是现今公认的抗凋亡因素，BCL2的存在有利于保持细胞的正常增殖能力，BCL2的异常表达在重度异型增生区及癌变区明显增加，使已发生癌变及有明显癌变倾向的细胞寿命得以延长和堆积，从而形成癌性瘤块。36DNA损伤与修复细胞的恶性转化还涉及到DNA的损伤与修复，当致癌物导致DNA损伤时，可引起体细胞基因表达的异常（调控细胞凋亡基因异常、促生长癌基因激活、肿瘤抑制基因失活等），从而引起正常调控蛋白功能的丧失，异常调控蛋白表达增高，最终转化为恶性细胞。损伤的DNA再次复制和分裂时可发生突变，DNA突变可激活癌基因或灭活抑癌基因，导致细胞周期的紊乱。电离辐射可直接引起DNA的损伤或通过氧化应激引起DNA的损伤，在DNA氧化损伤中，8羟基鸟嘌呤8HYDROXYGUANINE，OH8GUA的形成频率最高，具有很强的致突变能力，被公认为是细胞内氧化应激的指示剂，和癌症发生发展的关系也最密切，在癌症的发生发展中发挥重要作用29。大量研究证明，OH8GUA和ROS在癌症的发生发展中作用重大，结肠癌、肾癌、肺癌等组织比它们的癌旁正常组织含有更多的OH8GUA。现今8羟基鸟嘌呤糖苷酶（HOGG1）基因是研究最多和最透彻的修复酶基因，HOGG1基因杂合性的丢失发生在大部分的小细胞肺癌、约一半左右的肾癌、非小细胞肺癌和小部分头颈、胸部肿瘤。研究发现，HOGG1基因表位缺失一个，则增加细第四军医大学硕士学位论文20胞变异的机会，如果再缺失剩下的那一个，就会导致HOGG1活性丧失，再加上外源性和内源性的氧化应激产物的作用，细胞就会成为易致癌的危险状态30,31。37端粒酶目前认为，细胞永生化过程中受到的限制与细胞内染色体端粒的程序性缩短有关，端粒长度重复性减少到一定长度时，就会诱导DNA损伤信号，使细胞停止分裂32，端粒就像一个时钟控制着细胞分裂的次数33，缩短的端粒引起了细胞的衰老进而导致细胞死亡34。端粒酶是由RNA和相关蛋白组成，是逆转录酶，它以自身RNA为模板逆转录合成端粒重复序列，用来维持端粒长度。正常体细胞几乎无端粒酶活性，仅在生殖细胞和干细胞等个别细胞存在端粒酶的表达，然而大多数人的永生化细胞系以及各种人类癌症，如肺癌、头颈部肿瘤、宫颈癌、卵巢癌、胃癌、乳腺癌等癌组织中端粒酶的活性表达升高，大约8590的人类癌组织中端粒酶被激活，这就提示端粒酶的活性表达与癌症的发生发展密切相关35。YASUI实验组发现，端粒酶活性的表达与胃癌癌变的启动密切相关，提示细胞端粒酶的激活是癌变早期事件36。NAJJIAR等在观察人卵巢上皮细胞永生化的过程中发现，随着细胞逐步永生化，端粒酶活性也逐渐升高，进一步表明了端粒酶的活性表达在细胞永生化化过程中具有重要作用37。端粒酶可通过MYC途径激活，MYC基因的表达产物能直接激活端粒酶，其活性可达到肿瘤细胞中的水平38。HPV（人乳头状病毒）的感染和子宫颈癌的发生密切相关，HPV的病毒癌基因E6在癌症的发生中起重要作用，E6也是第一个被发现可以激活端粒酶的癌基因，最新研究表明，E6对端粒酶的激活至少是通过MYC途径实现的，E6可以在转录后调节MYC的表达。此外，APC/MYC途径和雌激素/受体途径也能激活端粒酶39,40。38其它机制研究表明，细胞的恶性转化还与MICRORNA41及离子通道42等有关，目前虽然对它们的研究取得了一定进展，但它们与肿瘤的关系研究领域中仍有许多重要问题尚待解决，彻底理清它们与细胞恶性转化的关系还需要很长时间。二、工频电磁场的致癌效应1流行病学研究存在争议首起工频电磁场（PFEMF）致癌的报告是1979年WERTHEIMER等人报道在电力第四军医大学硕士学位论文21线附近的儿童白血病发病率超过一般儿童的12倍43，此后，有关工频电磁场的致癌效应成为生物电磁学的一个研究热点。后来又有陆续报道暴露于高水平工频电磁场可使儿童患白血病的危险度明显提高，并存在剂量反应关系，即剂量越高，癌变的发生率就越大4448。工频电磁场职业暴露人员白血病、脑瘤、内分泌腺肿瘤的发生率也较高4952。基于上述研究结果，国际癌症研究机构IARC于2002年将PFEMF列为人类可疑致癌物。流行病学调查虽然提示工频电磁场与肿瘤的发生相关，但也有一些结果相反的报道5355，此外，受到客观条件和研究方法等限制5658，迄今为止，对工频电磁场是否致癌仍无法给出确定性的结论59。2实验研究21工频电磁场的遗传毒性许多在体和离体实验是通过检测工频电磁场有无遗传毒性来评估工频电磁场的致癌效应。工频电磁场暴露可单独造成DNA的损伤6063，也可协同其他因素增加DNA的损伤64，其中间歇性暴露更易造成DNA的损伤65，现在对DNA的损伤多归因于氧化损伤、自由基的作用66,67，同时工频电磁场还能抑制抗氧化酶的活性68，抑制DNA修复，使损伤更加严重。此外，工频电磁场还能造成染色体畸变（CA）、微核（MN）形成增多、姐妹染色单体互换（SCE）和基因突变6976。22工频电磁场对细胞缝隙连接GJIC的影响。GJIC是细胞之间约2NM长的进行细胞间物质交换的通讯通道，在细胞之间的相互交流的方式中，GJIC在维持细胞内稳态方面扮演着最重要角色77，正常细胞可通过它抑制接触的其它细胞的恶性表型的表达78，它与肿瘤的恶化程度相关，在促癌过程中起重要作用。研究发现，工频电磁场可抑制GJIC79,80。23对原癌基因的影响工频电磁场可提高原癌基因CFOS81,82、CJUN83和CMYC84的表达水平。这些原癌基因都是即刻表达基因，受到外界刺激后迅速并短暂激活，它们的激活不需新蛋白的合成，与延迟反应基因有着本质的区别，延迟反应基因的激活依赖即刻表达基因的表达产物。它们的高表达与多种癌症的发生有关，如CFOS与骨肉瘤等肿瘤的发生有密切关系，而CMYC与BURKITT淋巴瘤、早幼粒白血病、肺癌等肿瘤的发生有关，CJUN则与食管癌和肺癌的发生有关。第四军医大学硕士学位论文2224对细胞恶性转化相关的信号通路的影响工频电磁场能增强蛋白激酶C的活性85，蛋白激酶C是一类强有力的肿瘤促进剂（佛波脂）的细胞受体，工频电磁场可通过影响它的活性来加速癌变，此外，工频电磁场还可调节ERK1/2信号通路使细胞增殖加快86。25对细胞周期的影响肿瘤是细胞周期性疾病，是正常细胞在致癌因素作用下摆脱了机体对其生长控制，发生恶性转化所导致的一类疾病。几乎全部的癌基因效应都集中体现在细胞周期上。细胞周期的紊乱反映了转化细胞的恶性程度。细胞周期依次